專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)磺胺二甲基嘧啶的試劑板的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)蜂蜜中磺胺二甲基嘧啶殘留的試劑板的制備方法，具體涉及 一種檢測(cè)磺胺二甲基嘧啶的免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板的制備方法。
背景技術(shù)：
磺胺二甲基嘧啶(Sulfamethazine)由乙酰丙酮直接與磺胺脒縮合制得，適用于 治療溶血性鏈球菌、腦膜炎球菌、肺炎球菌等感染疾病，用作飼料添加劑，可防治葡萄球菌 及溶血性鏈球菌等的感染。由于其藥效持久顯著，在蜜蜂飼養(yǎng)中常用磺胺類(lèi)藥物進(jìn)行疾病 防治。然而不合理使用，易使磺胺二甲基嘧啶在蜂蜜中殘留，藥物通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體 后會(huì)導(dǎo)致血尿、結(jié)晶尿、腎臟損害等疾病，對(duì)人體健康健康造成危害，同時(shí)磺胺二甲基嘧啶 在蜂蜜中的殘留也給蜂蜜貿(mào)易造成障礙。許多國(guó)家都規(guī)定了磺胺二甲基嘧啶及磺胺類(lèi)藥物在蜂蜜中的最高殘留限量 (MRL)。我國(guó)及歐盟均規(guī)定動(dòng)物性食品中總磺胺以及單個(gè)磺胺藥物的MRL為lOOppb。目前，對(duì)于磺胺二甲基嘧啶殘留的檢測(cè)方法主要有理化分析法和免疫分析法。理 化分析法，如HPLC及LC-MS，具有特異性好、準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)，是各大檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)檢測(cè)樣本 進(jìn)行確證的首選方法，但存在對(duì)設(shè)備、環(huán)境、操作技能等要求，所需費(fèi)用高，不利于大規(guī)模樣 本篩選，因而不適合廣大基層部門(mén)。免疫分析法，如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，具有檢測(cè)量 大，操作相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多地被用于動(dòng)物性食品中抗生素殘留的檢測(cè)，但是ELISA 法整個(gè)操作時(shí)間仍需要l_2h，且需用到昂貴的特殊儀器設(shè)備酶標(biāo)儀，具有一定局限性。食品安全關(guān)系國(guó)計(jì)民生，研制開(kāi)發(fā)一種檢測(cè)限符合要求，重現(xiàn)性好，檢測(cè)時(shí)間短， 適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，技術(shù)產(chǎn)品或儀器設(shè)備成本較低，運(yùn)行費(fèi)用低的快速檢測(cè)試劑迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高，特異性好，簡(jiǎn)便快速，生產(chǎn)成本低的磺胺二 甲基嘧啶免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板的制備方法。本發(fā)明試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、 膠金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。相鄰各部分間有l(wèi)_2mm的重疊以保證層析作用從樣 品墊到吸水墊部位的順利進(jìn)行。本發(fā)明試劑板的各部分組成成分和功能如下塑料模板，起固定背襯和標(biāo)示各功能區(qū)(加樣孔、檢測(cè)區(qū)、控制區(qū))的作用。背襯，由一面涂有不干膠的不吸水韌性材料制成，起固定支撐試劑板其他組成部 分的作用。樣品墊，由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液和緩沖樣品溶液pH值的作用。膠金結(jié)合墊，由聚酯膜制成，其上有 磺胺二甲基嘧啶單克隆抗體與膠體金顆粒 的結(jié)合物。為樣品溶液中有效成分和金標(biāo)抗體反應(yīng)提供場(chǎng)所。
硝酸纖維素膜，從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測(cè)線和質(zhì)控線，將反應(yīng)結(jié)果 以肉眼可見(jiàn)的顏色表征出來(lái)。吸水墊，由濾紙制成，將反應(yīng)過(guò)程中多余的溶液吸收。本發(fā)明試劑板具有如下有益效果(1)特異性好。本發(fā)明試劑板對(duì)磺胺二甲基嘧啶的交叉反應(yīng)率為100%，對(duì)如磺胺 嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶等抗生素的交叉反應(yīng)率均低于1%?？梢?jiàn)，本發(fā)明試 劑板對(duì)磺胺二甲基嘧啶反應(yīng)具有高度專(zhuān)一性。(2)靈敏度高。本發(fā)明試劑板對(duì)原蜜、濃縮蜜中磺胺二甲基嘧啶的檢出限為 lOppb，符合國(guó)家限量要求。(3)操作簡(jiǎn)單快捷。本發(fā)明試劑板將反應(yīng)所需的大部分原料整合到PVC背襯中， 滴樣后，抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進(jìn)行，大大縮短檢樣時(shí)間，且樣品無(wú)需特殊處理，滴 樣后5-10分鐘即可用肉眼通過(guò)判斷硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線和質(zhì)控線的顏色深淺讀取結(jié) 果。檢測(cè)實(shí)施過(guò)程不依賴(lài)任何實(shí)驗(yàn)設(shè)備，普通人員均可操作，不需專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)。(4)成本低，易推廣。本發(fā)明試劑板生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，流程成熟。生產(chǎn)成本低廉，投資 少，收效快。


圖1為磺胺二甲基嘧啶免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板背襯結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為樣 品墊，2為膠金結(jié)合墊，3為硝酸纖維素膜，4為檢測(cè)線，5為質(zhì)控線，6為吸水墊，7為不干膠， 8為PVC底板。圖2為磺胺二甲基嘧啶免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔， C為控制區(qū)，T為檢測(cè)區(qū)。圖3為磺胺二甲基嘧啶免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板結(jié)果判定示意圖，其中C為控 制區(qū)，T為檢測(cè)區(qū)。具體實(shí)施方法本發(fā)明試劑板的制備包括磺胺二甲基嘧啶-載體蛋白偶聯(lián)物的制備，抗磺胺二甲 基嘧啶單克隆抗體的制備，膠體金溶液的制備，膠體金標(biāo)記抗磺胺二甲基嘧啶單克隆抗體 的制備和磺胺二甲基嘧啶免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板的組裝。1.磺胺二甲基嘧啶與載體蛋白的偶聯(lián)采用重氮法將磺胺二甲基嘧啶與載體蛋白偶聯(lián)制備免疫抗原和包被抗原。稱(chēng)取 IOmg磺胺二甲基嘧啶溶于IOmL 12. 5mol/L的H2S04，將20mL 20 %的NaNO3溶液緩慢滴入 上述溶液中，4°C下反應(yīng)lOmin。再在得到的混合溶液中加入2mL溶有IOOmg牛血清蛋白 (BSA)的碳酸鈉緩沖溶液(pH 10.0)，4°C下反應(yīng)過(guò)夜，生理鹽水透析72h，制得的磺胺二甲 基嘧啶-BSA載體蛋白偶聯(lián)物于_20°C凍存?zhèn)溆?。卵清蛋?OVA)替代BSA，同同樣方法制備磺胺二甲基嘧啶-OVA偶聯(lián)物。2.抗磺胺二甲基嘧啶單克隆抗體的制備取6 8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的磺胺二甲基嘧啶-BSA偶聯(lián)物與等 體積的弗氏完全佐劑乳化，按100 μ g/只劑量皮下注射，之后每隔3周加強(qiáng)免疫1次，用不 完全佐劑替代完全佐劑進(jìn)行腹腔注射。融合前3d強(qiáng)化免疫1次，不用佐劑，劑量加倍。細(xì)胞融合按常規(guī)方法進(jìn)行將Sp2/0多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1 10的比例混合， 在50% PEG作用下融合，HAT培養(yǎng)基懸浮，分種于96孔培養(yǎng)板中，37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后，待細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積的1/4時(shí)，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初 篩選擇10mg/L磺胺二甲基嘧啶-OVA偶聯(lián)物包被酶聯(lián)板，被測(cè)孔加培養(yǎng)上清，孵育、清洗后， 加入羊抗鼠IgG-HRPd 1000)，OPD顯色。篩選出的陽(yáng)性孔再用磺胺二甲基嘧啶-OVA偶 聯(lián)物包被的酶聯(lián)板進(jìn)行阻斷間接ELISA。將細(xì)胞培養(yǎng)上清與2X 10_3mol/L磺胺二甲基嘧啶 溶液等量混合，37°C感作lh，加入已包被的酶標(biāo)板中。另外用PBS(0.01mol/L、pH 7.4)替 代磺胺二甲基嘧啶溶液作對(duì)照，其余步驟同上。若磺胺二甲基嘧啶阻斷后的OD值降至對(duì)照 孔的50%以下，則判為陽(yáng)性孔。經(jīng)2 3次檢測(cè)都呈陽(yáng)性的孔，立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆 化。體外培養(yǎng)將克隆化的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞濃度達(dá)5 X IO5Hir1時(shí)停止換液，細(xì)胞 全部死亡后收集培養(yǎng)液。體內(nèi)誘生腹水給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔注射克隆 化細(xì)胞株IO7個(gè)細(xì)胞，7天后抽取腹水。3.膠體金溶液的制備膠體金顆粒的平均大小為30nm，其制備方法為在IOOmL去離子水中加入ImL 1% 檸檬酸三鈉，煮沸后迅速加入ImL 氯金酸，繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，冷卻后，4°C下保存?zhèn)溆谩?.膠體金標(biāo)記抗磺胺二甲基嘧啶單克隆抗體的制備取已制備好的IOOmL膠體金溶液，用0. lmol/L碳酸鉀溶液調(diào)pH到8. O。邊攪 拌邊加入1. 5mg抗磺胺二甲基嘧啶單抗，攪拌20min，再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇 20000 (PEG20000)，攪拌 15min。20，OOOrpm 離心 15min，棄上清液，加入 IOmL pH 7. 4PBS 緩 沖液(含0. 4mol/L PEG)清洗2次。將沉淀用5mL含2% BSA的PBS緩沖液(pH 7. 4)溶 解，用0. 22 μ m無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，4°C保存?zhèn)溆谩?.磺胺二甲基嘧啶免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板的組裝參照?qǐng)D1，用點(diǎn)膜機(jī)把適當(dāng)濃度的磺胺二甲基嘧啶-BSA偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在 硝酸纖維素膜上，分別作為檢測(cè)線和控制線，37°C烘箱干燥8h。以同樣方法，將制備好的金 標(biāo)記磺胺二甲基嘧啶單克隆抗體包被在膠金結(jié)合墊上。檢測(cè)試劑組成為PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素 膜和吸水墊。用切割機(jī)將貼好的大卡切割成4mm寬的條，裝入塑料模板中制成檢測(cè)試劑板， 再放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲(chǔ)存。6.磺胺二甲基嘧啶免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板檢測(cè)實(shí)施操作方法6.1樣品制備取蜂蜜3mL加入15mL刻度冷凍管中，再依次加入磺胺二甲基嘧啶A液和B液各 lmL，于60°C 80°C的熱水中溫?zé)釘?shù)分鐘，溶解蜂蜜，振蕩混勻。加入SmL乙酸乙酯，上下翻 轉(zhuǎn)振蕩5min后靜置。用滴管轉(zhuǎn)移5mL上層有機(jī)溶劑于5mL刻度冷凍管中，用65°C氮(空) 氣吹干。在該5mL刻度冷凍管中滴加5滴磺胺二甲基嘧啶專(zhuān)用PBST緩沖液，充分溶解管內(nèi) 壁上殘留物，待檢。6. 2檢測(cè)步驟從包裝袋中取出試劑板，用滴管吸取待檢溶液，在加樣孔中滴入3滴(約100 μ L)，
5加樣后開(kāi)始計(jì)時(shí)，結(jié)果應(yīng)在3 5min讀取，其他時(shí)間判讀無(wú)效。6. 3結(jié)果判讀讀取結(jié)果時(shí)，將試劑板水平置于觀察者正面，如圖2右側(cè)所示。陰性㈠T線顯色比C線深或一樣深，表明樣品中磺胺二甲基嘧啶濃度低于 IOppb或無(wú)磺胺二甲基嘧啶殘留。如圖3. a所示。陽(yáng)性(+) :T線顯色比C線淺，或T線無(wú)顯色，表明樣品中磺胺二甲基嘧啶濃度高于 IOppb ；T線比C線越淺，表明樣品中磺胺二甲基嘧啶濃度越高。如圖3. b所示。無(wú)效未出現(xiàn)C線，可能操作不當(dāng)或試劑板已失效。應(yīng)再次閱讀說(shuō)明書(shū)，并用新試 劑板重新測(cè)試。如圖3. c所示。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)磺胺二甲基嘧啶的試劑板的制備方法，其特征在于試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，試劑板背襯上依次緊密粘貼的樣品墊、膠金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相鄰各部分間有1 2mm的重疊以保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進(jìn)行。
2.如權(quán)利要求1所說(shuō)的制備方法，其特征在于試劑板的硝酸纖維素膜上的膠體金結(jié)合 墊上包被有抗磺胺二甲基嘧啶單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，從樣品墊到吸水墊方向上依次 噴有檢測(cè)線和質(zhì)控線，包被有磺胺二甲基嘧啶-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG，將反應(yīng)結(jié)果 以肉眼可見(jiàn)的顏色表征出來(lái)。
3.如權(quán)利要求1所說(shuō)的制備方法，其特征在于膠金結(jié)合墊上包被有抗磺胺二甲基嘧啶 單克隆抗體與膠體金結(jié)合物，膠體金顆粒的平均大小為30nm。
4.如權(quán)利要求1所說(shuō)的制備方法，其特征在于偶聯(lián)磺胺二甲基嘧啶的載體蛋白可為牛 血清蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白。
5.如權(quán)利要求1所說(shuō)的制備方法，其特征在于樣品中的磺胺二甲基嘧啶含量超過(guò)試劑 板檢出限時(shí)，試劑板上的檢測(cè)線顯色較控制線淺甚至無(wú)顯色，判定為陽(yáng)性；反之，當(dāng)樣品中 磺胺二甲基嘧啶含量在試劑板檢出限以下或無(wú)殘留時(shí)，試劑板上的檢測(cè)線顯色與控制線相 近或偏深，判定為陰性。
6.如權(quán)利要求1所說(shuō)的制備方法，其特征在于工藝流程包括制備磺胺二甲基嘧啶-BSA 偶聯(lián)物、制備抗磺胺二甲基嘧啶單克隆抗體、制備膠體金溶液、制備膠體金標(biāo)記抗磺胺二甲 基嘧啶單克隆抗體和組裝磺胺二甲基嘧啶免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)蜂蜜中磺胺二甲基嘧啶殘留的試劑板的制備方法，可用于檢測(cè)蜂蜜中的磺胺二甲基嘧啶。本發(fā)明試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測(cè)線和質(zhì)控線，可將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見(jiàn)的顏色表征出來(lái)。該試劑板可進(jìn)行半定量直觀檢測(cè)，整個(gè)操作過(guò)程僅需20～30min，且無(wú)需任何昂貴實(shí)驗(yàn)設(shè)備輔助，利于大規(guī)模樣本篩選，適合工商部門(mén)、檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)、養(yǎng)蜂場(chǎng)及蜂產(chǎn)品生產(chǎn)加工企業(yè)對(duì)原料及產(chǎn)品中的磺胺二甲基嘧啶進(jìn)行大規(guī)?？焖贆z測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101949922SQ20101025201
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月11日
發(fā)明者張少恩, 桑麗雅, 邵偉 申請(qǐng)人:杭州南開(kāi)日新生物技術(shù)有限公司