專利名稱：快速檢測麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條及其制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測赤潮毒素的檢測器具，特別是涉及一種麻痹性貝毒 (ParalyticShellfish Poisoning, PSP)的快速檢測試紙條，另外還涉及其制法。
背景技術(shù)：
赤潮災(zāi)害日益嚴(yán)重，已成為一種全球性的海洋生態(tài)災(zāi)害。麻痹性貝毒 (ParalyticShellfish Poisoning, PSP)是我國近岸海域最常見的赤潮生物毒素或貝毒之一，在近岸海域貝類體內(nèi)經(jīng)常檢出。Alexandrium tamarense等多種藻可以產(chǎn)生麻痹性貝毒。麻痹性貝毒(PSP)是一類具有四氫嘌呤結(jié)構(gòu)的化合物，呈堿性，易溶于水，在弱酸和低溫條件下比較穩(wěn)定，堿性條件下發(fā)生氧化?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)此類化合物有20多種，根據(jù)R4基團(tuán)的不同可以分為四類，分別是①胺基甲酸酯類毒素(Carbamate toxins)，包括石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)，新石房蛤毒素(neosaxiton，neoSTX)，膝溝藻毒素 GTX1、GTX2、GTX3、 GTX4 ；② N-磺酰胺甲?；惗舅?N-sulfocarbamoyl toxins)，包括 GTX5 (Bi)、GTX6 (B2)、 Cl、C2、C3 和 C4 ；③脫胺甲酰基類毒素(decarbamoyl toxins)，包括 dcSTX、dcneoSTX、 dcGTXl、dcGTX2、dcGTX3、dcGTX4 ；④脫氧胺甲?；惗舅?deoxydecarbamoyl toxins)，包括 doSTX、doGTXldoGTX2。在這些化合物中，STX、neoSTX、GTXl、GTX2、GTX3、GTX4 的毒性較大；dcSTX、dcneoSTX、dcGTXl、dcGTX2、dcGTX3、dcGTX4 毒性較??；GTX5 (Bi)、GTX6 (B2)、Cl、 C2、C3和C4毒性最小。麻痹性貝毒在全世界沿海都有分布，因赤潮生物種類及其地理分布不同，主要成分也不同，在溫帶海域最常見的毒素是GTX2、GTX3和STX，我國南方海域麻痹性赤潮毒素組份與此相似。麻痹性貝毒可在濾食性貝類體內(nèi)大量積累，貝類被人類食用后， 會導(dǎo)致中毒，使人四肢面部肌肉麻痹、頭痛惡心，甚至窒息死亡。這類毒素主要作用于神經(jīng)細(xì)胞和肌肉細(xì)胞的鈉離子通道，阻斷鈉離子內(nèi)流，妨礙動作電位的形成，因此表現(xiàn)出神經(jīng)中毒的特征。麻痹性貝毒是危害最大的海洋生物毒素，因此目前極受關(guān)注。目前國際上普遍使用的麻痹性貝毒分析方法是生物小鼠法，用鹽酸在高溫下提取藻類或貝體中的麻痹性毒素，然后對小鼠進(jìn)行腹腔注射，根據(jù)小鼠的死亡時間判斷毒性大小。小鼠法簡便易行，適合于大規(guī)模、批量樣品的檢測，該法的缺點是不能區(qū)別毒素的種類和結(jié)構(gòu)、干擾大、不精確?，F(xiàn)在被廣泛接受且較為完善的高效液相色譜衍生熒光分析方法在許多國家使用，可以準(zhǔn)確分析確定毒素的含量和結(jié)構(gòu)，檢測限可低至ng/g，缺點是樣品前處理繁瑣費時，儀器昂貴，對操作人員的技術(shù)要求較高，嚴(yán)重的阻礙了這種分析方法的普及推廣，更無法實現(xiàn)現(xiàn)場檢測。 免疫化學(xué)方法是利用抗體對抗原的特異性結(jié)合建立的分析方法，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)， 儀器設(shè)備簡單易操作、樣品前處理相對簡單等優(yōu)點，適用于一定條件下的現(xiàn)場監(jiān)測和大量樣本快速篩查；目前德國、日本等公司生產(chǎn)的ELISA檢測PSP的試劑盒，是以競爭性酶聯(lián)免疫反應(yīng)為檢測原理，檢測全過程需2-4小時，可一次檢測多個樣品，即可定性又可定量，但存在假陽性問題；由于ELISA是一種很敏感的技術(shù)，分析結(jié)果的變異性較大，不同分析人員的結(jié)果有差異，結(jié)果判斷往往需要有經(jīng)驗的操作人員，容易發(fā)生誤檢和漏檢，同時麻痹性貝毒組分化學(xué)結(jié)構(gòu)較多，各異構(gòu)體之間也存在一定的抗原性差異，且檢測時間也比較長，實現(xiàn)真正的野外現(xiàn)場操作有困難。近年來，我國每年均有在貝中檢測出麻痹性貝毒的報道，而且時有中毒甚至死亡的事件發(fā)生，已嚴(yán)重影響了貝類出口貿(mào)易，引起了各級政府及研究領(lǐng)域的極大關(guān)注。建立麻痹性貝毒的快速靈敏準(zhǔn)確的檢測方法和產(chǎn)品，對確保海產(chǎn)品食用安全和維持水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)健康可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述麻痹性貝毒檢測技術(shù)的不足，提供一種特異、敏感和簡便的快速檢測麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條；研制靈敏的抗麻痹性貝毒抗體，用膠體金標(biāo)記抗體，通過競爭免疫反應(yīng)，快速檢測貝類中的麻痹性貝毒；簡單易操作，快速，不需任何其他儀器設(shè)備，非專業(yè)人員可現(xiàn)場使用，產(chǎn)品性能穩(wěn)定。本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是一種快速檢測麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條，包括樣本墊、膠金墊、賽多利斯NC膜、吸水墊和PVC背襯；其具體結(jié)構(gòu)是在PVC 背襯上按順序依次粘附有樣本墊、膠金墊、賽多利斯NC膜、吸水墊，膠金墊上包被有膠體金標(biāo)記的抗麻痹性貝毒單克隆抗體，賽多利斯NC膜上分別包被有石房蛤毒素STX與蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線和羊抗鼠抗體(多抗或單抗)構(gòu)成的質(zhì)控線。所述抗麻痹性貝毒單克隆抗體為用石房蛤毒素-血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物免疫Balb/C小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，篩選得到抗麻痹性貝毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系分泌的。所述樣本墊、膠金墊、NC膜、吸水墊按順序依次粘附在PVC背襯上并裝在試紙條卡里，上面開有加樣孔和顯色區(qū)。所述試紙條為檢測麻痹性貝毒主要成分STX、dcSTX、GTX5.GTX2/3, dcGTX2/3、Cl/ C2的試紙條。所述快速檢測麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條的制法，其步驟包括1、將石房蛤毒素STX與載體蛋白偶聯(lián)，制備得到STX-載體蛋白偶聯(lián)物；2、用STX-血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物免疫Balb/C小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，篩選得到分泌抗麻痹性貝毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系；3、制備抗麻痹性貝毒單克隆抗體；4、用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；5、將步驟3制得的抗麻痹性貝毒單克隆抗體加入步驟4制備得到的膠體金中，得到抗麻痹性貝毒單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；6、將抗麻痹性貝毒單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物噴點(包被)在膠金墊上；7、將STX-牛血清蛋白偶聯(lián)物噴點(包被)在NC膜上構(gòu)成檢測線，并將羊抗鼠多抗(或單抗)噴點(包被)在NC膜上構(gòu)成質(zhì)控線。8、將樣本墊、膠金墊、NC膜、吸水墊按順序依次粘附在PVC背襯上，并包裝在試紙條卡里，上面開有加樣孔和顯色區(qū)，得到檢測麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條。所述快速檢測麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條在檢測麻痹性貝毒中的應(yīng)用。本發(fā)明借助膠體金標(biāo)記顯色的免疫層析反應(yīng)，用以制備快速檢測麻痹性貝毒9種主要成分的免疫膠體金試紙條，結(jié)構(gòu)更加合理，應(yīng)用膠體金標(biāo)記抗麻痹性貝毒單克隆抗體， 選用石房蛤毒素STX-載體蛋白偶聯(lián)物作為檢測線，建立競爭免疫層析快速檢測待測樣品中是否含有麻痹性貝毒。通過待檢樣品中的麻痹性貝毒與包被于NC膜上的STX-載體蛋白偶聯(lián)物共同競爭抗麻痹性貝毒單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，在檢測線處出現(xiàn)深淺不同的紅色條帶或不出現(xiàn)條帶，質(zhì)控線處出現(xiàn)紅色條帶。若待測樣品試紙條檢測線無色，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶則判斷為陽性樣品，即待測樣品中麻痹性貝毒的濃度高于llOng/mL ；若待測樣品試紙條檢測線有紅色出現(xiàn)，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶則判斷為陰性樣品，即待測樣品中麻痹性貝毒的濃度小于llOng/mL ；如果質(zhì)控線上沒有出現(xiàn)紅色條帶，則該試紙條失效。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點1、本發(fā)明的檢測麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條，具有特異性強(qiáng)，檢測靈敏度高 (可達(dá)llOng/mL)，檢測快速(只需15min)，前處理簡單等優(yōu)點；2、本發(fā)明的試紙條不需任何儀器設(shè)備，攜帶方便，檢測成本低；3、本發(fā)明的試紙條操作簡單易掌握，無需專業(yè)人員操作；4、本發(fā)明的試紙條儲存方便，穩(wěn)定性好，在室溫下至少可保存六個月；5、本發(fā)明的試紙條檢測結(jié)果準(zhǔn)確性高，精度高。


圖1為本發(fā)明檢測試紙條結(jié)構(gòu)示意中1為樣品墊，2為膠金墊，3為賽多利斯NC膜，4為吸水墊，5為PVC背襯，6為檢測線，7為質(zhì)控線，8為試紙條卡，9為加樣孔，10為顯色區(qū)圖2為本發(fā)明的檢測試紙條結(jié)果判定示意中A為陰性標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果，B為陰性樣品結(jié)果，C、D為陽性樣品結(jié)果，E、F為試紙條失效
具體實施例方式實施例1 (制備實施例)檢測麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條制備方法1、石房蛤毒素-載體蛋白偶聯(lián)物的制備將石房蛤毒素(STX)溶于0.002M的乙酸鈉緩沖液中，加入溶于磷酸鹽緩沖液 (ρΗ7. 0)的血藍(lán)蛋白(KLH)或牛血清蛋白(BSA)及少量甲醛，25°C反應(yīng)72小時，再4°C過夜。 將反應(yīng)混合物透析3d，40C，每1 換液1次。制備得到STX-KLH和STX-BSA偶聯(lián)物備用。2、抗麻痹性貝毒單克隆抗體的制備利用制備的石房蛤毒素-血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物(STX-KLH)作為免疫原，免疫6 8周齡的雌性BALB/c小鼠。首次免疫用150 μ g STX-KLH與等體積完全弗氏佐劑，充分乳化后， 腹腔注射小鼠，第3、5、7、9、11周取同量STX-KLH與等體積不完全弗氏佐劑充分乳化，腹腔注射。取尾血測定小鼠血清效價，待效價大于要求值后，用同量STX-KLH的PBS溶液腹腔注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，三天后取脾細(xì)胞融合。取生長狀態(tài)良好的骨髓瘤SP2/0細(xì)胞與免疫的小鼠脾細(xì)胞按1 8的比例混合， 加入PEG進(jìn)行細(xì)胞融合。融合后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在15%血清的HAT培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，7-10天后換HT培養(yǎng)液，取細(xì)胞培養(yǎng)液上清ELISA檢測。選取陽性細(xì)胞孔，用有限稀釋法克隆，篩選可穩(wěn)定分泌抗麻痹性貝毒(PSP)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。取8周齡健康BALB/c雌性小鼠或雜交一代鼠，腹腔注射液體石蠟0. 5mL/每只，待用。1500r/min 離心收集對數(shù)生長期的陽性雜交瘤細(xì)胞，懸浮于生理鹽水中，濃度為106/mL。在石蠟油處理的小鼠腹腔內(nèi)注射0. 5mL雜交瘤細(xì)胞懸液誘生腹水，收集腹水，3000r/min離心lOmin，收集上清液即為含單克隆抗體腹水。腹水用辛酸硫酸氨方法得到粗制抗體蛋白，再用0. OlM的 PBS緩沖液(pH7. 4)透析3天。取出用紫外分光光度計測得蛋白濃度為2. 7mg/mL。3、抗麻痹性貝毒單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備及包被膠金墊用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；取40nm的膠體金于干凈的燒杯中，用 IM的K2CO3調(diào)節(jié)其pH值為8. 2，加入抗麻痹性貝毒單克隆抗體，使其在膠體金中終濃度為 13 μ g/mL,攪拌lh，加入膠體金1/10體積的10% BSA溶液，攪拌30min，5000rpm離心30min， 取沉淀，用0. OlM的PBS緩沖液復(fù)溶，用噴點儀包被到經(jīng)預(yù)處理的膠金墊上。真空干燥備用。4、偶聯(lián)抗原包被NC膜石房蛤毒素-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原用0. OlM的PBS緩沖液稀釋4倍，包被到經(jīng)預(yù)處理的NC膜上。37°C干燥1小時備用。并將羊抗鼠多抗(或單抗)包被在NC膜上構(gòu)成質(zhì)控線。5、試紙條的組裝將處理好的樣本墊、包被有抗麻痹性貝毒單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的膠金墊、 包被有石房蛤毒素-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原作為檢測線和包被有羊抗鼠抗體作為質(zhì)控線的 NC膜、吸水墊按順序依次粘附在PVC背襯上，安裝在試紙條卡里，上面開有加樣孔和顯色區(qū)。陽性llOng/mL完全抑制，無條帶出現(xiàn)；加樣量為80 μ 1/孔；判斷時間為15min ；最低檢測限為小于llOng/mL。真空封裝，常溫保存，有效期至少6個月。實施例2 (應(yīng)用實施例)檢測麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條使用方法1、貝類等樣品的預(yù)處理稱取貝類勻漿3g，加3ml (稀HCL稀，pH = 4)，攪勻，煮沸5min, 3000r/min離心 lOmin，取上清液進(jìn)行分析。2、檢測上述的貝類萃取液，用微量移液槍取SOyL于加樣孔中，放置15min觀察顯色情況。同時分別取80 μ 1 0. OlM PBS和80 μ L 110ng/mL的石房蛤毒素STX標(biāo)準(zhǔn)溶液于另兩個試紙條的加樣孔中，做陰性空白和陽性標(biāo)準(zhǔn)品對照實驗。3、結(jié)果判定如圖2所示，若待測樣品試紙條檢測線顏色比陰性空白試紙條檢測線顏色淺，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，則判斷為陽性樣品，即樣品中麻痹性貝毒的濃度小于llOng/mL ； 若待測樣品試紙條檢測線無顏色，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，則判斷為陽性樣品，即樣品中麻痹性貝毒的濃度大于或等于llOng/mL ；若待測樣品試紙條檢測線顏色與陰性空白試紙條檢測線顏色一致，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，則判斷為陰性樣品，即樣品中不含麻痹性貝毒；若質(zhì)控線上無顏色，則該試紙條失效。實施例3 (應(yīng)用實施例)檢測麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條的應(yīng)用
樣品中的麻痹性貝毒模擬檢測實驗分別向貝肉中添加麻痹性貝毒石房蛤毒素標(biāo)準(zhǔn)品，按實施例2制成Ong/ml、 200ng/ml和llOng/ml的樣品待測液，以及3個陰性樣品和12個陽性樣品(小白鼠生物法)，并按實施例2所述方法，用本發(fā)明試紙條對Ong/ml、200ng/ml和llOng/ml的樣品檢測，重復(fù)實驗3次，結(jié)果顯示Ong/ml樣品的試紙條檢測線與陰性空白檢測線顏色一致，同時質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶，判斷為陰性樣品；而200ng/ml和llOng/ml的樣品的試紙條檢測線無顏色或顏色極淺(大于30min)，同時質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶，判斷為陽性樣品。對于生物小鼠法檢測的3個陰性樣品和12個陽性樣品，按實施例2分析，結(jié)果與小鼠法結(jié)果一致。說明本發(fā)明試紙條可以用來檢測貝類樣品。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條，包括樣本墊、膠金墊、賽多利斯NC 膜、吸水紙和PVC背襯，其特征是在PVC背襯上按順序依次粘附有樣本墊、膠金墊、賽多利斯NC膜、吸水墊，膠金墊為包被抗麻痹性貝毒單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的膠金墊，賽多利斯NC膜上分別包被石房蛤毒素-蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線和羊抗鼠抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條，其特征是 抗麻痹性貝毒單克隆抗體為用石房蛤毒素-血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物免疫Balb/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，篩選得到抗麻痹性貝毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系分泌的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種快速檢測麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條，其特征是樣本墊、膠金墊、NC膜、吸水墊按順序依次粘附在PVC背襯上并裝在試紙條卡里，上面開有加樣孔和顯色區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種快速檢測麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條，其特征是其為檢測麻痹性貝毒的試紙條。
5.一種快速檢測麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條的制備方法，其步驟包括(1)將石房蛤毒素與載體蛋白偶聯(lián)，制備得到石房蛤毒素-載體蛋白偶聯(lián)物；(2)用石房蛤毒素-血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物免疫Balb/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，篩選得到分泌抗麻痹性貝毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系；(3)制備抗麻痹性貝毒單克隆抗體；(4)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；(5)將步驟C3)制得的抗麻痹性貝毒單克隆抗體加入步驟(4)制備得到的膠體金中，得到抗麻痹性貝毒單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；(6)將抗麻痹性貝毒單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物噴點(包被)在膠金墊上；(7)將石房蛤毒素-牛血清蛋白偶聯(lián)物噴點(包被)在NC膜上構(gòu)成檢測線，并將羊抗鼠抗體噴點(包被)在NC膜上構(gòu)成質(zhì)控線；(8)將樣本墊、膠金墊、NC膜、吸水墊按順序依次粘附在PVC背襯上，并包裝在試紙條卡里，上面開有加樣孔和顯色區(qū)，得到所述的檢測麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條。
6.快速檢測麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條在檢測麻痹性貝毒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測赤潮毒素的檢測器具。一種快速檢測麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條，包括樣本墊、膠金墊、賽多利斯NC膜、吸水墊和PVC背襯；其具體結(jié)構(gòu)是在PVC背襯上按順序依次粘附有樣本墊、膠金墊、賽多利斯NC膜、吸水墊，膠金墊上包被有膠體金標(biāo)記的抗麻痹性貝毒單克隆抗體，賽多利斯NC膜上分別包被有石房蛤毒素與牛血清蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線和羊抗鼠抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。本發(fā)明試紙條具有特異性強(qiáng)，檢測靈敏度高，檢測快速，前處理簡單等優(yōu)點，不需任何儀器設(shè)備，攜帶方便，檢測成本低，操作簡單易掌握，無需專業(yè)人員操作；試紙條儲存方便，穩(wěn)定性好，在室溫下至少可保存六個月；檢測結(jié)果準(zhǔn)確性高，精度高。
文檔編號G01N33/531GK102346189SQ20101024571
公開日2012年2月8日 申請日期2010年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月1日
發(fā)明者劉仁沿, 劉磊, 梁玉波, 許道艷 申請人:國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心