專利名稱：檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的elisa試劑盒及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物病毒性疾病監(jiān)測和診斷試劑研制領(lǐng)域，具體涉及一種檢測豬繁殖 與呼吸綜合征病毒的ELISA試劑盒及使用方法。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)能引起豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，主要表現(xiàn) 為妊娠母豬的早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎及仔豬的呼吸系統(tǒng)癥狀。1987年美國首先報道了該疾病的發(fā) 生，隨后加拿大、德國、荷蘭等國家及地區(qū)也相繼爆發(fā)了該病。PRRSV由荷蘭學(xué)者Wensvoort 于1991年首次分離并鑒定，命名為Lelystad病毒(LV)。1992年美國首次分離到一株 PRRSV，并命名為VR2332。我國于1996年首次報道有該病的發(fā)生。該病自發(fā)現(xiàn)以來，在世界 范圍內(nèi)流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。關(guān)于PRRS的實驗室診斷主要包括病毒抗體和抗原的檢測，方法包括病毒分離 (VI)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫過氧化物酶單層實驗(IPMA)、間接熒光抗體技術(shù) (IFA)、血清中和試驗(SN)、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和核酸探針原位雜交技術(shù) (ISH)等。在所有檢測技術(shù)中，ELISA是最適合臨床快速診斷的方法，美國IDEXX公司已向 市場推出檢測PRRSV抗體的ELISA試劑盒。目前，國內(nèi)外研制的多種ELISA方法主要檢測 PRRSV抗體，而檢測PRRSV抗原的ELISA方法僅見楊漢春等的“豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙 抗體夾心ELISA試劑盒”(專利申請?zhí)?00910093631. 1)。楊漢春等采用針對N蛋白不同 抗原決定簇的兩種單抗為捕獲抗體和檢測抗體，本發(fā)明則提供了一種以多抗和單抗捕獲抗 原的ELISA方法。本發(fā)明與楊漢春等的方法不同之處在于不僅利用了單抗的高度特異性， 而且利用了多抗針對更多抗原位點的特性，所建立的ELISA方法捕獲抗原的能力更強，與 RT-PCR檢測PRRSV的符合率更高，可應(yīng)用于PRRS的監(jiān)測和診斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以多抗和單抗捕獲抗原的ELISA檢測試劑盒，該試劑盒 用于檢測PRRSV抗原，敏感性高、特異性強，適合于對臨床樣品的快速檢測。ELISA檢測試劑盒包括包被PRRSVN蛋白單克隆抗體的酶標(biāo)板、PRRSV多克隆抗 體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、洗滌液、顯色液、終止液、樣品裂解液、陽性對照、陰性對照。上述所說的包被在酶標(biāo)板上的PRRSVN蛋白單克隆抗體是由雜交瘤細胞株P(guān)2D3分 泌獲得。本發(fā)明研制了針對PRRSV N蛋白的單抗P2D3( “豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼 蛋白基因的原核表達及其單克隆抗體的研制”，2008-12-16，中國知識資源總庫-中國優(yōu)秀 碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫，www.cnki.net，作者姜麗英，指導(dǎo)教師吳艷濤。P2D3由申請人 保存)。Western blotting試驗，單抗可以和PRRSV約15kDa的蛋白帶呈陽性反應(yīng)；間接免 疫熒光試驗，單抗與感染PRRSV的Marc-145細胞均發(fā)生反應(yīng)而顯示特異性熒光，而與未感 染PRRSV的Marc-145細胞無反應(yīng)；單抗亞類為IgG115
本發(fā)明中所說的多抗可按以下方法制備利用Marc-145細胞培養(yǎng)PRRSV SHY-I 株，以超速離心純化的PRRSV為抗原，與弗氏完全佐劑充分乳化后，免疫60日齡家兔；20天 后、40天后以以同樣的抗原與弗氏不完全佐劑乳化，各加強免疫一次；60天采血，分離血 清；采用Protein G親和層析純化。本發(fā)明中包被單抗P2D3的酶標(biāo)板可按以下方法制備將單抗P2D3按每孔 200ng/100y 1包被96孔酶標(biāo)板，包被液為0. IM pH 9. 6碳酸鹽緩沖液，37°C包被2小時； 酶標(biāo)板在37°C下以每孔200μ 1的含10%小牛血清pH 7. 5PBS封閉2小時；以pH 7. 5PBST 洗滌3次，立即使用或貯藏于-20°C備用。本發(fā)明中使用的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為商品化試劑；樣品裂解液(1 % NP-40、IM NaClUM Tris-Cl, pH7. 5)可以使PRRSV病毒粒子的囊膜被破壞，釋放出N蛋白；酶標(biāo)板洗 滌液為PBST (含0. 05% Tween-20的PBS)；顯色液為TMB ；終止液為2M H2SO4 ；陽性對照為 表達的PRRSVN蛋白(lOng/ml)( “豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白基因的原核表達及 其單克隆抗體的研制”，2008-12-16，中國知識資源總庫-中國優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù) 庫，誦.cnki. net，作者姜麗英，指導(dǎo)教師吳艷濤。申請人保存)、陰性對照為PBS。本發(fā)明提供了檢測樣品的準備方法將豬的淋巴結(jié)和肺組織等病料研磨至糊狀， 與等體積樣品裂解液混合；經(jīng)反復(fù)凍融3次后，4000rpm離心30min，取上清液備用。本發(fā)明提供了 ELISA的流程和工作條件。將待測樣品加入酶標(biāo)板，每孔100 μ 1， 37°C孵育30分鐘；以PBST洗滌3次；每孔加入475ng/100l·! 1多抗，37°C孵育30分鐘；以 PBST洗滌3次；每孔加入1 5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 100 μ 1，37°C孵育30分 鐘；以PBST洗滌3次；每孔加入100 μ 1 TMB,顯色10分鐘；加50 μ 1 2MH2S04中止反應(yīng)，讀 取450nm光密度值，判定結(jié)果。本發(fā)明試劑盒有以下優(yōu)點(1)以多抗和單抗捕獲PRRSV抗原，與豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬 圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬瘟病毒(CSFV)無交叉反應(yīng)。(2)檢測PRRSV人工攻毒感染豬的組織樣品，結(jié)果顯示肺門淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié) 以及肺是最適合臨床檢測的組織，檢出率高達100%。(3)對300份從臨床上收集的豬肺或者淋巴結(jié)樣品分別采用本發(fā)明提供的ELISA 方法和RT-PCR方法進行檢測，兩種方法的符合率為95. 7%。(4)對接種PRRSV弱毒疫苗的豬用本發(fā)明提供的ELISA方法檢測，在免疫3天和6 天后均仍能夠從血液中檢測到病毒，而在免疫9、12、15、18、21天后均檢測不到病毒。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明中，已被文獻公開并由申請人保存的生物材料，均自申請日起向公眾提供 20年。實施實例1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體研制1實驗方法
1.1抗原的制備復(fù)蘇Marc-145細胞，待細胞長至單層時，棄去生長液，用PBS洗兩次，接種適量 PRRSVSHY-1株(由申請者分離、鑒定和保存，見2010年2月出版《中國獸醫(yī)學(xué)報》，第30卷， 第2期，145 149頁，“豬繁殖與呼吸綜合征病毒江蘇分離株0RF5及Nsp2基因部分序列 分析”，作者遲蘭、吳艷濤等)，37°C吸附lh，加入維持液5ml，37°C 6% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培 養(yǎng)約3-5天后，細胞病變達80%以上時，收獲病毒液，-70°C保存?zhèn)溆?。取適量收獲的病毒液用維持液作10倍比稀釋。按照Reed-Muench法計算TCID5(1。采用PEG濃縮法對所收獲的病毒液進行濃縮。取病毒液500ml凍融3次后裝入處 理后的透析袋內(nèi)，用PEG-12000包埋透析袋，4°C作用數(shù)小時，待透析袋內(nèi)液體量濃縮至原 來的1/5 1/10時，吸出，_20°C保存?zhèn)溆?。將濃縮后的病毒液4°C 6000rpm離心30min，棄去沉淀，上清液經(jīng)28000rpm 4°C離 心2h，棄去上清，加入PBS吹散沉淀并混勻。將此病毒上清懸液輕輕加于10%、20%、30%、 40%,50%,60%的蔗糖密度梯度上，以35000rpm離心2h，收集30% 40%梯度帶上的蛋白 質(zhì)提取物，以35000rpm離心2h，棄上清液，少量PBS懸浮沉淀，紫外分光光度計檢測病毒蛋 白含量，-70°C保存?zhèn)溆谩?. 2動物免疫取含適量純化病毒抗原(200 μ g左右)的病毒液400 μ 1與等體積的弗氏完全佐 劑充分乳化，皮下分點注射8周齡BALB/c小鼠200 μ 1/只；2周后、4周后以相同方法使用 弗氏不完全佐劑乳化的抗原再各免疫一次；6周后取相同劑量抗原腹腔注射，不加佐劑；3 天后融合。1. 3 融合1. 3. 1骨髓瘤細胞的準備選擇生長狀態(tài)良好的SP2/0細胞，密度長至75%時棄上清，以無抗不完全DMEM培 養(yǎng)基洗滌一次后，用IOml無抗不完全DMEM培養(yǎng)基將細胞輕輕吹下。1. 3. 2脾淋巴細胞的準備取加強免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血作為陽性血清；頸脫臼將小鼠致死，用 75%酒精消毒體表lOmin，隨即放入超凈臺內(nèi)的解剖板上，腹部朝上，四肢固定；無菌打開 腹腔取出脾臟，用無抗不完全DMEM培養(yǎng)基洗滌，并仔細去掉周圍附著的結(jié)締組織；隨后將 脾臟轉(zhuǎn)移到另一個盛有無抗不完全DMEM培養(yǎng)基的平皿中。用研磨棒擠壓，使脾細胞充分釋 放，制成脾細胞懸液。1. 3. 3飼養(yǎng)細胞的制備飼養(yǎng)細胞可以在融合前一天晚上或者融合過程中制備，方法如下取一只成熟健 康的ICR小鼠，摘眼球采血作為陰性血清，頸脫臼處死；體表消毒和固定后，暴露腹膜，酒精 棉球消毒腹膜；注入IOml HAT培養(yǎng)基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球輕輕按摩 腹部，抽回腹腔內(nèi)液體，注入已準備好的容器中。如果是在融合前一天晚上制備飼養(yǎng)細胞， 可以將飼養(yǎng)細胞預(yù)先稀釋后加入96孔細胞培養(yǎng)板中。1. 3. 4細胞融合將上述制備的骨髓瘤細胞與脾細胞混合于一支50ml的帶蓋的融合管中，IOOOrpm 離心lOmin，棄上清。將融合管置于手掌中，輕輕摩擦底部，使兩種細胞充分混勻；在37°C水浴中45s內(nèi)緩慢加入Iml預(yù)熱的PEG到融合管中，邊加邊輕輕搖勻；隨即在90s內(nèi)先慢后快 滴加30mL 37°C預(yù)熱的無抗不完全DMEM培養(yǎng)基，使PEG稀釋而失去作用，37°C靜止lOmin， IOOOrpm離心IOmin ；棄上清，用60ml HAT培養(yǎng)基輕輕懸浮沉淀細胞，再加入適量的腹腔巨 噬細胞；分裝于96孔細胞培養(yǎng)板，然后將培養(yǎng)板置37°C 6% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；5d后用新 鮮的HAT培養(yǎng)基換出一半培養(yǎng)基；IOd后用預(yù)熱的HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基；觀察雜交瘤 細胞的生長情況，待其細胞培養(yǎng)上清變黃或克隆分布至孔底面積的1/10以上時，吸取適量 細胞上清進行抗體檢測。1. 4雜交瘤細胞的篩選以大腸桿菌表達的PRRSVN蛋白(“豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白基因的原 核表達及其單克隆抗體的研制”，2008-12-16，中國知識資源總庫_中國優(yōu)秀碩士學(xué)位論文 全文數(shù)據(jù)庫，www.cnki.net，作者姜麗英，指導(dǎo)教師吳艷濤。申請人保存)為檢測抗原， 采用間接ELISA方法來篩選陽性克隆。以方陣試驗確定檢測抗原包被濃度。將檢測抗原用碳酸鹽包被緩沖液做系列稀 釋，每一行為一個稀釋度，100 μ 1/孔包被酶標(biāo)板，4°C包被過夜；用PBST洗滌3遍，每次 5min，在吸水上拍干；加封閉液200 μ 1/孔，4°C反應(yīng)過夜，同上洗滌3遍；加入梯度稀釋的 陽性血清100 μ 1/孔，37°C孵育1. 5h，同上洗滌3遍；加入工作濃度(1 5000稀釋)的羊 抗鼠HRP-IgG ΙΟΟμ 1/孔，37°C孵育lh，同上洗滌3遍；加入TMB顯色液100μ 1/孔，37°C 反應(yīng)10-15min ；加入2MH2S04 1 00 μ 1/孔終止反應(yīng)。測定孔內(nèi)的OD4500按方陣確定好的抗原濃度包被酶標(biāo)板，_20°C保存?zhèn)溆谩z測雜交瘤上清的ELISA 方法同上。免疫小鼠血清作為篩選時的陽性對照，非免疫的ICR小鼠血清作為陰性對照，同 時設(shè)立空白調(diào)零孔。1. 5雜交瘤細胞的克隆化采用有限稀釋法對ELISA檢測為陽性的雜交瘤細胞進行克隆化。首先制備小鼠腹腔飼養(yǎng)細胞，分裝到96孔細胞培養(yǎng)板；將陽性孔中的雜交瘤細胞 吹下，經(jīng)計數(shù)后用HT培養(yǎng)基稀釋，按1個細胞/孔、3個細胞/孔、10個細胞/孔加入到裝 有飼養(yǎng)細胞的96孔板中；37°C 6% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7-10天，對出現(xiàn)單個細胞克隆孔的上清 再用間接ELISA方法進行檢測；連續(xù)進行3-4次亞克隆，至每個細胞孔上清均為陽性時可以 定株。1.6腹水的制備及純化取10周齡的BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟，0. 5ml/只；1周后腹腔注射用 PBS稀釋的處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞，IX IO6個/只；待小鼠腹部明顯隆起時，用16號 針頭從腹腔采集腹水，2500rpm離心lOmin，去除脂肪組織，將上清取出，-70°C保存?zhèn)溆?。采用Protein A親和層析方法進行純化腹水。具體方法如下。輕柔顛倒裝有 Protein A親和樹脂的容器數(shù)次以混合樹脂使其完全懸浮。將適量Protein A樹脂裝入 層析柱中，加入5ml的結(jié)合緩沖液平衡柱子。使用相同或者更多體積的結(jié)合緩沖液稀釋 多抗血清樣品，上樣。上樣后用IOml結(jié)合緩沖液洗柱子。結(jié)合緩沖液流盡后，用30ml的 洗脫緩沖液洗脫抗體，收集洗脫產(chǎn)物。洗脫過程中實時檢測洗脫液的PH值，及時用IM Tris-Cl(pH8. 5)中和洗脫液，使含洗脫產(chǎn)物的洗脫液的pH為7. 4。洗脫液裝入透析袋，使 用0. OlM的Tris-Cl緩沖液(pH7. 4)4°C透析過夜，中途換液2_3次。
1. 7單抗特性的鑒定1. 7. 1單抗腹水效價測定采用間接ELISA的方法，將腹水先按1 50稀釋，再按2倍倍比稀釋，依次加入包 被抗原的酶標(biāo)孔內(nèi)，其他步驟同1.4。1.7. 2單抗特異性鑒定取純化的PPV、PRV、PCV-2、CSFV以及PRRSV包被96孔酶標(biāo)板，分別對單抗進行間 接ELISA試驗。1. 7. 3間接免疫熒光試驗在24孔板培養(yǎng)Marc-145并接種適量PRRSV，同時設(shè)未接毒的正常細胞作為陰性 對照；培養(yǎng)3天至80%病變時棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，每次5分鐘，用-20°C預(yù)冷的丙 酮乙醇(3 2)室溫固定IOmin ；用PBS洗滌3次，每次5分鐘，在吸水紙上拍干，分別滴 加1 600稀釋的腹水單抗，37°C作用45min ；用PBS洗滌3次，每次5min，在吸水紙上拍 干，加入1 200稀釋的羊抗鼠FITC-IgG作用45min;用PBS洗滌3次，每次5min，在吸水 紙上拍干，在熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)特異性的亮綠色熒光者為陽性，反之判為陰性。1. 7. 4ffestern-blot制備SDS-PAGE電泳凝膠，每孔加入10 μ 1提純的PRRSV或蛋白質(zhì)Marker，電泳，轉(zhuǎn) 印硝酸纖維素(NC)膜。用去離子水漂洗NC膜，4°C封閉過夜；用PBST洗3次，每次5min， 以單抗為一抗(1 100稀釋)，37°C作用Ih ；用PBST洗3次，每次5min ；NC膜放入HRP標(biāo) 記的羊抗鼠IgG(l 5000稀釋)溶液中，37°C作用Ih;用PBST洗3次，每次5分鐘，將NC 膜轉(zhuǎn)移至新鮮配制的底物顯色液中避光顯色，至條帶清晰時用蒸餾水終止反應(yīng)。1. 7. 5亞類鑒定按單克隆抗體亞類試劑盒說明書介紹的方法進行。具體方法如下酶標(biāo)板內(nèi)分別 加入1 5000單抗腹水IOOuL/孔，37°C孵育1小時，PBST洗滌3次，每次5min ；分別加入 工作濃度羊抗鼠IgG^ IgG2a、IgG2b, IgG3、IgM、IgA亞類血清100 μ L/孔，每株單抗加每種亞 類兩孔，37°C孵育30min，PBST洗滌3次，每次5min ；加入工作濃度兔抗羊辣根過氧化物酶 結(jié)合物100μ 1/孔，37°C孵育15min，PBST洗滌3次，每次5min ；加TMB顯色液100 μ 1/孔， 37°C避光顯色5-10min ；用2M H2SO4IOOuI/孔終止反應(yīng)；在450nm波長下測定OD值。以O(shè)D 值明顯高于其他孔者所加亞類血清為單抗亞類。1. 7. 6雜交瘤細胞分泌抗體的穩(wěn)定性鑒定將雜交瘤細胞進行連續(xù)傳代，每隔一周測定其間接ELISA效價，一直傳至30代以 評價其分泌抗體的穩(wěn)定性。2實驗結(jié)果2. IPRRSV的擴增和純化按照Reed-Muench法計算出細胞培養(yǎng)的PRRSV為104 88TCID5(1/100 μ 1。經(jīng)純化的 PRRSV 濃度為 1. 8mg/ml。2. 2雜交瘤細胞株的建立以間接ELISA方法篩選雜交瘤細胞，經(jīng)3次亞克隆共得到10株陽性的雜交瘤細胞 系，分別命名為 P1A1、P1A2、P1C5、P2D3、P2G7、P5E5、P6G7、P7F2、P7E8 和 WH4。2. 3單抗腹水效價測定
將腹水倍比稀釋，采用間接ELISA的方法確定陽性反應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)即為其效 價。結(jié)果如表1。表1單抗腹水ELISA效價 2. 4單抗特異性鑒定采用間接ELISA方法，顯示10株單克隆抗體均僅與PRRSV反應(yīng)，而不與PPV、PRV、 PCV2、CSFV 反應(yīng)。2. 5間接免疫熒光試驗用感染PRRSV的Marc-145細胞與1 600稀釋的腹水單抗做間接免疫熒光試驗， 感染病毒的細胞顯示特異性熒光，而未感染病毒的對照組細胞無特異性熒光出現(xiàn)。2. 7ffestern-blotting單抗P2D3均可以和PRRSV約15kDa的蛋白帶呈陽性反應(yīng)。說明該單抗針對PRRSV N蛋白，且具有良好的反應(yīng)性和特異性。2. 8單抗亞類鑒定按單克隆抗體亞類試劑盒說明書介紹的方法對單抗進行亞類鑒定，結(jié)果顯示單抗 P2D3 為 IgG。2. 9雜交瘤細胞分泌抗體的穩(wěn)定性鑒定單抗P2D3雜交瘤細胞傳30代仍能穩(wěn)定分泌抗體。實施例2 檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多抗/單抗捕獲抗原ELISA方法建立1實驗方法1. 1兔抗PRRSV多抗血清的制備1. 1.2免疫程序純化的病毒抗原經(jīng)弗氏佐劑乳化后，采用皮下注射的方式對兔子進行免疫，免疫 程序為取含適量純化的抗原(3mg左右)與弗氏完全佐劑充分乳化，皮下分點注射首免； 20天后、40天后以相同方法使用弗氏不完全佐劑乳化的抗原再各免疫一次；60天后頸動脈 插管收集全身血液，4°C靜置過夜后3000g離心15min收集血清。1. 1.3多抗血清的純化
多抗血清采用Protein G親和層析方法進行純化。具體方法如下。輕柔顛倒裝 有Protein G親和樹脂的容器數(shù)次以混合樹脂使其完全懸浮。將適量Protein G樹脂裝 入層析柱中，加入5ml的結(jié)合緩沖液平衡柱子。使用相同或者更多體積的結(jié)合緩沖液稀 釋多抗血清樣品，上樣。上樣后用IOml結(jié)合緩沖液洗柱子。結(jié)合緩沖液流盡后，用IOml 的洗脫緩沖液洗脫抗體，收集洗脫產(chǎn)物。洗脫過程中實時檢測洗脫液的PH值，及時用IM Tris-Cl(pH8. 5)中和洗脫液，使含洗脫產(chǎn)物的洗脫液的pH為7. 4。洗脫液裝入透析袋，使 用0. OlM的Tris-Cl緩沖液(pH7. 4)4°C透析過夜，中途換液2_3次。1. 2ELISA方法的建立1. 2. IELISA 的一般流程單抗包被_洗板_封閉-洗板_加抗原_洗板_加多抗_洗板_加酶標(biāo)二抗_洗 板-顯色-終止-判定結(jié)果。1. 2. 2單抗與多抗最佳工作濃度的確定用方陣試驗確定單抗與多抗最佳工作濃度。①包被用包被液將單抗作1 200、1 400、1 800、1 1600、1 3200、 1 6400、1 12800稀釋，100 μ 1/孔，每個稀釋度一行，37°C包被2h后4°C過夜；輕柔而 果斷地甩出孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，5min/次，在吸水紙上拍干。②封閉用10%小牛血清作封閉劑，200 μ 1/孔，37°C封閉2h，同上洗滌三次，拍干。③加抗原用稀釋液將純化的PRRSV病毒和陰性細胞抗原以相同濃度(4. 5 μ g/ml) 相間加入一塊酶標(biāo)板中，100 μ L/孔，同時設(shè)PBS空白對照，37°C作用30min，同上洗滌三次， 拍干。④加多抗用稀釋液將多抗作1 200、1 400、1 800、1 1600、1 3200稀釋， 加入酶標(biāo)板中，100 μ 1孔，每個稀釋度作兩列，同時設(shè)PBS空白對照，37°C作用30min，同上 洗滌三次，拍干。⑤加酶標(biāo)二抗加入1 5000稀釋的HRP—羊抗兔IgG，100 μ 1/孔，37 °C作用 30min，同上洗滌三次，拍干。⑥顯色與終止加入TMB顯色液100 μ 1孔，室溫避光作用10 15min，加入終止液 (2MH2S04)，50 μ 1/孔，在酶標(biāo)儀上讀取OD徹。以陽性孔OD值接近1，Ρ/Ν值最大時，單抗和 多抗的濃度組合為其最佳工作濃度。1.2. 3封閉液的選擇根據(jù)確定的單抗和多抗的最佳工作濃度組合，分別以4 %明膠-PBST、1 % BSA-PBST、5 %脫脂乳-PBST、5 %小牛血清-PBST和10 %小牛血清-PBST作為封閉劑作 ELISA檢測， 陽性孔OD值接近1，Ρ/Ν值最大所對應(yīng)的封閉劑為最佳封閉劑。1.2. 4封閉時間的選擇根據(jù)確定的單抗和多抗的最佳工作濃度組合以及封閉液，將封閉時間設(shè)為60min、 90min, 120min分別進行ELISA檢測，以陽性孔OD值接近1，P/N值最大所對應(yīng)的封閉時間 為最佳封閉時間。1. 2. 5檢測抗原、多抗、酶標(biāo)抗體作用時間的選擇在確定好ELISA單抗、多抗組合、封閉液和封閉時間后，對檢測抗原、多抗和酶標(biāo) 抗體的采用不同的作用時間(30min、60min，90min)分別進行ELISA檢測，以陽性孔OD值接近1，P/N值最大所對應(yīng)的封閉時間為最佳作用時間。為了便于比較結(jié)果，檢測抗原、多抗和 酶標(biāo)抗體三者的作用時間保持一致。1. 2. 6陰陽性判斷標(biāo)準的建立取89份經(jīng)RT-PCR檢測不含PRRSV的病料為陰性樣品，用所建立ELISA方法進行 實驗，測得OD450值，計算平均OD值。則陽性樣品OD值下限=陰性樣品平均OD值+3標(biāo)準 差(SD)。1.3特異性試驗分別以相同濃度(4.5 μ g/mL)的 PRRSV、PPV、PRV、PCV1、PCV2 和 CSFV 作為檢測抗 原，同時設(shè)空白對照，用所建立的ELISA方法進行試驗。其中PRRSV采用本室保存的JSDT-1， YZ⑶-2，ZJ-I，YXAC-2，HH-I等5個PRRSV毒株(“豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白基 因的原核表達及其單克隆抗體的研制”，2008-12-16，中國知識資源總庫-中國優(yōu)秀碩士學(xué) 位論文全文數(shù)據(jù)庫，www. cnki. net，作者姜麗英，指導(dǎo)教師吳艷濤。申請人保存)。1.4敏感性試驗①將純化的PRRSV連續(xù)倍比稀釋成不同的濃度，用建立的ELISA方法來檢出最低 檢出量，操作過程中設(shè)陰性對照。②以大腸桿菌表達的PRRSVN蛋白為檢測抗原(濃度為IOOng 0. Ing)，用建立的 ELISA方法來檢出最低檢出量，操作過程中設(shè)陰性對照。1. 5DAS-ELISA 檢測 PRRSV 的初步應(yīng)用1. 5. IRT-PCR 檢測 PRRSV 方法的建立根據(jù)GenBank中ATCC VR-2332的基因組序列，應(yīng)用Premier5. 0軟件設(shè)計了 1對 擴增0RF-7基因的引物，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下上游(Pl)5' -TCCATGCCAAATAACAACGGCAA-3 ‘下游(P2)5'-GTCGACTCATGCTGAGGGTGA-3 ‘取250 μ 1病毒的細胞培養(yǎng)物或病料上清，加入Trizol 450 μ 1，顛倒混勻，室溫靜 置IOmin ；再加入氯仿200 μ 1，顛倒混勻，12000rpm離心IOmin ；取上清，加入2倍體積的 異丙醇，反復(fù)顛倒混勻，-20°C靜置5min，12000rpm離心IOmin ；棄去上清，Iml 70%乙醇， 12000rpm離心5min ；棄去上清，置超凈臺揮發(fā)干；用50 μ 1經(jīng)DEPC處理的超純水充分懸浮 沉淀，立即使用或置-70°C保存。取以上提取的病毒基因組RNA 17μ 1，加入隨機引物1μ l(50ng)，輕輕混勻后置 于70°C恒溫金屬浴中變性5min，立即冰浴5min，然后依次加入以下試劑5 X A M V reverse transcriptase reaction buffer 5 μ 1dNTPs(10mM) 1 μ 1RNasin(40U/y 1 ) 0. 5μ 1AMV reverse transcriptase (IOU / μ 1) 0. 5μ 1用手指輕撥混勻，瞬時低速離心，置40°C水浴中反應(yīng)1. 5h，后取出95°C作用5minm
m
polymeras
(5 U
μ 1 )
W
以滅活殘余的反轉(zhuǎn)錄酶。待產(chǎn)物冷卻后直接進行以下PCR反應(yīng)，或者暫存于-20°C。PCR 50 μ 1反應(yīng)體系如下10XPCRbuffer 5 μ 1dNTPs(IOmM) 1 μ 1cDNA
4μ 1P ！ ( 2
1 μ 1P 2 ( 2
1 μ 1Taq DNA
1 μ 1S
37 μ 1輕輕混勻后，按下列反應(yīng)參數(shù)進行PCR擴增94°C預(yù)變性5min ；94°C變性45s， 58°C退火45，72°C Imin延伸，共35個循環(huán)；72°C延伸7min。4°C短期保存。取RT-PCR 產(chǎn)物 45 μ 1，加 IOX loading buffer 5 μ 1 混勻，瓊脂糖凝膠(含溴 化乙錠0. Syg/ml)電泳，恒壓65伏電泳2h。通過電泳結(jié)果判定是否有PRRSV。1. 5. 2人工感染PRRSV實驗豬病料的檢測5頭經(jīng)檢測未感染PRRSV的2月齡豬隨機分成兩組。一組的4頭豬肌肉注射5ml 100個TCID5tl劑量的PRRSV細胞毒。另一組的豬注射相同量的PBS作為陰性對照。14天
7 50
后撲殺剖檢，采集其其心、肝、脾、腎、腦、肺、扁桃體、淋巴結(jié)等組織作為被檢材料。將豬的淋 巴結(jié)和肺組織等病料研磨至糊狀，與等體積樣品裂解液(1%NP-40、1M NaClUM Tris-Cl, ρΗ7· 5)混合；經(jīng)反復(fù)凍融3次后，4000rpm離心30min。取100 μ 1上清液進行ELISA檢測， 同時再取100 μ 1上清液進行RT-PCR檢測。1. 5. 3對臨床病料的檢測300份于2008和2009年在中國各地收集的疑似PRRSV感染的豬的病料樣品(主 要是淋巴結(jié)和肺)用所建立的方法進行檢測。這些樣品來源于有疑似PRRSV感染的豬場。 所有樣品同時采用RT-PCR的方法進行檢測，同ELISA方法進行比較。1. 5. 4仔豬免疫弱毒疫苗后排毒的檢測20頭25日齡的SPF豬隨機分成兩組，第一組的豬每頭肌肉注射Iml弱毒疫苗 JXAl-R(揚州威克公司提供)，另一組的豬注射相同劑量的PBS作為陰性對照。在免疫3，6， 9，12，15，18，21天后，分別采集豬的全血樣品，與等體積樣品裂解液(1% NP_40、1M NaCl, IMTris-Cl, ρΗ7· 5)混合；經(jīng)反復(fù)凍融3次后，4000rpm離心30min。分別取100 μ 1上清液 用所建立的ELISA方法和RT-PCR方法進行檢測。2實驗結(jié)果2. 1多抗的制備及純化
對采用Protein G親和層析法純化的兔抗PRRSV多抗?jié)舛葹?. 8mg/ml。2. 2ELISA方法的建立2. 2. 1單抗和多抗最佳工作濃度測定結(jié)果經(jīng)方陣試驗測定，采用P2D3單抗和多抗組合，單抗包被量為200ng(l 400稀 釋)，多抗用量為475ng(l 800稀釋)時，P/N值最大為12.37 (表2)。表2單抗和多抗最佳工作濃度組合的確定* *表中反映了不同工作濃度組合時P/N的值。2. 2. 2最佳封閉液的確定根據(jù)確定的單抗和多抗的最佳工作濃度組合，分別以4%明膠-PBSTU % BSA-PBST、5 %脫脂乳-PBST、5 %小牛血清-PBST和10 %小牛血清-PBST作為封閉劑作 ELISA檢測。不同封閉液作用后，P/N的值不同(見表3)，小牛血清作為封閉液的結(jié)果明顯 優(yōu)于其他幾種封閉液，且10%小牛血清的封閉效果要優(yōu)于5%小牛血清。表3最佳封閉液的確定 2. 2. 3最佳封閉時間的確定根據(jù)確定的單抗和多抗的最佳工作濃度組合以及封閉液，采用不同的封閉時間進 行ELISA檢測。封閉時間不同，P/N的值也不同(結(jié)果見表4)。封閉時間采用120min時，
效果最佳。表4最佳封閉時間的確定 2. 2. 4檢測抗原、多抗、酶標(biāo)抗體作用時間的確定在確定好ELISA單抗、多抗組合、封閉液和封閉時間后，對檢測抗原、多抗和酶標(biāo) 抗體的采用不同的作用時間進行ELISA檢測。不同作用時間的P/N值差別不是很大(表 5)?？紤]到在臨床上應(yīng)用時需快速敏感得出結(jié)果，因此采用30min的作用時間較為適宜。表5檢測抗原、多抗、酶標(biāo)抗體作用時間確定 2. 2. 5陰陽性判定標(biāo)準的確立89份陰性樣品的平均OD值為0. 190，標(biāo)準差SD為0. 030，因此陽性判斷標(biāo)準為 0. 280(0. 190+0. 090)。檢測樣品的OD值在0. 280以上時可以判斷為陽性。2. 3ELISA試驗特異性用PRRSV、PPV, PRV, PCVU PCV2 和 HCV 作為檢測抗原進行 ELISA 檢測。PPV、PRV, PCVU PCV2和HCV結(jié)果均為陰性反應(yīng)。5個不同的PRRSV毒株檢測結(jié)果均為為陽性，其OD 值在1. 116至1.523之間(表6)。表6特異性試驗驗結(jié)果 2.4ELISA試驗敏感性建立的ELISA試驗最低檢出純化PRRSV的濃度為0.2 μ g/ml (表7)，最低檢出大腸 桿菌表達的PRRSV N蛋白為lng/ml (表8)。試驗也說明建立的ELISA試驗可用于檢測大腸 桿菌表達的PRRSV N蛋白。表7敏感性試驗結(jié)果(1) a 純化 PRRSV 的濃度μ g/ml表8敏感性試驗結(jié)果(2) 13大腸桿菌表達的PRRSVN蛋白濃度2. 5人工感染PRRSV實驗豬病料的檢測ELISA被用來檢測實驗豬組織樣品。陰性對照組的樣品經(jīng)ELISA和RT-PCR檢測均 為陰性。ELISA檢測實驗攻毒的豬的組織樣品的結(jié)果顯示，不同的豬不同組織內(nèi)PRRSV陽性 檢出率不同(表12)。肺門淋巴結(jié)、肺、血液及腹股溝淋巴結(jié)的檢出率高達100%，而腦和胃 的檢出率為0%。RT-PCR檢測結(jié)果同ELISA檢測結(jié)果相一致。表8不同組織PRRSV檢出率ialR樣品數(shù)量 陽性樣品數(shù) 陽性率
2. 6臨床樣品的檢測結(jié)果300份從臨床上收集的豬肺或者淋巴結(jié)樣品分別采用DAS-ELISA和RT-PCR方法進 行檢測。DAS-ELISA檢測顯示有159份樣品呈PRRSV陽性，而RT-PCR檢測結(jié)果表明有165份 樣品呈陽性。兩者檢測均呈陽性的共有155份樣品，因此兩種方法的符合率為95. 7% (表 9)。表 9ELISA 和 RT-PCR 檢測 PRRSV 的比較
2. 7實驗豬免疫弱毒疫苗后排毒情況的檢測免疫組的豬在免疫3天和6天后用建立的ELISA方法均仍能夠從血液樣品中檢測 到PRRSV弱毒疫苗毒，而在免疫9，12，15，18，21天后均檢測不到。陰性對照組的豬的血液 樣品均未檢測到PRRSV。RT-PCR檢測結(jié)果同ELISA檢測結(jié)果一致。
權(quán)利要求
一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ELISA試劑盒，其特征在于包被PRRSV N蛋白單克隆抗體的酶標(biāo)板、PRRSV多克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、洗滌液、顯色液、終止液、樣品裂解液、陽性對照、陰性對照。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于包被在酶標(biāo)板上的PRRSVN蛋白單克隆抗體是由雜交瘤細胞株P(guān)2D3分泌獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于PRRSV多克隆抗體由以下方法制備利用Marc-145細胞培養(yǎng)PRRSV SHY-I株，以超速 離心純化的PRRSV為抗原，與弗氏完全佐劑充分乳化后，免疫60日齡家兔；20天后、40天 后以以同樣的抗原與弗氏不完全佐劑乳化，各加強免疫一次；60天采血，分離血清；采用 Protein G親和層析純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)板的準備按以下進行將單抗P2D3按每孔200ng/100 μ 1包被96孔酶標(biāo)板，包被 液為0. IM ρΗ 9.6碳酸鹽緩沖液，371包被2小時；酶標(biāo)板在371下以每孔20(^1的含 10%小牛血清ρΗ 7. 5PBS封閉2小時；以ρΗ 7. 5PBST洗滌3次，立即使用或貯藏于_20°C
5.權(quán)利要求1的試劑盒的使用方法是將待測樣品加入酶標(biāo)板，每孔100 μ 1，37°C孵育30分鐘；以PBST洗滌3次；每孔加入 475ng/100y 1多抗，37°C孵育30分鐘；以PBST洗滌3次；每孔加入1 5000稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 100 μ 1，37°C孵育30分鐘；以PBST洗滌3次；每孔加入100 μ 1ΤΜΒ,顯 色10分鐘；加50 μ 1 2Μ H2SO4中止反應(yīng)，讀取450nm光密度值；OD值在0. 280以上時判斷 為陽性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ELISA試劑盒及檢測方法，該試劑盒包括包被PRRSV單克隆抗體的酶標(biāo)板、PRRSV多克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、洗滌液、顯色液、終止液、樣品裂解液、陽性對照和陰性對照。本發(fā)明的試劑盒不僅利用單抗的高度特異性，而且利用多抗針對更多病毒抗原結(jié)合位點的特性，因此捕獲抗原的能力強，檢測敏感性為0.2μg/ml病毒蛋白或0.1ng/ml大腸桿菌表達的PRRSV N蛋白，與豬細小病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬瘟病毒無交叉反應(yīng)，適合于對臨床樣品的快速檢測。
文檔編號G01N33/577GK101915846SQ20101025243
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者吳艷濤, 姜麗英, 張小榮, 彭大新, 翁善鋼, 陳素娟 申請人:揚州大學(xué)