專利名稱：富集肺癌細(xì)胞復(fù)合納米微球的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于高分子化學(xué)和細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種結(jié)合肺癌細(xì)胞的復(fù)合 Fe3O4磁性納米顆粒及其制備方法，以及一種富集和檢測(cè)痰液中肺癌細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
肺癌居十大惡性腫瘤之首，具有“三高”現(xiàn)象發(fā)病率高、死亡率高、上升幅度高； 是影響人類健康的主要疾病，與愛(ài)滋病并列成為21世紀(jì)主要醫(yī)學(xué)問(wèn)題之一。憑借目前診斷肺癌的手段，一旦發(fā)現(xiàn)和確診是肺癌，基本上處于中晚期，尚難以獲得有效的控制。因此，實(shí)現(xiàn)肺癌的早期診斷是實(shí)現(xiàn)早期治療的長(zhǎng)期未能破解的國(guó)際醫(yī)學(xué)難題。痰液細(xì)胞病理學(xué)檢查是目前極有希望開(kāi)發(fā)推廣為早期診斷肺癌的最有效的方法。 目前存在的最主要問(wèn)題是1、痰液送檢費(fèi)時(shí)費(fèi)力；2、假陰性率高QO 40% )，原因在于 痰液制片手工操作而導(dǎo)致細(xì)胞丟失(標(biāo)本不能全部取用)、涂片的質(zhì)量太差(不均勻、過(guò)厚， 過(guò)多的黏液、血液或炎細(xì)胞遮蓋了不正常的細(xì)胞、細(xì)胞形態(tài)保存不佳)，細(xì)胞成分復(fù)雜(大量脫落上皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞)，脫落肺癌細(xì)胞散在，分布不均。所以，必須去除無(wú)關(guān)細(xì)胞，才能做到低成本地連續(xù)檢測(cè)，大幅度提高陽(yáng)性率。因此， 肺癌細(xì)胞分離富集是實(shí)現(xiàn)肺癌早期診斷這個(gè)國(guó)際性難題首先要解決的問(wèn)題。如果能夠?qū)ふ业揭环N比較簡(jiǎn)便實(shí)用的方法將肺癌細(xì)胞從痰液中分離出來(lái)富集，早期治療肺癌就有希望。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題就是針對(duì)痰液中細(xì)胞成分復(fù)雜，檢測(cè)痰液中肺癌脫落細(xì)胞假陰性率高的缺陷，提供一種結(jié)合肺癌細(xì)胞的復(fù)合狗304磁性納米顆粒及其制備方法，和一種檢測(cè)痰液中肺癌細(xì)胞的方法。該方法檢測(cè)痰液中肺癌細(xì)胞具有較高的陽(yáng)性率。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之一是一種結(jié)合肺癌細(xì)胞的復(fù)合 !^e3O4磁性納米顆粒，其是在表面修飾著聚乙酰亞胺，并標(biāo)記有對(duì)肺癌細(xì)胞具有結(jié)合能力的復(fù)合蛋白的狗304磁性納米顆粒，其中，所述的對(duì)肺癌細(xì)胞具有結(jié)合能力的復(fù)合蛋白是由蛋白SPA(葡萄球菌A蛋白)和選自抗CD44抗體和抗CK7抗體中的一種或兩種組成的復(fù)合蛋白。所述的抗⑶44抗體優(yōu)選兔抗人⑶44，抗CK7抗體優(yōu)選兔抗人CK7。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之二是一種如上所述的結(jié)合肺癌細(xì)胞的復(fù)合狗304磁性納米顆粒的制備方法，包括以下步驟1)制備!^e3O4磁性納米顆粒；2)在步驟1)所得的!^e3O4磁性納米顆粒表面修飾聚乙酰亞胺；3)在步驟2、所得的聚乙酰亞胺修飾的!^e3O4磁性納米顆粒表面標(biāo)記對(duì)肺癌細(xì)胞具有結(jié)合能力的復(fù)合蛋白，該復(fù)合蛋白是由蛋白SPA和選自抗CD44抗體和抗CK7抗體中的一種或兩種組成的復(fù)合蛋白。本發(fā)明中，步驟1)制備!^e3O4磁性納米顆粒的方法可以本領(lǐng)域常規(guī)方法，較佳的采用共沉淀法。更佳的步驟1)具體包括將硝酸鐵和硝酸亞鐵以摩爾質(zhì)量比為4 1的比例于乙醇中形成分散均勻的乙醇溶液，其中鐵離子濃度為0. 5 1. Omol/L ；在制得的乙醇溶液中加入摩爾質(zhì)量10倍于鐵離子的環(huán)氧氯丙烷形成溶膠，靜置后形成凝膠；制得的凝膠經(jīng)陳化后用去離子水清洗并干燥；清洗并干燥后的凝膠進(jìn)行400°C下退火處理即制得!^e3O4 沉淀；將制得的!^e3O4沉淀依次用去離子水和乙醇交替清洗，至pH值為中性，真空干燥，即得!^e3O4磁性納米顆粒。步驟1)所述的!^e3O4磁性納米顆粒的平均粒徑范圍較佳的是15 50nm，更佳的是20nm。本發(fā)明中，步驟幻在!^e3O4磁性納米顆粒表面修飾聚乙酰亞胺的方法可以采用現(xiàn)有技術(shù)，較佳的，步驟2、具體包括將!^e3O4磁性納米顆粒置于PBS緩沖溶液中，超聲分散， 緩慢加入聚乙酰亞胺(PEI)，慢速充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，移至恒溫水浴上繼續(xù)慢速攪拌M小時(shí)， 水浴溫度保持30°C ；用磁分離法將固體從溶液中分離，將固體依次用蒸餾水和甲醇交替清洗至PH值為中性，真空干燥，即得PEI修飾的!^e3O4納米粒子。本發(fā)明中，較佳的，步驟幻具體包括將聚乙酰亞胺修飾的!^e3O4納米粒子懸浮于 0. OlM pH7. 2TBS之中，得納米粒子溶液，其中聚乙酰亞胺修飾的!^e3O4納米粒子的濃度約為 3 X IO13個(gè)/ml ；用0. OlM pH7. 2TBS分別溶解蛋白A和蛋白B,混勻，4°C反應(yīng)30分鐘，即得復(fù)合蛋白溶液，其中，蛋白A濃度為10mg/ml，蛋白B濃度為lmg/ml，蛋白A是蛋白SPA，蛋白 B是抗CD44抗體和/或抗CK7抗體，優(yōu)選兔抗人CD44和/或兔抗人CK7 ；將上述復(fù)合蛋白溶液與上述納米粒子溶液均勻混合，室溫60分鐘，即得復(fù)合納米磁性顆粒溶液。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之三是一種富集痰液中肺癌細(xì)胞的方法，包括以下步驟a)采集痰液，充分液化痰液；b)在步驟a)所得的液化痰液中加入所述的復(fù)合納米磁性顆粒溶液進(jìn)行反應(yīng)；c)將步驟b)的反應(yīng)液離心富集其中的細(xì)胞。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之四是一種檢測(cè)痰液中肺癌細(xì)胞的方法，包括以下步驟a)采集痰液，充分液化痰液；b)在步驟a)所得的液化痰液中加入所述的復(fù)合納米磁性顆粒溶液進(jìn)行反應(yīng)；c)將步驟b)的反應(yīng)液離心富集其中的細(xì)胞，將所得細(xì)胞重新懸浮，然后采用液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)將該懸浮液制片、染色、封片、鏡檢。本發(fā)明中，步驟a)中采集和液化痰液的方法是本領(lǐng)域常規(guī)方法。較佳的，痰液中加入堿性裂解液以充分液化痰液，所述的堿性裂解液優(yōu)選丨^蛋白酶！^，川^ NaOH的水溶液。本發(fā)明中，步驟b)所述的反應(yīng)優(yōu)選室溫靜置15分鐘。本發(fā)明中，步驟c)離心富集細(xì)胞的方法是常規(guī)方法，所述的離心優(yōu)選500rpm，5分鐘；離心所得的細(xì)胞優(yōu)選懸浮在保存液中，保存液優(yōu)選10%甲醇水溶液。本發(fā)明中，上述優(yōu)選條件在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。本發(fā)明除特別說(shuō)明之外，所用的百分比都是質(zhì)量百分比。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說(shuō)明之外，均市售可得。本發(fā)明中所述的“室溫”是指試驗(yàn)操作間的溫度，一般為25V。
相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明采用聚乙酰亞胺(PEI)對(duì)高磁性能狗304納米顆粒表面進(jìn)行氨基化處理，使聚乙酰亞胺上的亞甲基與鐵配位，并通過(guò)調(diào)節(jié) PH值和溫度，使聚乙酰亞胺牢固與!^e3O4納米顆粒相連接。該材料可以很好的分散于水溶液中，并且具有良好的生物相容性和順磁性。為了提高結(jié)合肺癌細(xì)胞的能力，又標(biāo)記了能結(jié)合肺癌細(xì)胞的復(fù)合蛋白，不僅有效地降低了成本，而且明顯地提高了富集肺癌細(xì)胞的效率。 該復(fù)合I^e3O4納米顆粒具有富集、分離痰液體系中肺癌細(xì)胞的功能，集成液基細(xì)胞病理學(xué)方法，提高了痰液中肺癌細(xì)胞檢測(cè)的可靠性和準(zhǔn)確性。檢測(cè)痰液中肺癌細(xì)胞的陽(yáng)性率比常規(guī)方法提高了 30%以上。并且增加了檢測(cè)樣本量，減少了被測(cè)者的往返，檢測(cè)效率明顯提高， 而且費(fèi)用有所降低，適合于體檢、普查。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1是聚乙烯亞胺包覆的納米四氧化三鐵納米粒子。圖2是復(fù)合納米顆粒附著于肺癌脫落細(xì)胞表面。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1 Fii3O4納米顆粒的制備1)將硝酸鐵和硝酸亞鐵以摩爾質(zhì)量比為4 1的比例于乙醇中形成分散均勻的乙醇溶液，其中鐵離子濃度為0. 5 1. Omol/L ；在制得的乙醇溶液中加入摩爾質(zhì)量10倍于鐵離子的環(huán)氧氯丙烷形成溶膠，靜置后形成凝膠；制得的凝膠經(jīng)陳化后用乙醇清洗并干燥； 隨后進(jìn)行400°C下退火處理即制得狗304。2)反應(yīng)結(jié)束后，將制得的!^e3O4依次用去離子水和乙醇交替清洗，至pH值為7。最后在真空條件下進(jìn)行干燥，即得!^e3O4磁性納米顆粒。3)取5g上述制備的!^e3O4磁性納米顆粒，置于20ml去離子水中，超聲(IOOOkHz) 分散30min后離心(或磁性)分離，得納米!^e3O4沉淀A。4)將沉淀A 5g重置于IOml PBS緩沖溶液中，超聲分散，緩慢加入70mg聚乙酰亞胺(PEI)，慢速200r/min充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，移至恒溫水浴上繼續(xù)慢速攪拌Mhr，水浴溫度保持 30 0C ο5)用磁分離法將固體從溶液中分離，得沉淀B和上清液。6)將沉淀B依次用蒸餾水和甲醇交替清洗至pH值為7，然后真空干燥，即得PEI 修飾的!^e3O4納米粒子，存放于干燥皿中備用。透射電鏡和粒度分析結(jié)果表明，該P(yáng)EI修飾的!^e3O4磁性納米顆?；境蕟畏稚?、 球狀、粒度分布比較窄、平均粒徑約為20nm。其中電鏡圖見(jiàn)圖1。實(shí)施例2復(fù)合納米磁性顆粒的制備1、取PEI修飾的!^e3O4納米粒子lOOmg，懸浮于IOml 0. OlM pH7. 2TBS之中，得納米粒子溶液，其中PEI修飾的!^e3O4納米粒子的濃度約為3X IO13個(gè)/ml。2、制備復(fù)合蛋白用:3ml 0. OlM pH7. 2TBS分別溶解蛋白A(SPA)和蛋白B (兔抗人⑶44和CK7)(均購(gòu)自鈺森生物科技有限公司)，混勻，置4°C反應(yīng)30分鐘，蛋白A濃度為 10mg/ml，蛋白 B 濃度為 lmg/ml。3、取上述AB復(fù)合蛋白溶液0. 5ml與上述納米粒子溶液IOml均勻混合，室溫60分鐘，即得復(fù)合納米磁性顆粒溶液。實(shí)施例3痰液中肺癌細(xì)胞的病理學(xué)檢測(cè)將850例肺癌患者痰液標(biāo)本隨機(jī)分為2組?；颊咝柽B續(xù)3天留晨痰，2小時(shí)內(nèi)送到醫(yī)院，否則，痰液變質(zhì)，細(xì)胞自溶，無(wú)法診斷。采集患者痰液5ml于痰盒內(nèi)，加入0.5ml堿性裂解液(含1 %蛋白酶K，10% NaOH的水溶液)混勻，室溫保持lOmin，充分液化痰液。實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行肺癌細(xì)胞富集和液基細(xì)胞病理學(xué)檢測(cè)。在上述液化痰液中加入1/10 體積實(shí)施例2制得的復(fù)合納米磁性顆粒溶液，混勻，靜置15分鐘。500rpm離心5分鐘， 取沉淀在保存液(10%甲醇水溶液)中懸浮。然后采用新柏氏液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測(cè)系統(tǒng) (Thinprep cytology test, TCT)將上述懸浮液制片、染色、封片、鏡檢(圖2)。對(duì)照組進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)痰液中的肺癌脫落細(xì)胞。用竹簽挑取上述液化痰液，涂片，然后進(jìn)行染色、封片、鏡檢。結(jié)果常規(guī)細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)陽(yáng)性率為6. 4% (54/850)，復(fù)合納米微球處理后再行液基細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)陽(yáng)性率為38. 9% (331/850)。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合肺癌細(xì)胞的復(fù)合I^e3O4磁性納米顆粒，其特征在于，其是在表面修飾著聚乙酰亞胺，并標(biāo)記有對(duì)肺癌細(xì)胞具有結(jié)合能力的復(fù)合蛋白的I^e3O4磁性納米顆粒，其中，所述的對(duì)肺癌細(xì)胞具有結(jié)合能力的復(fù)合蛋白是由蛋白SPA和選自抗CD44抗體和抗CK7抗體中的一種或兩種組成的復(fù)合蛋白。
2.一種如權(quán)利要求1所述的結(jié)合肺癌細(xì)胞的復(fù)合!^e3O4磁性納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)制備Fe^3O4磁性納米顆粒；2)在步驟1)所得的!^e3O4磁性納米顆粒表面修飾聚乙酰亞胺；3)在步驟幻所得的聚乙酰亞胺修飾的!^e3O4磁性納米顆粒表面標(biāo)記對(duì)肺癌細(xì)胞具有結(jié)合能力的復(fù)合蛋白，該復(fù)合蛋白是由蛋白SPA和選自抗CD44抗體和抗CK7抗體中的一種或兩種組成的復(fù)合蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述的!^e3O4磁性納米顆粒的平均粒徑范圍是15 50nm。
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟1)包括將硝酸鐵和硝酸亞鐵以摩爾質(zhì)量比為4 1的比例于乙醇中形成分散均勻的乙醇溶液，其中鐵離子濃度為0.5 1. Omol/L ；在制得的乙醇溶液中加入摩爾質(zhì)量10倍于鐵離子的環(huán)氧氯丙烷形成溶膠，靜置后形成凝膠；制得的凝膠經(jīng)陳化后用去離子水清洗并干燥；清洗并干燥后的凝膠進(jìn)行 400°C下退火處理即制得!^e3O4沉淀；將制得的!^e3O4沉淀依次用去離子水和乙醇交替清洗， 至PH值為中性，真空干燥，即得!^e3O4磁性納米顆粒；步驟2、包括將!^e3O4磁性納米顆粒置于PBS緩沖溶液中，超聲分散，緩慢加入聚乙酰亞胺(PEI)，慢速充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，移至恒溫水浴上繼續(xù)慢速攪拌M小時(shí)，水浴溫度保持30°C ；用磁分離法將固體從溶液中分離，將固體依次用蒸餾水和甲醇交替清洗至PH值為中性，真空干燥，即得PEI修飾的!^e3O4納米粒子；步驟幻包括將聚乙酰亞胺修飾的!^e3O4納米粒子懸浮于0. OlM pH7. 2TBS之中，得納米粒子溶液，其中聚乙酰亞胺修飾的!^e3O4納米粒子的濃度約為3X IO13個(gè)/ml ；用0. OlM pH7. 2TBS分別溶解蛋白A和蛋白B，混勻，4°C反應(yīng)30分鐘，即得復(fù)合蛋白溶液，其中，蛋白A濃度為10mg/ml，蛋白B濃度為lmg/ml，蛋白A是蛋白SPA，蛋白B是抗⑶44 抗體和/或抗CK7抗體；將上述復(fù)合蛋白溶液與上述納米粒子溶液均勻混合，室溫60分鐘，即得復(fù)合納米磁性顆粒溶液。
5.一種富集痰液中肺癌細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟a)采集痰液，充分液化痰液；b)在步驟a)所得的液化痰液中加入如權(quán)利要求1所述的復(fù)合納米磁性顆粒的溶液進(jìn)行反應(yīng)；c)將步驟b)的反應(yīng)液離心富集其中的細(xì)胞。
6.一種檢測(cè)痰液中肺癌細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟a)采集痰液，充分液化痰液；b)在步驟a)所得的液化痰液中加入如權(quán)利要求1所述的復(fù)合納米磁性顆粒的溶液進(jìn)行反應(yīng)；c)將步驟b)的反應(yīng)液離心富集其中的細(xì)胞，將所得細(xì)胞重新懸浮，然后采用液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)將該懸浮液制片、染色、封片、鏡檢。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，步驟a)所述的痰液中加入堿性裂解液以充分液化痰液，所述的堿性裂解液蛋白酶K，10% NaOH的水溶液。
8.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，步驟b)所述的反應(yīng)是室溫靜置15分鐘。
9.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，步驟c)所述的離心是500rpm，5分鐘； 離心所得的細(xì)胞懸浮在保存液中，保存液是10%甲醇水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種結(jié)合肺癌細(xì)胞的復(fù)合Fe3O4磁性納米顆粒及其制備方法。其是在表面修飾著聚乙酰亞胺，并標(biāo)記有對(duì)肺癌細(xì)胞具有結(jié)合能力的復(fù)合蛋白的Fe3O4磁性納米顆粒，其中，所述的對(duì)肺癌細(xì)胞具有結(jié)合能力的復(fù)合蛋白是由蛋白SPA和選自抗CD44抗體和抗CK7抗體中的一種或兩種組成的復(fù)合蛋白。本發(fā)明還公開(kāi)了一種富集和檢測(cè)痰液中肺癌細(xì)胞的方法，包括a)采集痰液，充分液化痰液；b)加入所述的復(fù)合納米磁性顆粒的溶液進(jìn)行反應(yīng)；c)將反應(yīng)液離心富集其中的細(xì)胞。將所得細(xì)胞重新懸浮，采用液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)(TCT)將該懸浮液制片、染色、封片、鏡檢。該方法檢測(cè)痰液中肺癌細(xì)胞的陽(yáng)性率比常規(guī)方法提高30％以上，檢測(cè)效率明顯提高，檢測(cè)成本有所下降。
文檔編號(hào)G01N1/34GK102344117SQ20101024631
公開(kāi)日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者嚴(yán)彪, 李成魁, 李輝, 陳崗 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院