專利名稱：胎盤多肽注射液的多肽含量測定方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及藥品的質(zhì)量檢測方法，特別是一種胎盤多肽注射液的多肽含量測定方 法。
背景技術(shù)：
胎盤在《本草綱目》上稱為紫河車，具有“安神養(yǎng)血、補氣、益精、解毒、補血的作用 的功效，久服者，耳聰目明，須發(fā)黑，延年益壽，有奪造化之”。紫河車作為藥用已有數(shù)百年 歷史，且在不斷延伸擴展。胎盤多肽注射液是以健康產(chǎn)婦的新鮮胎盤為原料，經(jīng)先進的生物 技術(shù)獲得的小容量生物制劑，含有多種營養(yǎng)素、生長因子及免疫因子等，這些大量的活性成 分幫助協(xié)調(diào)、提高自身免疫，增強新陳代謝，促進受損細胞和創(chuàng)傷的自我修復和愈合。具有 抗病毒、抗感染、抗過敏、抗突變、抗腫瘤、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等治療及預防保健作用。胎盤多肽注 射液不但在臨床上用于多種疾病的治療和預防，還廣泛用于醫(yī)學美容等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種胎盤多肽注射液的多肽含量測定方法， 該測定方法簡便、快速、準確率高，適用于大生產(chǎn)中對胎盤多肽注射液中多肽含量控制，從 而確保了胎盤多肽注射液的療效和臨床應用的安全性。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的胎盤多肽注射液的多肽含量測定方法，采用二辛可寧酸測 定法，以牛血清蛋白為對照制備對照品溶液，向?qū)φ掌啡芤褐屑尤攵康膲A性銅試液，測定 其吸光度，繪制標準曲線；按對照品溶液的方法制備胎盤多肽注射液的供試品溶液，并測定 其吸光度；通過標準曲線法測定胎盤多肽注射液中多肽的含量。牛血清蛋白的濃度為0. 15 0. 25mg/ml。配制堿性銅試液所用試藥包含二辛可寧酸，無水碳酸鈉，酒石酸鈉，氫氧化鈉，碳 酸氫鈉，硫酸銅以及純化水；配制方法為，將二辛可寧酸1. 8 2. 2g、無水碳酸鈉3. 2 3. 8g、酒石酸鈉0. 3 0. 35g、氫氧化鈉0. 6 1. 0g以及碳酸氫鈉1. 8 2. 0g分別加入到 175 185ml的純化水中溶解，得到混合溶液，用氫氧化鈉溶液或碳酸氫鈉調(diào)節(jié)混合溶液的 pH值至10. 75 11. 5，再加入純化水使混合溶液的總體積至190 210ml作為甲液；取硫 酸銅0. 8 1. 2g，并加入純化水溶解并稀釋至20 30ml，作為乙液；臨用前取50ml甲液和 lml乙液混勻，即得堿性銅試液。繪制標準曲線，精密量取牛血清蛋白對照品溶液0. 2,0. 4,0. 6,0. 8及1. 0ml,分 別放置在具塞試管中，各加入純化水至2. 0ml，再加入堿性銅試液4. 0ml混勻，在36. 5 37. 5°C的水浴中反應28 32min后，在常溫下冷卻至室溫，測定吸光度，同時以空白溶液作 對照，繪制標準曲線?？瞻兹芤旱闹苽錇?，將純化水2. 0ml及堿性銅試液4. 0ml混勻，并將其在36. 5 37. 5°C的水浴中反應28 32min后，在常溫下冷卻至室溫，即得到空白溶液。測定所用的吸收波長為562nm。
胎盤多肽注射液的取用量為2. 0ml。為了確保本發(fā)明含量測定方法科學、合理、可行，對其進行了一系列的試驗研究和 考察
一、儀器與試藥
1、儀器紫外分光儀(^"ih/^ )，水浴鍋(北京光明醫(yī)療器械廠)等。2、試藥胎盤多肽注射液(貴陽黔峰生物制品有限責任公司)，牛血清蛋白(& 公司)，二辛可寧酸公司)，無水碳酸鈉、酒石酸鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉和硫酸銅均為 國產(chǎn)分析純，純化水為自制。二、試驗方法及結(jié)果 1、堿性銅試液配制
取二辛可寧酸2. 0g、無水碳酸鈉3. 54g、酒石酸鈉0. 32g、氫氧化鈉0. 8g和碳酸氫鈉 1. 9g，分別將它們加入180ml純化水溶解，得到混合溶液，用氫氧化鈉溶液或碳酸氫鈉溶液 調(diào)節(jié)混合溶液的PH值至11. 25，加水至200ml作為甲液；取硫酸銅1. 0g加純化水溶解并稀 釋至25ml作為乙液。臨用前，取50ml甲液和lml乙液混勻，即得到試驗所需的堿性銅試液。2、對照品溶液的制備
精密稱取牛血清蛋白對照品10mg，置50ml量瓶中，加純化水適量，溶解，稀釋至刻度， 即得。3、標準曲線繪制及曲線方程
精密量取牛血清蛋白對照品溶液0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0ml，分別置于具塞試管中，各加 入純化水至2. 0ml，再加入堿性銅試液4. 0ml混勻，在37士0. 5°C水浴反應30士2min，在常溫 下冷卻至室溫，同時以空白溶液作對照，按分光光度法(中國藥典2005年版二部附錄IV A) 在562nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，對照品的量為橫坐標繪制標準曲線，并 求出標準曲線方程。4、含量測定
精密量取胎盤多肽注射液2. 0ml，照標準曲線的制備項下的方法，加入堿性銅試液 4. 0ml混勻，在37 士 0. 5°C水浴反應30 士 2min，在常溫下冷卻至室溫，在562nm的波長處測定 吸光度，自標準曲線或標準曲線方程中計算出胎盤多肽注射液的含量。5、線性關系考察
精密量取牛血清蛋白對照品溶液0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0ml，分別置具塞試管中，加純化 水至2. 0ml，再加入堿性銅試液4. 0ml混勻，37°C水浴準確反應30min，放冷至室溫，同時以 空白溶液作對照，照分光光度法(中國藥典2005年版二部附錄IV A)在562nm的波長處測 定吸光度，以吸光度(y)為縱坐標，對照品的量(x)為橫坐標，得回歸方程y = 3. 1073x + 0. 0306(r = 0.9997)。結(jié)果見表1和圖1，結(jié)果表明，牛血清蛋白在0. 0409 0. 2046mg范 圍內(nèi)線性關系良好。表1不同濃度對照品吸光度
精密量取同一批次(20071070)樣品各1ml于9支試管中，分別加入濃度為0. 2046mg/ ml的對照品0.6ml，加純化水0.4ml，制成回收樣品。按上述測定方法進行測定，計算，結(jié)果 見表5。 表5回收率實驗結(jié)果
6、精密度考察
精密量取牛血清蛋白對照品溶液(0. 2046mg/ml)0. 4ml，在上述條件下，重復測定5次， 記錄吸光度值，結(jié)果見表2，牛血清蛋白RSD為0. 11%，說明有良好的精密度。表2精密度考察結(jié)果
7、穩(wěn)定性考察
精密量取牛血清蛋白對照品溶液(0. 2046mg/ml)0. 4ml，在上述條件下，分別于第0、 60U20min進行測定，結(jié)果見表3，牛血清蛋白RSD為0. 71%，說明穩(wěn)定性良好。表3穩(wěn)定性考察結(jié)果
8、重復性試驗
取同一批胎盤多肽注射液(20011070) 5份，按上述測定方法進行測定，記錄吸光度值， 計算，結(jié)果見表4，胎盤多肽RSD為1. 08%，說明有良好的重現(xiàn)性。
表4重復性試驗結(jié)果
5
10、樣品含量測定
精密量取10批次胎盤多肽注射液各2ml，按上述測定方法進行測定，結(jié)果見表6。
表6胎盤多肽注射液含量測定結(jié)果
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明建立了胎盤多肽注射液的多肽含量測定方法，該方法采用 二辛可寧酸測定法，即以牛血清蛋白為對照品，采用標準曲線法對胎盤多肽注射液中的多 肽成分進行含量測定。該方法精密度高，根據(jù)上述的各項試驗結(jié)果中可以看出，本發(fā)明所選 用的堿性銅試液的各組分對胎盤多肽注射液的測試結(jié)果干擾性小，該堿性銅試劑明顯針對 胎盤多肽注射液的檢測具有專一性，整個測試的重現(xiàn)性好，準確度高，可有效測定胎盤多肽注射液的含量，從而確保其臨床用藥的有效性及安全性。


附圖1為牛血清蛋白線性關系。下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明進行進一步的說明。
具體實施例方式本發(fā)明的實施例1 胎盤多肽注射液的多肽含量測定方法，采用二辛可寧酸測定 法，取二辛可寧酸2. 0g、無水碳酸鈉3. 54g、酒石酸鈉0. 32g、氫氧化鈉0. 8g及碳酸氫鈉
1.9g，分別將它們加入180ml純化水中溶解，得到混合溶液，用氫氧化鈉溶液或碳酸氫鈉溶 液調(diào)節(jié)混合溶液的PH值至11. 25，加水至200ml作為甲液；取硫酸銅1. 0g加純化水溶解并 稀釋至25ml作為乙液；臨用前，取50ml甲液和1ml乙液混勻，得到堿性銅試液；精密稱取 牛血清蛋白對照品10mg，置50ml量瓶中，加入純化水使牛血清蛋白對照品溶解，稀釋至量 瓶的刻度，即制成濃度為0. 2mg/ml的牛血清蛋白對照品溶液；精密量取牛血清蛋白對照品 溶液0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0ml，分別置于具塞試管中，各加入純化水至2. 0ml ；分別向每個 具塞試管中加入4. 0ml的堿性銅試液混勻，在37士0. 5°C水浴反應30士2min，在常溫下冷卻 至室溫；同時用純化水至2. 0ml與堿性銅試液4. 0ml按上述步驟制成空白溶液作對照，按分 光光度法(中國藥典2005年版二部附錄IV A)在562nm的波長處測定吸光度，以吸光度為 縱坐標，對照品的量為橫坐標繪制標準曲線，求出標準曲線方程；精密量取胎盤多肽注射液
2.0ml，照標準曲線的制備項下的方法，加入堿性銅試液4. 0ml混勻，在37士0. 5°C水浴反應 30士2min，在常溫下冷卻至室溫，在562nm的波長處測定吸光度，自標準曲線或標準曲線方 程中計算出胎盤多肽注射液的含量。實施例2 胎盤多肽注射液的多肽含量測定方法，采用二辛可寧酸測定法，取二辛 可寧酸1. 8g、無水碳酸鈉3. 2g、酒石酸鈉0. 3g、氫氧化鈉0. 6g及碳酸氫鈉1. 8g，分別將它 們加入175ml的純化水中溶解，得到混合溶液，用氫氧化鈉溶液或碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)混合 溶液的PH值至10. 75，加純化水至190ml作為甲液；取硫酸銅0. 8g加純化水溶解并稀釋 至20ml作為乙液；臨用前，取50ml甲液和1ml乙液混勻，得到堿性銅試液；精密量取牛血 清蛋白對照品7. 5mg，置50ml量瓶中，加入純化水使牛血清蛋白對照品溶解，稀釋至量瓶的 刻度即制成濃度為0. 15mg/ml的牛血清蛋白對照品溶液；精密量取牛血清蛋白對照品溶液 0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0ml，分別置于具塞試管中，各加入純化水至2. 0ml ；分別向每個具塞 試管中加入4. 0ml的堿性銅試液混勻，在37士0. 5°C水浴反應30士2min，在常溫下冷卻至 室溫；同時用空白溶液作對照，按分光光度法(中國藥典2005年版二部附錄IV A)在562nm 的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，對照品的量為橫坐標繪制標準曲線，求出標準曲 線方程；精密量取胎盤多肽注射液2. 0ml，照標準曲線的制備項下的方法，加入堿性銅試液 4. 0ml混勻，在37 士 0. 5°C水浴反應30 士 2min，在常溫下冷卻至室溫，在562nm的波長處測定 吸光度，自標準曲線或標準曲線方程中計算出胎盤多肽注射液的含量。實施例3 胎盤多肽注射液的多肽含量測定方法，采用二辛可寧酸測定法，取二 辛可寧酸2. 2g、無水碳酸鈉3. 8g、酒石酸鈉0. 35g、氫氧化鈉1. 0g及碳酸氫鈉2. 0g，分別 將它們加入185ml的純化水中溶解，得到混合溶液，用氫氧化鈉溶液或碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)混合溶液的PH值至11. 5，加純化水至210ml作為甲液；取硫酸銅1. 2g加水溶解并稀釋至 30ml作為乙液；臨用前，取50ml甲液和1ml乙液混勻，得到堿性銅試液；精密量取牛血清 蛋白對照品12. 5mg，置50ml量瓶中，加入純化水使牛血清蛋白對照品溶解，稀釋至量瓶的 刻度即制成濃度為0. 25mg/ml的牛血清蛋白對照品溶液；精密量取牛血清蛋白對照品溶液 0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0ml，分別置于具塞試管中，各加入純化水至2. 0ml ；分別向每個具塞 試管中加入4. 0ml的堿性銅試液混勻，在37士0. 5°C水浴反應30士2min，在常溫下冷卻至 室溫；同時用空白溶液作對照，按分光光度法(中國藥典2005年版二部附錄IV A)在562nm 的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，對照品的量為橫坐標繪制標準曲線，求出標準曲 線方程；精密量取胎盤多肽注射液2. 0ml，照標準曲線的制備項下的方法，加入堿性銅試液 4. 0ml混勻，在37 士 0. 5°C水浴反應30 士 2min，在常溫下冷卻至室溫，在562nm的波長處測定 吸光度，自標準曲線或標準曲線方程中計算出胎盤多肽注射液的含量。
權(quán)利要求
一種胎盤多肽注射液的多肽含量測定方法，其特征在于采用二辛可寧酸測定法，以牛血清蛋白為對照制備對照品溶液，向?qū)φ掌啡芤褐屑尤攵康膲A性銅試液，測定其吸光度，繪制標準曲線；按對照品溶液的方法制備胎盤多肽注射液的供試品溶液，并測定其吸光度；通過標準曲線法測定胎盤多肽注射液中多肽的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胎盤多肽注射液的多肽含量測定方法，其特征在于牛血清 蛋白的濃度為0. 15 0. 25mg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胎盤多肽注射液的含量測定方法，其特征在于配制堿性銅 試液所用試藥包含二辛可寧酸，無水碳酸鈉，酒石酸鈉，氫氧化鈉，碳酸氫鈉，硫酸銅以及純 化水；配制方法為，將二辛可寧酸1. 8 2. 2g、無水碳酸鈉3. 2 3. 8g、酒石酸鈉0. 3 0. 35g、氫氧化鈉0. 6 1. 0g以及碳酸氫鈉1. 8 2. 0g分別加入到175 185ml的純化水 中溶解，得到混合溶液，用氫氧化鈉溶液或碳酸氫鈉調(diào)節(jié)混合溶液的PH值至10. 75 11. 5， 再加入純化水使混合溶液的總體積至190 210ml作為甲液；取硫酸銅0. 8 1. 2g，并加 入純化水溶解并稀釋至20 30ml，作為乙液；臨用前取50ml甲液和1ml乙液混勻，即得堿 性銅試液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胎盤多肽注射液的多肽含量測定方法，其特征在于繪制標 準曲線，精密量取牛血清蛋白對照品溶液0. 2,0. 4,0. 6,0. 8及1. 0ml，分別放置在具塞試管 中，各加入純化水至2. 0ml，再加入堿性銅試液4. 0ml混勻，在36. 5 37. 5°C的水浴中反應 28 32min后，在常溫下冷卻至室溫，測定吸光度，同時以空白溶液作對照，繪制標準曲線。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的胎盤多肽注射液的多肽含量測定方法，其特征在于空白溶 液的制備為，將純化水2. 0ml及堿性銅試液4. 0ml混勻，并將其在36. 5 37. 5°C的水浴中 反應28 32min后，在常溫下冷卻至室溫，即得到空白溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的胎盤多肽注射液的多肽含量測定方法，其特征在于測 定所用的吸收波長為562nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胎盤多肽注射液的多肽含量測定方法，其特征在于胎盤多 肽注射液的取用量為2. 0ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胎盤多肽注射液的多肽含量測定方法，采用二辛可寧酸測定法，以牛血清蛋白為對照制備對照品溶液，向?qū)φ掌啡芤褐屑尤攵康膲A性銅試液，測定其吸光度，繪制標準曲線；按對照品溶液的方法制備胎盤多肽注射液的供試品溶液，并測定其吸光度；通過標準曲線法測定胎盤多肽注射液中多肽的含量。該方法精密度高，選用的堿性銅試劑的各組分對胎盤多肽注射液的測試結(jié)果干擾性小，該堿性銅試劑明顯針對胎盤多肽注射液的檢測具有專一性，整個測試的重現(xiàn)性好，準確度高，可有效測定胎盤多肽注射液的含量，從而確保其臨床用藥的有效性及安全性。
文檔編號G01N33/68GK101893638SQ201010245588
公開日2010年11月24日 申請日期2010年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月5日
發(fā)明者劉智, 張秋生, 沈國華, 高翔 申請人:貴州益康制藥有限公司