專利名稱：一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光十通道免疫層析的食源性致病菌檢測試紙盤的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光十通道免疫層析的食源性致病菌檢測試紙盤，其可經(jīng)一次加樣即完成樣品中十種食源性致病菌的定性定量檢測。
背景技術(shù)：
食品安全已成為全球重要的公共衛(wèi)生問題，食源性疾病是食品安全的主要問題， 世界衛(wèi)生組織將食源性疾病定義為“凡是通過攝食進(jìn)入人體的，使人體患感染性或中毒性的疾病?！边@里包括了由食品微生物污染和化學(xué)性物質(zhì)引起的食源性疾病。而微生物引起的食源性疾病是食品安全的主要問題。世界衛(wèi)生組織2002年3月公布，全球每年因食源性微生物污染引起的腹瀉病例達(dá)到數(shù)十億，死亡的0-15歲兒童約170萬。在發(fā)達(dá)國家至少有 1/3的人患食源性疾病，在食源性疾病上花費(fèi)達(dá)數(shù)十億美元。近年來，在國外食源性疾病事件頻頻發(fā)生，如英國的瘋牛病，日本的出血性大腸埃希氏菌0157:H7和雪印牛奶的葡萄球菌腸毒素中毒暴發(fā)，法國的李斯特氏菌中毒等。在我國盡管沙門氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌引起的食物中毒仍占主要位置，但近年來其它新的病原菌如出血性大腸埃希氏菌0157:H7、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等引起的食物中毒報(bào)道呈上升趨勢。1999年蘇皖等地引起的0157:H7大規(guī)模暴發(fā)流行，急性腎功能衰竭患者195人，死亡人數(shù)177人，病死率為 90. 8%。快速高效的對水源、食品以及食品加工、販?zhǔn)郗h(huán)境中的食源性致病菌進(jìn)行檢測與監(jiān)測是降低食源性疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。食源性致病菌檢測與常規(guī)病原體檢測的突出區(qū)別在于食源性致病菌種類繁多，因而監(jiān)測時(shí)無法針對性檢測只能大范圍篩查。如對人致病的沙門氏菌就包括甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌等十?dāng)?shù)種，此外還有霍亂弧菌、大腸桿菌、副溶血弧菌等等不一而足，而監(jiān)測樣品與環(huán)境中可能含有其中的任何一種或任何幾種。 傳統(tǒng)的單靶標(biāo)檢測技術(shù)，無論是核酸檢測還是免疫檢測，均需對一份樣品重復(fù)多次操作，方可完成多靶標(biāo)的一一檢測，這樣不僅增加監(jiān)測的繁冗費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且極易出現(xiàn)人工錯(cuò)誤、延長檢測時(shí)間、現(xiàn)場可操作性差。若一次加樣即可實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)的同步檢測，則可在最大程度上預(yù)防以及控制食源性疾病的發(fā)生。十通道免疫層析試紙盤是基于免疫層析技術(shù)的高通量檢測方法，其利用試紙盤的獨(dú)特內(nèi)部設(shè)計(jì)使得樣品在各通道內(nèi)試紙之間的均勻分配以及后續(xù)的同步層析得以實(shí)現(xiàn)，由此將免疫層析的快速便捷與高通量得以融合(見附圖1)。然而，傳統(tǒng)免疫層析中所使用的膠體金、染料等顏色示蹤物則由于敏感性低、穩(wěn)定性差、無法定量等缺陷限制了這一技術(shù)的發(fā)展。上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料(Up-Converting Phosphor，UCP)的出現(xiàn)彌補(bǔ)了這一不足。UCP顆粒是一種稀土金屬的雜合晶體顆粒，其由于獨(dú)特的化學(xué)組成以及物理結(jié)構(gòu)，因而具有了自然界中獨(dú)一無二的上轉(zhuǎn)換發(fā)光現(xiàn)象，即其可由低能的紅外光激發(fā)發(fā)射高能的可見光。這一上轉(zhuǎn)換發(fā)光的特性使UCP顆粒作為免疫層析的示蹤物可抵抗樣品的熒光背景干擾，因而保證了檢測的敏感性、穩(wěn)定性與特異性。此外，以光學(xué)信號取代顏色變化作為結(jié)果的指征，使得基于UCP顆粒的免疫層析可實(shí)現(xiàn)精確定量。若能將UCP顆粒與十通道免疫層析試紙盤相結(jié)合則可實(shí)現(xiàn)高通量的現(xiàn)場快速定量檢測。發(fā)明技術(shù)本發(fā)明目的在于公開一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光十通道免疫層析的食源性致病菌檢測試紙盤，其可克服在先技術(shù)無法實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的高通量現(xiàn)場檢測以及傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)敏感性低、穩(wěn)定性差、不可定量的問題，將UCP顆粒作為示蹤物與十通道免疫層析試紙盤相結(jié)合，最終實(shí)現(xiàn)了高通量的現(xiàn)場快速定量檢測。本發(fā)明食源性致病菌檢測試紙盤的結(jié)構(gòu)組成為試紙盤由上蓋[1]與底殼[2]構(gòu)成(如附圖2所示)，底殼[2]中均勻放置有針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌的十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]，每種單靶標(biāo)檢測試紙[3]針對一種食源性致病菌的特異性檢測；試紙盤內(nèi)十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]上放置有引流片W]，引流片[4]將上蓋[1]的加樣孔[5]與十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]的樣品墊[6]相互連通，保證液體樣品在十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]之間分配的均勻性；裝配完整的試紙盤中，加樣孔[5]對應(yīng)于引流片W]，結(jié)果掃描窗[7]對應(yīng)于分析膜[8]，終點(diǎn)指示窗[9]對應(yīng)于吸水墊[10]。單靶標(biāo)檢測試紙的結(jié)構(gòu)組成為樣品墊W]、結(jié)合墊[11]、分析膜[8]、吸水墊[10] 和粘性底襯[12]。其中，樣品墊[6]是具有較大床體積且微觀結(jié)構(gòu)均勻的物質(zhì)吸水紙、纖維素膜、 玻璃纖維、無紡布或?yàn)V血膜。其中，結(jié)合墊[11]是具有較大床體積且微觀結(jié)構(gòu)均勻的物質(zhì)玻璃纖維、聚酯膜或無紡布；結(jié)合墊[11]中固定有UCP結(jié)合物[13] ；UCP結(jié)合物[13]由作為示蹤物的UCP顆粒[14]以及作為液相探針的某靶標(biāo)特異性抗體A[15]結(jié)合而成。其中，分析膜[8]是微觀結(jié)構(gòu)均勻的物質(zhì)硝酸纖維素膜或尼龍膜；其中，分析膜 [8]上設(shè)置有檢測帶T[16]與質(zhì)控帶C[17]；檢測帶T[16]為某靶標(biāo)特異性抗體Β[18]，質(zhì)控帶C[17]為某靶標(biāo)特異性抗體A的二抗[19]；檢測帶T[16]上的某靶標(biāo)特異性抗體Β[18] 作為固相探針與UCP結(jié)合物[13]上作為液相探針的某靶標(biāo)特異性抗體Α[15]可構(gòu)成雙抗體夾心模式對某靶標(biāo)進(jìn)行特異性的檢測，而質(zhì)控帶C[17]可與UCP結(jié)合物[13]直接結(jié)合用于質(zhì)控整個(gè)層析流程是否正常。其中，吸水墊[10]是具有較大床體積的物質(zhì)吸水紙或纖維素膜。其中，粘性底襯[12]是單面涂有壓力敏感膠的硬體材質(zhì)PVC板，其可使樣品墊 W]、結(jié)合墊[11]、分析膜[8]以及吸水墊[10]按照適當(dāng)?shù)闹丿B關(guān)系粘貼固定，從而保證液體在單靶標(biāo)檢測試紙內(nèi)部流動(dòng)的連續(xù)性。其中，UCP顆粒[14]可通過上轉(zhuǎn)換發(fā)光現(xiàn)象對樣品中某種靶標(biāo)[20]的存在與否以及濃度予以指示。其中，某靶標(biāo)特異性抗體A[15]與某靶標(biāo)特異性抗體B[18]，可為單抗也可為多抗，可相同也可不同。本發(fā)明食源性致病菌檢測試紙盤的制備方法為
A.結(jié)合墊[11]制備將針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌 0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌的十種UCP結(jié)合物[13]分別制備各自的結(jié)合墊，制備方法相同，均為將某種靶標(biāo)的UCP結(jié)合物[13]用結(jié)合物稀釋液稀釋至終濃度為0. 5-3mg/ml，結(jié)合物稀釋液為pH = 7. 20. 03M PB含1-10% BSA,0. 5-10%海藻糖、0. 5-10%蔗糖和0. 1-1% Tween20，將某種靶標(biāo)的UCP結(jié)合物[13]加于可作為結(jié)合墊 [11]的玻璃纖維、聚酯膜或無紡布上，于37-50°C下30min-;3h，烘干備用；B.分析膜[8]制備針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌分別制備各自的分析膜，制備方法相同， 均為將l-2mg/ml某靶標(biāo)特異性抗體B [18]、l_2mg/ml某靶標(biāo)特異性抗體A的二抗[19]噴點(diǎn)于可作為分析膜的硝酸纖維素膜或尼龍膜上分別作為檢測帶T[16]和質(zhì)控帶C[17]，于 ;35-40°C下 30min-90min，烘干備用；C.單靶標(biāo)檢測試紙[3]剪切成型針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌分別制備各自的單靶標(biāo)檢測試紙[3]，制備方法相同，均為將樣品墊[6]、結(jié)合墊[11]、分析膜[8]和吸水墊[10] 依次粘貼于粘性底襯[12]上，確保相互之間的重疊關(guān)系(如附圖3所示)；將單靶標(biāo)檢測試紙[3]剪切為4mm寬的成品；D.試紙盤裝配將與甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌對應(yīng)的十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]置于試紙盤底殼[2]上，確保每種試紙位置序號固定可查，將引流片[4]置于十種單靶標(biāo)檢測試紙 [3]上并與樣品墊[6]重疊，蓋上上蓋[1]即得本發(fā)明可對一份樣品進(jìn)行十種靶標(biāo)檢測的成品試紙盤。本發(fā)明食源性致病菌檢測試紙盤的制備方法優(yōu)選為A.結(jié)合墊[11]制備將針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌 0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌的十種UCP結(jié)合物[13]分別制備各自的結(jié)合墊，制備方法相同，均為將某種靶標(biāo)的UCP結(jié)合物[13]用結(jié)合物稀釋液稀釋至終濃度為2mg/ml，結(jié)合物稀釋液為pH = 7. 20. 03M PB含5% BSA、5%海藻糖、5%蔗糖和 0. 5% Tween20，將某種靶標(biāo)的UCP結(jié)合物[13]加于可作為結(jié)合墊[11]的玻璃纖維、聚酯膜或無紡布上，于40°C下濁，烘干備用；B.分析膜[8]制備針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌分別制備各自的分析膜，制備方法相同， 均為將1. 5mg/ml某靶標(biāo)特異性抗體B [18]、1. 5mg/ml某靶標(biāo)特異性抗體A的二抗[19]噴點(diǎn)于可作為分析膜的硝酸纖維素膜或尼龍膜上分別作為檢測帶T[16]和質(zhì)控帶C[17]，于 37°C下60min，烘干備用；
C.單靶標(biāo)檢測試紙[3]剪切成型針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌分別制備各自的單靶標(biāo)檢測試紙[3]，制備方法相同，均為將樣品墊[6]、結(jié)合墊[11]、分析膜[8]和吸水墊[10] 依次粘貼于粘性底襯[12]上，確保相互之間的重疊關(guān)系(如附圖3所示)；將單靶標(biāo)檢測試紙[3]剪切為4mm寬的成品；D.試紙盤裝配將與甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌對應(yīng)的十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]置于試紙盤底殼[2]上，確保每種試紙位置序號固定可查，將引流片[4]置于十種單靶標(biāo)檢測試紙 [3]上并與樣品墊[6]重疊，蓋上上蓋[1]即得本發(fā)明可對一份樣品進(jìn)行十種靶標(biāo)檢測的成品試紙盤。一種用食源性致病菌檢測試紙盤檢測食源性致病菌的方法A.樣品預(yù)處理水樣、食品、糞便樣品直接檢測或用增菌液增菌4h4h后再進(jìn)行檢測；B.樣品處理將0. 5-1. 5倍體積經(jīng)過預(yù)處理的樣品與1倍體積樣品處理液混合， 樣品處理液為 0. 03-0. 3M pH = 7. 2PB 含 0. 1-0. 5M NaCl,0. 1-1 % SDS,0. 1-1 % NP40 和 0. 1-1% Tween20 的混合液；C.添加樣品將處理后的液體樣品滴加至本發(fā)明食源性致病菌檢測試紙盤的加樣孔[5]中；D.層析反應(yīng)靜置10-20min待層析反應(yīng)完成；E.結(jié)果判讀(如附圖4所示)用上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器通過試紙盤上的結(jié)果掃描窗[7]依次對每個(gè)通道中試紙的分析膜[8]上的檢測帶T[16]與質(zhì)控帶C[17]進(jìn)行掃描分析，每掃描完一個(gè)通道即旋轉(zhuǎn)36度進(jìn)行下一個(gè)通道的掃描；定性檢測對某種靶標(biāo)而言只有質(zhì)控帶C[17]有信號產(chǎn)生，則樣品為某種靶標(biāo)陰性；若檢測帶T[16]與質(zhì)控帶C[17]均有信號產(chǎn)生，則樣品為某種靶標(biāo)陽性；若檢測帶 T[16]與質(zhì)控帶C[17]均無信號產(chǎn)生，則層析系統(tǒng)異常檢測失敗，需進(jìn)行再次檢測；某幾種靶標(biāo)檢測均為陽性，則說明該樣品中同時(shí)存在某幾種靶標(biāo)；定量檢測在某種靶標(biāo)檢測中將檢測帶T[12]、質(zhì)控帶C[17]的信號強(qiáng)度(即峰面積)依次賦值于T、C，τ/c值即為檢測值，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)濃度菌液標(biāo)定并繪制定量曲線后，通過任意樣品的檢測值即可獲得該樣品中十種食源性致病菌的有無及具體濃度，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測。一種用食源性致病菌檢測試紙盤檢測食源性致病菌的方法優(yōu)選為A.樣品預(yù)處理水樣、食品、糞便樣品直接檢測或用增菌液增菌4. 5h后再進(jìn)行檢測；B.樣品處理將1倍體積經(jīng)過預(yù)處理的樣品與1倍體積樣品處理液混合，樣品處理液為 0. IM pH = 7. 2PB 含 0. 2M NaCl,0. 1% SDS,0. 3% NP40，0. 2% Tween20 的混合液；C.添加樣品將處理后的液體樣品滴加至本發(fā)明食源性致病菌檢測試紙盤的加樣孔[5]中；
D.層析反應(yīng)靜置15min待層析反應(yīng)完成；E.結(jié)果判讀(如附圖4所示)用上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器通過試紙盤上的結(jié)果掃描窗[7]依次對每個(gè)通道中試紙的分析膜[8]上的檢測帶T[16]與質(zhì)控帶C[17]進(jìn)行掃描分析，每掃描完一個(gè)通道即旋轉(zhuǎn)36度進(jìn)行下一個(gè)通道的掃描；定性檢測對某種靶標(biāo)而言只有質(zhì)控帶C[17]有信號產(chǎn)生，則樣品為某種靶標(biāo)陰性；若檢測帶T[16]與質(zhì)控帶C[17]均有信號產(chǎn)生，則樣品為某種靶標(biāo)陽性；若檢測帶 T[16]與質(zhì)控帶C[17]均無信號產(chǎn)生，則層析系統(tǒng)異常檢測失敗，需進(jìn)行再次檢測；某幾種靶標(biāo)檢測均為陽性，則說明該樣品中同時(shí)存在某幾種靶標(biāo)；定量檢測在某種靶標(biāo)檢測中將檢測帶T[12]、質(zhì)控帶C[17]的信號強(qiáng)度(即峰面積)依次賦值于T、C，τ/c值即為檢測值，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)濃度菌液標(biāo)定并繪制定量曲線后，通過任意樣品的檢測值即可獲得該樣品中十種食源性致病菌的有無及具體濃度，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測。本發(fā)明食源性致病菌檢測試紙盤的檢測原理為(如附圖5所示)檢測中將液體樣品添加至試紙盤的加樣孔[5]中，加樣孔[5]下連通的引流片[4] 將液體樣品均勻分配至甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、 傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01 群、霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌對應(yīng)的每個(gè)單靶標(biāo)檢測試紙[3]的樣品墊W]，液體樣品自樣品墊[6]滲透入結(jié)合墊[11]；在液體樣品基質(zhì)的作用下，結(jié)合墊[11]中固定的 UCP結(jié)合物[13]將重新溶解游離，并同樣品一同離開結(jié)合墊[11]進(jìn)入分析膜[8]，在毛細(xì)作用下，通過檢測帶T[16]、質(zhì)控帶C[17]向吸水墊[10]的方向涌動(dòng)；在這一過程中，檢測帶T[16]/質(zhì)控帶C[17]、UCP結(jié)合物[13]、樣品中的某靶標(biāo)[20]之間將發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生可檢測的信號1、某靶標(biāo)陰性的樣品(圖5A)樣品中不含有某靶標(biāo)[20]，因而檢測帶T[16]即作為固相探針的某靶標(biāo)特異性抗體Β[18]與UCP結(jié)合物[13]中作為液相探針的某靶標(biāo)特異性抗體Α[15]之間無法發(fā)生結(jié)合，UCP結(jié)合物[13]只能流過檢測帶Τ[16]；而質(zhì)控帶C[17] 上的某靶標(biāo)特異性抗體A的二抗[19]則可與UCP結(jié)合物[13]上的某靶標(biāo)特異性抗體A[15] 直接結(jié)合，由此通過免疫反應(yīng)將UCP顆粒[14]固定于質(zhì)控帶C[17]上，從而產(chǎn)生可檢測的信號；最終，對于某靶標(biāo)陰性的樣品而言，只有質(zhì)控帶C[17]上有信號產(chǎn)生；2、某靶標(biāo)陽性的樣品(圖5B)樣品中含有某靶標(biāo)[20]，因而檢測帶T[16]即作為固相探針的某靶標(biāo)特異性抗體Β[18]與UCP結(jié)合物[13]中作為液相探針的某靶標(biāo)特異性抗體Α[15]之間可通過雙抗體夾心模式的免疫反應(yīng)將UCP顆粒固定于檢測帶Τ[16]上，從而產(chǎn)生可檢測的信號；而質(zhì)控帶C[17]上的某靶標(biāo)特異性抗體A的二抗[19]也可與UCP結(jié)合物[13]上的某靶標(biāo)特異性抗體A[15]直接結(jié)合，由此同樣通過免疫反應(yīng)將UCP顆粒[14] 固定于質(zhì)控帶C[17]上，進(jìn)而產(chǎn)生可檢測的信號；最終，對于某靶標(biāo)陽性的樣品而言，檢測帶T[16]與質(zhì)控帶C[17]上均有信號產(chǎn)生。本發(fā)明基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光十通道免疫層析的食源性致病菌檢測試紙盤通過UCP顆粒與十通道免疫層析試紙盤的結(jié)合使得一次加樣即可實(shí)現(xiàn)十種靶標(biāo)的檢測，實(shí)現(xiàn)了高通量的現(xiàn)場快速定量檢測。而具有極強(qiáng)兼容性的樣品處理液則保證了檢測結(jié)果的特異性與敏感性。最終為食源性病原體的現(xiàn)場檢測、監(jiān)測提供了有效的技術(shù)手段，有助于食源性疾病的預(yù)防與控制。
圖1 十通道免疫層析試紙盤圖2 食源性致病菌檢測試紙盤結(jié)構(gòu)圖；圖3 單靶標(biāo)檢測試紙粘帖示意圖；圖4 食源性致病菌檢測試紙盤定性定量檢測示意圖；圖5 食源性致病菌檢測試紙盤檢測原理圖；圖6 食源性致病菌檢測試紙盤靈敏度與定量能力；圖7 食源性致病菌檢測試紙盤特異性評價(jià)。下述實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)例1 本發(fā)明基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光十通道免疫層析的食源性致病菌檢測試紙盤的靈敏度與定量能力評價(jià)實(shí)驗(yàn)1、標(biāo)準(zhǔn)菌液樣品制備(1)用液體培養(yǎng)基分別培養(yǎng)甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、 霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌至對數(shù)中期；(2) SOOOrpm, 5min離心濃縮；單增李斯特菌不經(jīng)濃縮直接進(jìn)行后續(xù)操作；(3)平板計(jì)數(shù)，確定準(zhǔn)確的菌液濃度； (4)用液體培養(yǎng)基將菌濃度分別調(diào)至Ocfu/ml (即液體培養(yǎng)基)、104cfu/ml、 105cfu/ml、106cfu/ml、107cfu/ml，以此作為靈敏度以及定量能力評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)品。2、使用本發(fā)明實(shí)施例1制備的基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光十通道免疫層析的食源性致病菌檢測試紙盤對系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，操作流程如下(1)樣品處理將1倍體積經(jīng)過預(yù)處理的樣品與1倍體積樣品處理液(0. IM pH = 7. 2PB 含 0. 2M NaCl,0. 1% SDS,0. 3% NP40，0. 2% Tween20)混合；(2)添加樣品將處理后的液體樣品滴加1000 μ 1至試紙盤的加樣孔中上，每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次；(3)層析反應(yīng)靜置15min待層析反應(yīng)完成；(4)結(jié)果判讀用上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器對試紙盤進(jìn)行掃描，檢測結(jié)果以Tl/ Cl—T10/C10 值表示；3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖6所示(1)判定值的確定以空白樣品(液體培養(yǎng)基)三次檢測值T/C的均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差(S+3SD )作為判定值，十種單靶標(biāo)檢測試紙的判定值均為0. 3，T/C大于0. 3則為某種靶標(biāo)陽性，T/C小于0. 3則為某種靶標(biāo)陰性；(2)靈敏度評價(jià)十種食源性致病菌104Cfu/ml時(shí)的T/C值均大于0. 3，因而基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光十通道免疫層析的食源性致病菌檢測試紙盤對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群、霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌的檢測靈敏度均可達(dá)到 104cfu/ml ；(3)定量能力評價(jià)以T/C值作為X，以L0G(cfu/ml)作為y，繪制標(biāo)準(zhǔn)定量曲線并經(jīng)統(tǒng)計(jì)擬合，即可獲得十種食源性致病菌各自對應(yīng)的定量擬合公式，其擬合決定系數(shù)R2為 0. 9384-0. 9974，由此說明基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光十通道免疫層析的食源性致病菌檢測試紙盤具有較為準(zhǔn)確的定量能力，最終檢測時(shí)將某樣品的T1/C1-T10/C10依次帶入十個(gè)定量公式， 即可確定某份樣品中十種食源性致病菌的有無以及具體濃度；實(shí)驗(yàn)例2 本發(fā)明基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光十通道免疫層析的食源性致病菌檢測試紙盤的特異性評價(jià)實(shí)驗(yàn)1、標(biāo)準(zhǔn)菌液樣品制備(1)用液體培養(yǎng)基分別培養(yǎng)甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、 霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌至對數(shù)中期；(2) SOOOrpm, 5min離心濃縮；單增李斯特菌不經(jīng)濃縮直接進(jìn)行后續(xù)操作；(3)平板計(jì)數(shù)，確定準(zhǔn)確的菌液濃度；(4)用液體培養(yǎng)基將菌濃度分別調(diào)至Ocfu/ml (即液體培養(yǎng)基)、104cfu/ml、 105cfu/ml, 106cfu/ml, 107cfu/ml,以此作為特異性評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)品；2、使用本發(fā)明實(shí)施例1制備的基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光十通道免疫層析的食源性致病菌檢測試紙盤對系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，操作流程如下(1)樣品處理將1倍體積經(jīng)過預(yù)處理的樣品與1倍體積樣品處理液(0. IM pH = 7. 2PB 含 0. 2M NaCl,0. 1% SDS,0. 3% NP40，0. 2% Tween20)混合；(2)添加樣品將處理后的液體樣品滴加1000 μ 1至試紙盤的加樣孔中上；(3)層析反應(yīng)靜置15min待層析反應(yīng)完成；(4)結(jié)果判讀用上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器對試紙盤進(jìn)行掃描，檢測結(jié)果以Tl/ Cl—T10/C10 值表示；3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖7所示，本發(fā)明基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光十通道免疫層析的食源性致病菌檢測試紙盤各檢測指標(biāo)特異性良好，不存在非特異交叉的干擾。下述實(shí)施例均能實(shí)現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)例所述的效果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 本發(fā)明食源性致病菌檢測試紙盤的制備本發(fā)明食源性致病菌檢測試紙盤的結(jié)構(gòu)組成為試紙盤由上蓋[1]與底殼[2]構(gòu)成(如附圖2所示)，底殼[2]中均勻放置有針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌的十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]，每種單靶標(biāo)檢測試紙[3]針對一種食源性致病菌的特異性檢測；試紙盤內(nèi)十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]上放置有引流片W]，引流片[4]將上蓋[1]的加樣孔[5]與十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]的樣品墊[6]相互連通，保證液體樣品在十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]之間分配的均勻性；裝配完整的試紙盤中，加樣孔[5]對應(yīng)于引流片W]，結(jié)果掃描窗[7]對應(yīng)于分析膜[8]，終點(diǎn)指示窗[9]對應(yīng)于吸水墊[10]。單靶標(biāo)檢測試紙的結(jié)構(gòu)組成為樣品墊W]、結(jié)合墊[11]、分析膜[8]、吸水墊[10] 和粘性底襯[12]。其中，樣品墊[6]是吸水紙。其中，結(jié)合墊[11]是玻璃纖維；結(jié)合墊[11]中固定有UCP結(jié)合物[13] ；UCP結(jié)合物[13]由作為示蹤物的UCP顆粒[14]以及作為液相探針的某靶標(biāo)特異性抗體A[15]結(jié)合而成。其中，分析膜[8]是硝酸纖維素膜；其中，分析膜[8]上設(shè)置有檢測帶T [16]與質(zhì)控帶C[17]；檢測帶T[16]為某靶標(biāo)特異性抗體Β[18]，質(zhì)控帶C[17]為某靶標(biāo)特異性抗體A 的二抗[19]；檢測帶T[16]上的某靶標(biāo)特異性抗體Β[18]作為固相探針與UCP結(jié)合物[13] 上作為液相探針的某靶標(biāo)特異性抗體Α[15]可構(gòu)成雙抗體夾心模式對某靶標(biāo)進(jìn)行特異性的檢測，而質(zhì)控帶C[17]可與UCP結(jié)合物[13]直接結(jié)合用于質(zhì)控整個(gè)層析流程是否正常；其中，吸水墊[10]是吸水紙。其中，粘性底襯[12]是PVC板，其可使樣品墊W]、結(jié)合墊[11]、分析膜[8]以及吸水墊[10]按照適當(dāng)?shù)闹丿B關(guān)系粘貼固定，從而保證液體在單靶標(biāo)檢測試紙內(nèi)部流動(dòng)的連續(xù)性。其中，UCP顆粒[14]通過上轉(zhuǎn)換發(fā)光現(xiàn)象對樣品中某種靶標(biāo)[20]的存在與否以及濃度予以指示。其中，某靶標(biāo)特異性抗體A[15]與某靶標(biāo)特異性抗體B[18]，可為單抗也可為多抗，可相同也可不同。本發(fā)明食源性致病菌檢測試紙盤的制備方法為A.結(jié)合墊[11]制備將針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌 0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌的十種UCP結(jié)合物[13]分別制備各自的結(jié)合墊，制備方法相同，均為將某種靶標(biāo)的UCP結(jié)合物[13]用結(jié)合物稀釋液稀釋至終濃度為2mg/ml，結(jié)合物稀釋液為pH = 7. 20. 03M PB含5% BSA、5%海藻糖、5%蔗糖和 0.5% Tween20，將某種靶標(biāo)的UCP結(jié)合物[13]加于可作為結(jié)合墊[11]的玻璃纖維上，于 40°C下濁，烘干備用；B.分析膜[8]制備針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌分別制備各自的分析膜，制備方法相同， 均為將1. 5mg/ml某靶標(biāo)特異性抗體B[18]、1. 5mg/ml某靶標(biāo)特異性抗體A的二抗[19] 噴點(diǎn)于可作為分析膜的硝酸纖維素膜上分別作為檢測帶T[16]和質(zhì)控帶C[17]，于37°C下 60min，烘干備用；C.單靶標(biāo)檢測試紙[3]剪切成型針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌分別制備各自的單靶標(biāo)檢測試紙[3]，制備方法相同，均為將樣品墊[6]、結(jié)合墊[11]、分析膜[8]和吸水墊[10]依次粘貼于粘性底襯[12]上，確保相互之間的重疊關(guān)系(如附圖3所示)；將單靶標(biāo)檢測試紙[3]剪切為4mm寬的成品；D.試紙盤裝配將與甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌對應(yīng)的十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]置于試紙盤底殼[2]上，確保每種試紙位置序號固定可查，將引流片[4]置于十種單靶標(biāo)檢測試紙 [3]上并與樣品墊[6]重疊，蓋上上蓋[1]即得本發(fā)明可對一份樣品進(jìn)行十種靶標(biāo)檢測的成品試紙盤。實(shí)施例2 用實(shí)施例1方法制備的本發(fā)明食源性致病菌檢測試紙盤檢測食源性致病菌的方法(如圖4所示)A.樣品預(yù)處理水樣、食品、糞便樣品用增菌液增菌4. 5h后再進(jìn)行檢測；B.樣品處理將1倍體積經(jīng)過預(yù)處理的樣品與1倍體積樣品處理液混合，樣品處理液為 0. IM pH = 7. 2PB 含 0. 2M NaCl,0. 1% SDS,0. 3% NP40，0. 2% Tween20 的混合液；C.添加樣品將處理后的液體樣品滴加至本發(fā)明實(shí)施例1制備的食源性致病菌檢測試紙盤的加樣孔[5]中；D.層析反應(yīng)靜置15min待層析反應(yīng)完成；E.結(jié)果判讀(如附圖4所示)用上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器通過試紙盤上的結(jié)果掃描窗[7]依次對每個(gè)通道中試紙的分析膜[8]上的檢測帶T[16]與質(zhì)控帶C[17]進(jìn)行掃描分析，每掃描完一個(gè)通道即旋轉(zhuǎn)36度進(jìn)行下一個(gè)通道的掃描；定性檢測對某種靶標(biāo)而言只有質(zhì)控帶C[17]有信號產(chǎn)生，則樣品為某種靶標(biāo)陰性；若檢測帶T[16]與質(zhì)控帶C[17]均有信號產(chǎn)生，則樣品為某種靶標(biāo)陽性；若檢測帶 T[16]與質(zhì)控帶C[17]均無信號產(chǎn)生，則層析系統(tǒng)異常檢測失敗，需進(jìn)行再次檢測；某幾種靶標(biāo)檢測均為陽性，則說明該樣品中同時(shí)存在某幾種靶標(biāo)；定量檢測在某種靶標(biāo)檢測中將檢測帶T[12]、質(zhì)控帶C[17]的信號強(qiáng)度(即峰面積)依次賦值于T、C，T/C值即為檢測值，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)濃度菌液標(biāo)定并繪制定量曲線后，通過任意樣品的檢測值即可獲得該樣品中十種食源性致病菌的有無及具體濃度，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測。實(shí)施例3 本發(fā)明食源性致病菌檢測試紙盤的制備本發(fā)明食源性致病菌檢測試紙盤的結(jié)構(gòu)組成為試紙盤由上蓋[1]與底殼[2]構(gòu)成(如附圖2所示)，底殼[2]中均勻放置有針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌的十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]，每種單靶標(biāo)檢測試紙[3]針對一種食源性致病菌的特異性檢測；試紙盤內(nèi)十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]上放置有引流片W]，引流片[4]將上蓋[1]的加樣孔[5]與十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]的樣品墊[6]相互連通，保證液體樣品在十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]之間分配的均勻性；裝配完整的試紙盤中，加樣孔[5]對應(yīng)于引流片W]，結(jié)果掃描窗[7]對應(yīng)于分析膜[8]，終點(diǎn)指示窗[9]對應(yīng)于吸水墊[10]。單靶標(biāo)檢測試紙的結(jié)構(gòu)組成為樣品墊W]、結(jié)合墊[11]、分析膜[8]、吸水墊[10] 和粘性底襯[12]。
其中，樣品墊[6]是纖維素膜。其中，結(jié)合墊[11]是聚酯膜；結(jié)合墊[11]中固定有UCP結(jié)合物[13] ；UCP結(jié)合物 [13]由作為示蹤物的UCP顆粒[14]以及作為液相探針的某靶標(biāo)特異性抗體A[15]結(jié)合而成。其中，分析膜[8]是尼龍膜；其中，分析膜[8]上設(shè)置有檢測帶T[16]與質(zhì)控帶 C[17]；檢測帶T[16]為某靶標(biāo)特異性抗體Β[18]，質(zhì)控帶C[17]為某靶標(biāo)特異性抗體A的二抗[19]；檢測帶T[16]上的某靶標(biāo)特異性抗體Β[18]作為固相探針與UCP結(jié)合物[13]上作為液相探針的某靶標(biāo)特異性抗體Α[15]可構(gòu)成雙抗體夾心模式對某靶標(biāo)進(jìn)行特異性的檢測，而質(zhì)控帶C[17]可與UCP結(jié)合物[13]直接結(jié)合用于質(zhì)控整個(gè)層析流程是否正常；其中，吸水墊[10]是纖維素膜。其中，粘性底襯[12]是PVC板，其可使樣品墊W]、結(jié)合墊[11]、分析膜[8]以及吸水墊[10]按照適當(dāng)?shù)闹丿B關(guān)系粘貼固定，從而保證液體在單靶標(biāo)檢測試紙內(nèi)部流動(dòng)的連續(xù)性。其中，UCP顆粒[14]通過上轉(zhuǎn)換發(fā)光現(xiàn)象對樣品中某種靶標(biāo)[20]的存在與否以及濃度予以指示。其中，某靶標(biāo)特異性抗體A[15]與某靶標(biāo)特異性抗體B[18]，可為單抗也可為多抗，可相同也可不同。本發(fā)明食源性致病菌檢測試紙盤的制備方法為A.結(jié)合墊[11]制備將針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌 0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌的十種UCP結(jié)合物[13]分別制備各自的結(jié)合墊，制備方法相同，均為將某種靶標(biāo)的UCP結(jié)合物[13]用結(jié)合物稀釋液稀釋至終濃度為2. 5mg/ml，結(jié)合物稀釋液為pH = 7. 20. 03M PB含2% BSA、2%海藻糖、8%蔗糖和0.8% Tween20，將某種靶標(biāo)的UCP結(jié)合物[13]加于可作為結(jié)合墊[11]的聚酯膜上，于 45°C下lh，烘干備用；B.分析膜[8]制備針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌分別制備各自的分析膜，制備方法相同， 均為將1. 8mg/ml某靶標(biāo)特異性抗體B [18]、1. 2mg/ml某靶標(biāo)特異性抗體A的二抗[19]噴點(diǎn)于可作為分析膜的尼龍膜上分別作為檢測帶T[16]和質(zhì)控帶C[17]，于40°C下30min，烘干備用；C.單靶標(biāo)檢測試紙[3]剪切成型針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌分別制備各自的單靶標(biāo)檢測試紙[3]，制備方法相同，均為將樣品墊[6]、結(jié)合墊[11]、分析膜[8]和吸水墊[10] 依次粘貼于粘性底襯[12]上，確保相互之間的重疊關(guān)系(如附圖3所示)；將單靶標(biāo)檢測試紙[3]剪切為4mm寬的成品；D.試紙盤裝配將與甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌對應(yīng)的十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]置于試紙盤底殼[2]上，確保每種試紙位置序號固定可查，將引流片[4]置于十種單靶標(biāo)檢測試紙 [3]上并與樣品墊[6]重疊，蓋上上蓋[1]即得本發(fā)明可對一份樣品進(jìn)行十種靶標(biāo)檢測的成
品試紙盤。實(shí)施例4 用實(shí)施例3方法制備的本發(fā)明食源性致病菌檢測試紙盤檢測食源性致病菌的方法(如附圖4所示)A.樣品預(yù)處理取水樣、食品、糞便樣品直接檢測；B.樣品處理將1倍體積經(jīng)過預(yù)處理的樣品與1倍體積樣品處理液混合，樣品處理液為 0. 2M pH = 7. 2PB 含 0. 3M NaCl, 0. 5% SDS, 0. 5% NP40 和 0. 5% Tween20 的混合液；C.添加樣品將處理后的液體樣品滴加至本發(fā)明實(shí)施例3制備的食源性致病菌檢測試紙盤的加樣孔[5]中；D.層析反應(yīng)靜置15min待層析反應(yīng)完成；E.結(jié)果判讀(如附圖4所示)用上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器通過試紙盤上的結(jié)果掃描窗[7]依次對每個(gè)通道中試紙的分析膜[8]上的檢測帶T[16]與質(zhì)控帶C[17]進(jìn)行掃描分析，每掃描完一個(gè)通道即旋轉(zhuǎn)36度進(jìn)行下一個(gè)通道的掃描；定性檢測對某種靶標(biāo)而言只有質(zhì)控帶C[17]有信號產(chǎn)生，則樣品為某種靶標(biāo)陰性；若檢測帶T[16]與質(zhì)控帶C[17]均有信號產(chǎn)生，則樣品為某種靶標(biāo)陽性；若檢測帶 T[16]與質(zhì)控帶C[17]均無信號產(chǎn)生，則層析系統(tǒng)異常檢測失敗，需進(jìn)行再次檢測；某幾種靶標(biāo)檢測均為陽性，則說明該樣品中同時(shí)存在某幾種靶標(biāo)；定量檢測在某種靶標(biāo)檢測中將檢測帶T[12]、質(zhì)控帶C[17]的信號強(qiáng)度(即峰面積)依次賦值于T、C，τ/c值即為檢測值，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)濃度菌液標(biāo)定并繪制定量曲線后，通過任意樣品的檢測值即可獲得該樣品中十種食源性致病菌的有無及具體濃度，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測。
權(quán)利要求
1.一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光十通道免疫層析的食源性致病菌檢測試紙盤其特征在于該試紙盤的結(jié)構(gòu)組成為試紙盤由上蓋[1]與底殼[2]構(gòu)成(如附圖2所示)，底殼[2]中均勻放置有針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌的十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]，每種單靶標(biāo)檢測試紙[3]針對一種食源性致病菌的特異性檢測；試紙盤內(nèi)十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]上放置有引流片W]，引流片[4]將上蓋[1]的加樣孔[5]與十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]的樣品墊[6]相互連通，保證液體樣品在十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]之間分配的均勻性；裝配完整的試紙盤中，加樣孔[5]對應(yīng)于引流片W]，結(jié)果掃描窗[7]對應(yīng)于分析膜[8]，終點(diǎn)指示窗[9]對應(yīng)于吸水墊[10]。
2.如權(quán)利要求1所述的食源性致病菌檢測試紙盤，其特征在于其中單靶標(biāo)檢測試紙 [3]的結(jié)構(gòu)組成為樣品墊[6]、結(jié)合墊[11]、分析膜[8]、吸水墊[10]和粘性底襯[12]。
3.如權(quán)利要求2所述的食源性致病菌檢測試紙盤，其特征在于其中樣品墊[6]是具有較大床體積且微觀結(jié)構(gòu)均勻的物質(zhì)吸水紙、纖維素膜、玻璃纖維、無紡布或?yàn)V血膜。
4.如權(quán)利要求2所述的食源性致病菌檢測試紙盤，其特征在于其中結(jié)合墊[11]是具有較大床體積且微觀結(jié)構(gòu)均勻的物質(zhì)玻璃纖維、聚酯膜或無紡布；結(jié)合墊[11]中固定有UCP 結(jié)合物[13] ；UCP結(jié)合物[13]由作為示蹤物的UCP顆粒[14]以及作為液相探針的某靶標(biāo)特異性抗體A[15]結(jié)合而成。
5.如權(quán)利要求2所述的食源性致病菌檢測試紙盤，其特征在于其中分析膜[8]是微觀結(jié)構(gòu)均勻的物質(zhì)硝酸纖維素膜或尼龍膜；其中，分析膜[8]上設(shè)置有檢測帶T[16]與質(zhì)控帶C[17]；檢測帶T[16]為某靶標(biāo)特異性抗體Β[18]，質(zhì)控帶C[17]為某靶標(biāo)特異性抗體A 的二抗[19]；檢測帶T[16]上的某靶標(biāo)特異性抗體B[18]作為固相探針與UCP結(jié)合物[13] 上作為液相探針的某靶標(biāo)特異性抗體Α[15]可構(gòu)成雙抗體夾心模式對某靶標(biāo)進(jìn)行特異性的檢測，而質(zhì)控帶C[17]可與UCP結(jié)合物[13]直接結(jié)合用于質(zhì)控整個(gè)層析流程是否正常。
6.如權(quán)利要求2所述的食源性致病菌檢測試紙盤，其特征在于其中吸水墊[10]是具有較大床體積的物質(zhì)吸水紙或纖維素膜。
7.如權(quán)利要求2所述的食源性致病菌檢測試紙盤，其特征在于其中粘性底襯[12]是單面涂有壓力敏感膠的硬體材質(zhì)PVC板，其可使樣品墊W]、結(jié)合墊[11]、分析膜[8]以及吸水墊[10]按照適當(dāng)?shù)闹丿B關(guān)系粘貼固定，從而保證液體在單靶標(biāo)檢測試紙內(nèi)部流動(dòng)的連續(xù)性。
8.如權(quán)利要求4所述的食源性致病檢測試紙盤，其特征在于其中UCP顆粒[14]可通過上轉(zhuǎn)換發(fā)光現(xiàn)象對樣品中某種靶標(biāo)[20]的存在與否以及濃度予以指示。
9.如權(quán)利要求5所述的食源性致病檢測試紙盤，其特征在于其中某靶標(biāo)特異性抗體 A[15]與某靶標(biāo)特異性抗體B[18]，可為單抗也可為多抗，可相同也可不同。
10.如權(quán)利要求1-9任一所述的食源性致病檢測試紙盤的制備方法，其特征在于該方法為A.結(jié)合墊[11]制備將針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌的十種UCP結(jié)合物[13]分別制備各自的結(jié)合墊，制備方法相同，均為將某種靶標(biāo)的UCP結(jié)合物[13]用結(jié)合物稀釋液稀釋至終濃度為0. 5-3mg/ml，結(jié)合物稀釋液為pH = 7. 20. 03M PB含1-10% BSA、0. 5-10%海藻糖、 0. 5-10%蔗糖和0. 1-1% Tween20，將某種靶標(biāo)的UCP結(jié)合物[13]加于可作為結(jié)合墊[11] 的玻璃纖維、聚酯膜或無紡布上，于37-50°C下30min-;3h，烘干備用；B.分析膜[8]制備針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌分別制備各自的分析膜，制備方法相同，均為將l-2mg/ml某靶標(biāo)特異性抗體B [18]、l_2mg/ml某靶標(biāo)特異性抗體A的二抗[19]噴點(diǎn)于可作為分析膜的硝酸纖維素膜或尼龍膜上分別作為檢測帶T[16]和質(zhì)控帶C[17]，于 ;35-40°C下 30min-90min，烘干備用；C.單靶標(biāo)檢測試紙[3]剪切成型針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌 0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌分別制備各自的單靶標(biāo)檢測試紙[3]，制備方法相同，均為將樣品墊[6]、結(jié)合墊[11]、分析膜[8]和吸水墊[10]依次粘貼于粘性底襯[12]上，確保相互之間的重疊關(guān)系(如附圖3所示)；將單靶標(biāo)檢測試紙[3] 剪切為4mm寬的成品；D.試紙盤裝配將與甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌 01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌對應(yīng)的十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]置于試紙盤底殼[2]上，確保每種試紙位置序號固定可查，將引流片[4]置于十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]上并與樣品墊[6]重疊，蓋上上蓋[1]即得可對一份樣品進(jìn)行十種靶標(biāo)檢測的成品試紙盤。
11.如權(quán)利要求10所述的食源性致病檢測試紙盤的制備方法，其特征在于該方法為A.結(jié)合墊[11]制備將針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌的十種UCP結(jié)合物[13]分別制備各自的結(jié)合墊，制備方法相同，均為將某種靶標(biāo)的UCP結(jié)合物[13]用結(jié)合物稀釋液稀釋至終濃度為2mg/ml，結(jié)合物稀釋液為pH = 7. 20. 03M PB含5% BSA、5%海藻糖、5%蔗糖和0. 5% Tween20，將某種靶標(biāo)的UCP結(jié)合物[13]加于可作為結(jié)合墊[11]的玻璃纖維、聚酯膜或無紡布上，于40°C下濁，烘干備用； B.分析膜[8]制備針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌分別制備各自的分析膜，制備方法相同，均為將1. 5mg/ml某靶標(biāo)特異性抗體B [18]、1. 5mg/ml某靶標(biāo)特異性抗體A的二抗[19]噴點(diǎn)于可作為分析膜的硝酸纖維素膜或尼龍膜上分別作為檢測帶T[16]和質(zhì)控帶C[17]，于 37°C下60min，烘干備用；C.單靶標(biāo)檢測試紙[3]剪切成型針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌 0157、霍亂弧菌01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌分別制備各自的單靶標(biāo)檢測試紙[3]，制備方法相同，均為將樣品墊[6]、結(jié)合墊[11]、分析膜[8]和吸水墊[10]依次粘貼于粘性底襯[12]上，確保相互之間的重疊關(guān)系(如附圖3所示)；將單靶標(biāo)檢測試紙[3] 剪切為4mm寬的成品；D.試紙盤裝配將與甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157、霍亂弧菌 01群和霍亂弧菌0139群十種食源性致病菌對應(yīng)的十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]置于試紙盤底殼[2]上，確保每種試紙位置序號固定可查，將引流片[4]置于十種單靶標(biāo)檢測試紙[3]上并與樣品墊[6]重疊，蓋上上蓋[1]即得可對一份樣品進(jìn)行十種靶標(biāo)檢測的成品試紙盤。
12.一種食源性致病菌的檢測方法，其特征在于在檢測過程中采用權(quán)利要求1-9任一所述的基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光十通道免疫層析的食源性致病菌檢測試紙盤，檢測方法為A.樣品預(yù)處理水樣、食品、糞便樣品直接檢測或用增菌液增菌4h4h后再進(jìn)行檢測；B.樣品處理將0.5-1. 5倍體積經(jīng)過預(yù)處理的樣品與1倍體積樣品處理液混合，樣品處理液為 0. 03-0. 3M pH = 7. 2PB 含 0. 1-0. 5M NaCl, 0. 1-1% SDS, 0. 1_1%NP40 和 0. 1-1% Tween20的混合液；C.添加樣品將處理后的液體樣品滴加至權(quán)利要求1-9任一所述的食源性致病菌檢測試紙盤的加樣孔[5]中；D.層析反應(yīng)靜置10-20min待層析反應(yīng)完成；E.結(jié)果判讀(如附圖4所示)用上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器通過試紙盤上的結(jié)果掃描窗 [7]依次對每個(gè)通道中試紙的分析膜[8]上的檢測帶T[16]與質(zhì)控帶C[17]進(jìn)行掃描分析， 每掃描完一個(gè)通道即旋轉(zhuǎn)36度進(jìn)行下一個(gè)通道的掃描；定性檢測對某種靶標(biāo)而言只有質(zhì)控帶C[17]有信號產(chǎn)生，則樣品為某種靶標(biāo)陰性；若檢測帶T[16]與質(zhì)控帶C[17]均有信號產(chǎn)生，則樣品為某種靶標(biāo)陽性；若檢測帶T[16]與質(zhì)控帶C[17]均無信號產(chǎn)生，則層析系統(tǒng)異常檢測失敗，需進(jìn)行再次檢測；某幾種靶標(biāo)檢測均為陽性，則說明該樣品中同時(shí)存在某幾種靶標(biāo)；定量檢測在某種靶標(biāo)檢測中將檢測帶T[16]、質(zhì)控帶C[17]的信號強(qiáng)度(即峰面積) 依次賦值于T、C，T/C值即為檢測值，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)濃度菌液標(biāo)定并繪制定量曲線后，通過任意樣品的檢測值即可獲得該樣品中十種食源性致病菌的有無及具體濃度，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測。
13.如權(quán)利要求12所述的食源性致病菌的檢測方法，其特征在于檢測方法為A.樣品預(yù)處理水樣、食品、糞便樣品直接檢測或用增菌液增菌4.5h后再進(jìn)行檢測；B.樣品處理將1倍體積經(jīng)過預(yù)處理的樣品與1倍體積樣品處理液混合，樣品處理液為 0. IM pH = 7. 2PB 含 0. 2M NaCl,0. 1% SDS,0. 3% NP40，0. 2% Tween20 的混合液；C.添加樣品將處理后的液體樣品滴加至權(quán)利要求1-9任一所述的食源性致病菌檢測試紙盤的加樣孔[5]中；D.層析反應(yīng)靜置15min待層析反應(yīng)完成；E.結(jié)果判讀(如附圖4所示)用上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器通過試紙盤上的結(jié)果掃描窗 [7]依次對每個(gè)通道中試紙的分析膜[8]上的檢測帶T[16]與質(zhì)控帶C[17]進(jìn)行掃描分析， 每掃描完一個(gè)通道即旋轉(zhuǎn)36度進(jìn)行下一個(gè)通道的掃描；定性檢測對某種靶標(biāo)而言只有質(zhì)控帶C[17]有信號產(chǎn)生，則樣品為某種靶標(biāo)陰性；若檢測帶T[16]與質(zhì)控帶C[17]均有信號產(chǎn)生，則樣品為某種靶標(biāo)陽性；若檢測帶T[16]與質(zhì)控帶C[17]均無信號產(chǎn)生，則層析系統(tǒng)異常檢測失敗，需進(jìn)行再次檢測；某幾種靶標(biāo)檢測均為陽性，則說明該樣品中同時(shí)存在某幾種靶標(biāo)；定量檢測在某種靶標(biāo)檢測中將檢測帶T[16]、質(zhì)控帶C[17]的信號強(qiáng)度(即峰面積) 依次賦值于T、C，T/C值即為檢測值，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)濃度菌液標(biāo)定并繪制定量曲線后，通過任意樣品的檢測值即可獲得該樣品中十種食源性致病菌的有無及具體濃度，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測。
全文摘要
本發(fā)明基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光十通道免疫層析的食源性致病菌檢測試紙盤通過UCP顆粒與十通道免疫層析試紙盤的結(jié)合使得一次加樣即可實(shí)現(xiàn)十種靶標(biāo)的檢測，實(shí)現(xiàn)了高通量的現(xiàn)場快速定量檢測。而具有極強(qiáng)兼容性的樣品處理液則保證了檢測結(jié)果的特異性與敏感性。最終為食源性病原體的現(xiàn)場檢測、監(jiān)測提供了有效的技術(shù)手段，有助于食源性疾病的預(yù)防與控制。
文檔編號G01N33/532GK102375060SQ20101025769
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者周蕾, 楊瑞馥, 王浩然, 郭兆彪 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所