專利名稱：一種加入內(nèi)控核酸對(duì)病原體核酸進(jìn)行半定量檢測(cè)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于核酸檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種加入內(nèi)控核酸對(duì)病原體核酸進(jìn)行半定量檢測(cè) 的方法，具體涉及在病原體核酸的檢測(cè)全程中，均引入與待測(cè)核酸序列相似的內(nèi)控，對(duì)檢測(cè) 過程進(jìn)行監(jiān)控，既排除假陰性，又可通過比較試紙條上內(nèi)控線與檢測(cè)線的顯色強(qiáng)度進(jìn)行半 定量的核酸檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
膠體金免疫層析(gold-immunochromotography assay, GICA)法是 20 世紀(jì) 80 年 代末發(fā)展起來的一種快速的免疫學(xué)測(cè)定方法，它是膠體金標(biāo)記技術(shù)和免疫層析技術(shù)相結(jié)合 的產(chǎn)物?；驹硎抢梦⒖诪V膜的滲濾濃縮和毛細(xì)管作用，使抗原抗體反應(yīng)在固相膜上 快速進(jìn)行，然后用膠體金標(biāo)記的抗體來直接顯色，陽性反應(yīng)在膜上呈現(xiàn)紅色，陰性反應(yīng)則不 形成紅色，即可實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。目前國內(nèi)普遍以病原微生物的蛋白質(zhì)抗原作為試紙條檢測(cè)的主要對(duì)象，并且取得 了不錯(cuò)的效果。然而盡管免疫學(xué)診斷技術(shù)在一直進(jìn)步，第三代單克隆診斷抗體的出現(xiàn)使得 免疫診斷的靈敏度大大提高，但是，由于免疫診斷所采用的原理是抗原抗體結(jié)合，自身存在 著一定局限性首先是個(gè)體免疫機(jī)能不同，其中有少數(shù)感染者感染后機(jī)體所產(chǎn)生的抗體滴 度有可能低于免疫學(xué)檢測(cè)線以下，甚至不產(chǎn)生抗體，因此，免疫學(xué)診斷方法不能檢測(cè)出處于 窗口期和新近感染病毒的獻(xiàn)血員，這樣勢(shì)必導(dǎo)致漏檢。其次，抗原出現(xiàn)變異以及稀有亞型也 可導(dǎo)致漏檢。因此，免疫學(xué)篩查后，假陰性及漏檢現(xiàn)象仍時(shí)有發(fā)生。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，核酸診斷(Nucleic acid Test, NAT)這 一全新的技術(shù)成為臨床診斷的發(fā)展方向，在血液篩查上，NAT與傳統(tǒng)的酶免檢測(cè)法相比也有 著明顯的優(yōu)越性，由于DNA/RNA直接反映病毒本身在機(jī)體內(nèi)的存在情況，因此直接檢測(cè)病 原體的核酸，能大大縮短“窗口期”。以HCV為例，免疫學(xué)檢測(cè)的“窗口期，，平均長達(dá)70天， 而PCR可將“窗口期”縮短41-60天，顯然有利于疾病的早期診斷。同時(shí)NAT也具有更高的 靈敏度，可檢出標(biāo)本中極微量的核酸，在病毒感染后數(shù)天即能檢出，因此，NAT技術(shù)十分適合 在臨床應(yīng)用和推廣。PCR作為當(dāng)今最為常用的核酸擴(kuò)增方法，在生物科研和臨床中應(yīng)用廣 泛。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前國內(nèi)已有人使用PCR結(jié)合免疫層析試紙條法對(duì)病毒核酸進(jìn)行定性 診斷，但至今無報(bào)道使用免疫層析試紙條法對(duì)病毒核酸進(jìn)行定量檢測(cè)。此外，核酸診斷的一個(gè)潛在問題就是假陽性與假陰性的困擾，而其中假陰性問題 相對(duì)于臨床檢測(cè)更為嚴(yán)重。這是由于引起假陽性的原因多較為單一，一般僅涉及擴(kuò)增產(chǎn)物 的污染，通過嚴(yán)格的防污染培訓(xùn)，合理的環(huán)境布局，以及加入U(xiǎn)NG酶等防污染技術(shù)可以使該 問題得以基本解決。而PCR的假陰性卻不同，它涉及到與整個(gè)檢測(cè)相關(guān)的幾乎任意一個(gè)環(huán) 節(jié)，十分復(fù)雜。其中又以下幾個(gè)方面較為重要一.實(shí)驗(yàn)儀器核酸診斷對(duì)儀器的依賴性是很高的，恒溫水浴鍋、高速離心機(jī)、擴(kuò)增儀等設(shè)備如若 未定期校正，都可能造成檢測(cè)結(jié)果的假陰性。國產(chǎn)水浴鍋會(huì)出現(xiàn)顯示溫度與實(shí)際溫度不符的情況，兩者可以相差10度左右。擴(kuò)增儀的主要問題同樣是控溫不準(zhǔn)，不同孔道之間的孔 間差會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增結(jié)果不平行，使擴(kuò)增效率降低甚至失敗。離心機(jī)的參數(shù)常用相對(duì)離心力 (RCF)或每分鐘轉(zhuǎn)速(rpm)表示，由于不同離心機(jī)有效半徑存在差異，因此相同轉(zhuǎn)速下所產(chǎn) 生的離心力相差可能很大(有的在數(shù)倍以上)，導(dǎo)致相同的離心時(shí)間，固相和液相的分離出 現(xiàn)問題，同樣會(huì)產(chǎn)生假陰性。二.實(shí)驗(yàn)試劑試劑是核酸診斷成功的關(guān)鍵要素，高質(zhì)量的試劑可以提高提取的得率、擴(kuò)增的靈 敏度以及縮短檢測(cè)的時(shí)間。然而在日常實(shí)驗(yàn)過程中，試劑的質(zhì)量往往難以得到保證。一方 面不同生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，有時(shí)即使是使用同一廠家不同批次的產(chǎn)品都可能得 到截然相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另一方面試劑保存不當(dāng)同樣會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成巨大影響模板的 降解、溶液PH發(fā)生變化、酶的活性降低等等。三.操作人員素質(zhì)核酸診斷的研究對(duì)象是DNA或RNA，即人體內(nèi)的生物大分子，由于分子水平的結(jié)構(gòu) 無法用肉眼直接進(jìn)行觀察，因而操作過程中出現(xiàn)的一些細(xì)小問題很容易被忽視。例如少加、 漏加試劑，混合液震蕩、離心不充分，反應(yīng)程序設(shè)置有誤等。其中有些細(xì)節(jié)即便是具備多年 操作經(jīng)驗(yàn)的人員也難以完全避免。總之，以上每個(gè)環(huán)節(jié)的失誤都可能導(dǎo)致待測(cè)核酸的減少，有時(shí)甚至完全降解或丟 失，使試紙條上的檢測(cè)線無法顯色，繼而給檢測(cè)人員提供錯(cuò)誤的信息，導(dǎo)致錯(cuò)誤的判斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有核酸診斷技術(shù)整個(gè)過程任何一個(gè)環(huán)節(jié)(從樣本的提 取到目的片段的擴(kuò)增放大，再到使用試紙條進(jìn)行檢測(cè))出現(xiàn)問題均易產(chǎn)生假陰性的情況， 提供一種使用內(nèi)控核酸片段對(duì)樣本核酸進(jìn)行半定量可視化檢測(cè)的方法。本方法有針對(duì)性的 設(shè)計(jì)了待測(cè)核酸的相應(yīng)內(nèi)控作為陽性對(duì)照，并從提取步驟開始就和待測(cè)核酸平行操作，直 至最終試紙條檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本核酸的半定量可視化檢測(cè)，并從根本上防止了檢測(cè)結(jié)果假 陰性的可能，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。本發(fā)明是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種加入內(nèi)控對(duì)目的核酸進(jìn)行試紙條半定量可視化檢測(cè)的方法，包括如下步驟(1)針對(duì)目的核酸制備與目的核酸片段Tm值相近的內(nèi)控核酸片段；(2)在待檢樣本中加入濃度及序列均已知的內(nèi)控核酸片段，采用核酸提取法同時(shí) 提取待檢樣本中的核酸(包括DNA以及RNA)以及內(nèi)控核酸；(3)以步驟(2)提取得到的提取液為模板，采用核酸擴(kuò)增法在單管中加入針對(duì)目 的核酸片段和內(nèi)控核酸片段的修飾有檢測(cè)用抗原的混合引物同時(shí)擴(kuò)增目的核酸片段和內(nèi) 控核酸片段，得到帶有檢測(cè)用抗原的擴(kuò)增產(chǎn)物混合液；(4)將步驟(3)得到的含目的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物和內(nèi)控核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的混合液點(diǎn)樣在 “三條線”免疫層析試紙條上進(jìn)行免疫層析，通過層析方向上不同位置條帶的有無對(duì)目的核 酸進(jìn)行定性，通過比較目的核酸與內(nèi)控核酸檢測(cè)條帶的顯色強(qiáng)度，估測(cè)被測(cè)樣本的拷貝數(shù)， 對(duì)目的核酸進(jìn)行半定量分析；所述的層析方向上不同位置處條帶分別修飾有與檢測(cè)用抗原 相對(duì)應(yīng)的抗體。
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其中，步驟(1)所述的內(nèi)控核酸片段優(yōu)選與目的核酸片段在堿基數(shù)目和堿基構(gòu)成 上均相同，僅堿基排列不同的核酸片段，進(jìn)一步優(yōu)選與目的核酸片段在堿基數(shù)目和堿基構(gòu) 成上均相同，僅一端約16 30個(gè)堿基排列不同的核酸片段。步驟⑴所述的內(nèi)控核酸片段是通過如下的制備方法得到以所述的目的核酸 或含有目的核酸片段的質(zhì)粒為模板，使用一對(duì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，一條引物與目的核酸 互補(bǔ)，另一條引物由與待測(cè)核酸互補(bǔ)和不互補(bǔ)的兩部分組成，不互補(bǔ)的部分為5’端加入約 16 30個(gè)人工設(shè)計(jì)的與待測(cè)核酸不互補(bǔ)的堿基，通過PCR擴(kuò)增最終產(chǎn)生了與待測(cè)核酸擴(kuò)增 片段堿基數(shù)目相同、堿基構(gòu)成比相同而僅一端約16 30bp排列不同的內(nèi)控核酸片段。步驟(3)所述的核酸擴(kuò)增法可以為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、依賴核酸序列擴(kuò)增技 術(shù)(NASBA)或核酸環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)。步驟(3)所述的得到帶有檢測(cè)用抗原的擴(kuò)增產(chǎn)物，可通過如下的兩種方法得到 以步驟(2)提取得到的提取液為模板，在單管中加入針對(duì)目的核酸片段和內(nèi)控核酸片段的 混合引物同時(shí)擴(kuò)增目的核酸片段和內(nèi)控核酸片段(方法i)用一對(duì)基因特異性引物擴(kuò)增目的核酸片段，該基因特異性上、下游引物 分別修飾A抗原及B抗原，得到帶有A抗原及B抗原的目的核酸片段擴(kuò)增產(chǎn)物，用一對(duì)基因 特異性引物擴(kuò)增內(nèi)控核酸片段，該基因特異性上、下游引物分別修飾A抗原及C抗原，得到 帶有A抗原及C抗原的內(nèi)控核酸片段擴(kuò)增產(chǎn)物；(方法ii)用一對(duì)基因特異性引物對(duì)目的核酸片段進(jìn)行非對(duì)稱性擴(kuò)增，其中非限 制性引物修飾B抗原，最終擴(kuò)增產(chǎn)物為帶有B抗原的單鏈目的核酸片段；用一對(duì)基因特異性 引物對(duì)內(nèi)控核酸進(jìn)行非對(duì)稱性擴(kuò)增，其中非限制性引物修飾C抗原，最終擴(kuò)增產(chǎn)物為帶有C 抗原的單鏈內(nèi)控核酸片段；設(shè)計(jì)一條修飾有A抗原的目的核酸特異性探針和一條修飾有A 抗原的內(nèi)控核酸特異性探針，加入擴(kuò)增體系，在擴(kuò)增的同一管中分別與帶有B抗原的單鏈 目的核酸片段及帶有C抗原的單鏈內(nèi)控核酸片段互補(bǔ)，通過特異性雜交形成帶有檢測(cè)用抗 原的擴(kuò)增產(chǎn)物待測(cè)核酸_探針復(fù)合物及內(nèi)控核酸_探針復(fù)合物；或者，用一對(duì)基因特異性引物對(duì)目的核酸進(jìn)行非對(duì)稱性擴(kuò)增，其中非限制性引物 修飾A抗原，最終擴(kuò)增產(chǎn)物為帶有A抗原的單鏈目的核酸；用一對(duì)基因特異性引物對(duì)內(nèi)控核 酸進(jìn)行非對(duì)稱性擴(kuò)增，其中非限制性引物也修飾A抗原，最終擴(kuò)增產(chǎn)物為帶有A抗原的單鏈 內(nèi)控核酸；設(shè)計(jì)一條修飾有B抗原的目的核酸特異性探針和一條修飾有C抗原的內(nèi)控核酸 特異性探針，加入擴(kuò)增體系，在擴(kuò)增的同一管中與目的核酸及內(nèi)控核酸互補(bǔ)，通過特異性雜 交形成帶有檢測(cè)用抗原的擴(kuò)增產(chǎn)物目的核酸_探針復(fù)合物及內(nèi)控核酸_探針復(fù)合物。步驟(4)中所述的免疫層析試紙條為“三條線”免疫層析試紙條，其有色顆粒結(jié)合 墊中的有色顆粒為表面修飾特異性抗A抗體的有色顆粒；其包被膜上設(shè)有三條線將特異 性抗B抗體固定于包被膜上形成的檢測(cè)線，將特異性抗C抗體固定于膜上形成的內(nèi)控線，將 A抗原修飾的蛋白固定于膜上形成的質(zhì)控線。所述的有色顆粒為膠體金、膠體硒或粒徑為0. 1 μ m-80 μ m的乳膠顆粒。所述的有色顆粒表面修飾的特異性抗A抗體、包被膜上固定的抗B抗體和抗C抗 體，可選自抗生物素抗體、抗熒光素抗體或抗地高辛抗體中的任一種；引物上修飾的抗原 可以為與之對(duì)應(yīng)的生物素、熒光素或地高辛中的任一種，A抗原修飾的蛋白可選用A抗原修 飾的牛血清白蛋白。
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所述的步驟(4)對(duì)目的核酸進(jìn)行定性的依據(jù)為如果質(zhì)控線、內(nèi)控線及檢測(cè)線均顯 色，則檢測(cè)結(jié)果為陽性，表明溶液中含有目的核酸；如果質(zhì)控線、內(nèi)控線顯色而檢測(cè)線不顯 色，則檢測(cè)結(jié)果為陰性，表明溶液中不含目的核酸；如果僅質(zhì)控線顯色而內(nèi)控線、檢測(cè)線均 不顯色，則結(jié)果為假陰性，表明提取、擴(kuò)增或試紙條檢測(cè)過程中某一步或某幾步出現(xiàn)問題， 結(jié)果不可信；如果質(zhì)控線不顯色，表明試紙條質(zhì)量出現(xiàn)問題，結(jié)果不可信；步驟(4)對(duì)目的 核酸進(jìn)行半定量的依據(jù)為如果檢測(cè)線與質(zhì)控線均顯色，通過檢測(cè)線和內(nèi)控線的顯色強(qiáng)度進(jìn) 行比較，估測(cè)被測(cè)樣本的拷貝數(shù)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本核酸濃度的相對(duì)定量。所述的待檢樣本為待檢血液、組織、分泌物、尿液或糞便。本發(fā)明加入內(nèi)控的試紙條核酸檢測(cè)方法原理如下“三條線”試紙條制備時(shí)，將特異性抗A抗體(一般為鏈親和素)包被在有色顆粒 表面，有色顆?？梢詾槿槟z顆?；蚰z體金顆粒，再將有色顆粒固定在試紙條一端；依次將抗 B抗原抗體(如抗熒光素抗體)、抗C抗原抗體(如抗地高辛抗體)以及牛血清白蛋白偶聯(lián) 的生物素固定在膜上分別形成檢測(cè)線、內(nèi)控線及質(zhì)控線。用于試紙條檢測(cè)的終產(chǎn)物為標(biāo)記 有生物素、熒光素的目的核酸片段和標(biāo)記有生物素、地高辛的內(nèi)控核酸片段的混合液。帶有試紙條檢測(cè)用抗原的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物可來源于兩種方法(i)混合液中的目的 核酸片段來源于5’端分別修飾生物素及熒光素的一對(duì)待測(cè)基因特異性引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，混 合液中的內(nèi)控核酸片段來源于5’端分別修飾生物素及地高辛的一對(duì)內(nèi)控核酸特異性引物 的擴(kuò)增產(chǎn)物；(ii)混合液中的目的核酸片段來源于一條熒光素修飾的引物(PCR兩條引物 中濃度較高的引物)的擴(kuò)增產(chǎn)物，雜交結(jié)合了一條生物素修飾的特異性探針，或者是一條 生物素修飾的引物(PCR兩條引物中濃度較高的引物)的擴(kuò)增產(chǎn)物，雜交結(jié)合了一條熒光素 修飾的特異性探針；混合液中的內(nèi)控核酸片段來源于一條地高辛修飾的引物(PCR兩條引 物中濃度較高的引物)的擴(kuò)增產(chǎn)物，雜交結(jié)合了一條生物素修飾的特異性探針，或者一條 生物素修飾的引物(PCR兩條引物中濃度較高的引物)的擴(kuò)增產(chǎn)物，雜交結(jié)合了一條地高辛 修飾的特異性探針。在試紙條的檢測(cè)過程中，修飾有生物素的目的核酸片段及內(nèi)控核酸片 段均會(huì)與有色顆粒表面的鏈親和素結(jié)合，形成目的核酸_有色顆粒復(fù)合物及內(nèi)控核酸_有 色顆粒復(fù)合物，復(fù)合物通過毛細(xì)現(xiàn)象沿纖維膜前進(jìn)，當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測(cè)線位置時(shí)，目的核酸片段上 修飾的熒光素與檢測(cè)線上固定的抗熒光素抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，使有色顆粒聚集在檢測(cè) 線處繼而出現(xiàn)肉眼可見條帶；當(dāng)復(fù)合物到達(dá)內(nèi)控線位置時(shí)，內(nèi)控核酸片段上修飾的地高辛 與內(nèi)控線上固定的抗地高辛抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，使有色顆粒聚集在內(nèi)控線處繼而出現(xiàn) 肉眼可見條帶；修飾鏈親和素的游離有色顆粒繼續(xù)層析，當(dāng)?shù)竭_(dá)質(zhì)控線時(shí)，與固定的生物素 結(jié)合，使質(zhì)控線同樣有顯色。當(dāng)目的核酸片段不存在時(shí)，有色顆粒無法在檢測(cè)線處聚集，不能形成肉眼可見的 有色條帶；同樣，當(dāng)內(nèi)控核酸片段不存在時(shí)，有色顆粒也無法在內(nèi)控線處聚集，不能形成肉 眼可見的有色條帶。如果試紙條上質(zhì)控線及檢測(cè)線均顯色，則檢測(cè)結(jié)果為陽性，表明樣本中 含有目的核酸；如果質(zhì)控線、內(nèi)控線顯色而檢測(cè)線不顯色，則檢測(cè)結(jié)果為陰性，表明樣本中 不含目的核酸；如果僅質(zhì)控線顯色而內(nèi)控線、檢測(cè)線均不顯色，則表明檢測(cè)全過程中某一步 或某幾步出現(xiàn)問題，試紙條結(jié)果不可信，為假陰性；如果質(zhì)控線不顯色，表明試紙條自身存 在質(zhì)量問題，檢測(cè)結(jié)果亦不可信。由于內(nèi)控核酸的濃度已知，在檢測(cè)線與質(zhì)控線均顯色的情 況下，通過內(nèi)控線與檢測(cè)線顯色強(qiáng)度的對(duì)比，可實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢樣本中目的核酸濃度的相對(duì)定
7量，如果內(nèi)控線不顯色，而檢測(cè)線與質(zhì)控線均顯色，說明待檢樣本中目的核酸濃度遠(yuǎn)大于已 知內(nèi)控核酸片段濃度。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明通過從目的核酸片段提取步驟開始便加入設(shè)計(jì)好的內(nèi)控核酸片段作為 陽性對(duì)照，使兩者平行提取、擴(kuò)增和點(diǎn)樣，最終在一張?jiān)嚰垪l上同時(shí)檢測(cè)上述兩種片段，從 而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的片段檢測(cè)的全程監(jiān)控，避免了現(xiàn)有核酸診斷易于產(chǎn)生假陰性的問題，使檢測(cè) 結(jié)果更為準(zhǔn)確、可靠。2、內(nèi)控核酸由目的核酸制備而來，與目的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物相比堿基排列順序不同而 堿基總數(shù)及構(gòu)成比均相同，從而使兩者Tm值相似，在確保引物擴(kuò)增特異性好的前提下同時(shí) 實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)增效率一致。3、與其他基于試紙條檢測(cè)的方法一般用于定性檢測(cè)不同的是，本方法在引入內(nèi)控 后可實(shí)現(xiàn)基于試紙條的目的核酸半定量檢測(cè)。通過加入一定量已知濃度的內(nèi)控核酸，對(duì)試 紙條上檢測(cè)線和內(nèi)控線的顯色強(qiáng)度進(jìn)行比較，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢樣本中目的核酸濃度的相對(duì)定量。4、本發(fā)明加入內(nèi)控對(duì)目的核酸進(jìn)行試紙條半定量可視化檢測(cè)的方法檢測(cè)快速，全 過程在15分鐘內(nèi)完成；操作方便，易于推廣，相關(guān)人員無需經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)；容易判讀，檢測(cè) 結(jié)果可視化；無需特殊儀器，特別適合現(xiàn)場檢測(cè)；制作成本低廉。


圖1是本發(fā)明方法流程示意圖。圖2是本發(fā)明加入內(nèi)控的雙修飾引物試紙條檢測(cè)核酸方法的原理圖。圖3是本發(fā)明加入內(nèi)控的單探針試紙條檢測(cè)核酸方法的原理圖。圖4是用試紙條對(duì)實(shí)際樣本進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果以及陽性樣本檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)的假陰性 結(jié)果。其中1代表正常人血清的試紙條檢測(cè)結(jié)果；2代表HBV病毒血清的試紙條檢測(cè)結(jié)果； 3代表HBV病毒血清的假陰性檢測(cè)結(jié)果。圖5是實(shí)施例2對(duì)加入內(nèi)控的試紙條法進(jìn)行半定量考察的結(jié)果圖。其中1 6中加 入的內(nèi)控模板量均為50cOpieS，1中加入的病毒目的核酸模板量為50cOpieS ；2中加入的病 毒目的核酸模板量為500cOpieS ；3中加入的病毒目的核酸模板量為5000COpieS ；4中加入 的病毒目的核酸模板量為5 X IO4Copies ；5中加入的病毒目的核酸模板量為5 X IO5Copies ； 6中加入的病毒目的核酸模板量為5X106COpieS。圖6是實(shí)施例3對(duì)不同濃度的HBV病毒血清進(jìn)行半定量考察的結(jié)果圖。1 5依 次表示HBV病毒濃度為ΙΟ2、ΙΟ3、ΙΟ4、105、106copies/100 μ L血清的待測(cè)血清半定量考察的 結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 (采用加入內(nèi)控的試紙條法，檢測(cè)血液中HBV病毒)我國在世界上屬于乙型肝炎病毒感染的高發(fā)區(qū)，目前全國有上億人是乙型肝炎病 毒攜帶者，慢性肝炎病人約有幾千萬。每年我國在病毒性肝炎的直接治療方面費(fèi)用約有上 百億元(不包括保健品費(fèi)用、影響學(xué)習(xí)、就業(yè)和工作等造成的間接損失)。對(duì)乙型肝炎病毒高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)在其預(yù)防和治療方面至關(guān)重要。HBV基因組為環(huán)狀雙鏈DNA，全長為3182bp (約3. 2kb)。雙鏈的長度不對(duì)稱，負(fù)鏈 (長鏈)與病毒mRNA互補(bǔ)。正鏈僅5’端固定，其長度可為負(fù)鏈的50%-100%，其3’端 位置不定，因而在病毒群體中有不同長度的正鏈與全長的負(fù)鏈匹配，僅有部分長度為雙鏈。 HBV負(fù)鏈核苷酸序列有4個(gè)主要開放讀碼框架(open reading frame, OFR) :S基因區(qū)、C基 因區(qū)、P基因區(qū)和X基因區(qū)。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，選擇S基因區(qū)作為目標(biāo)擴(kuò)增區(qū)域。以目的核酸(HBV病毒的S基因區(qū))為模板，制備內(nèi)控核酸片段用上游引物為 P1SEQID NO. 1 ；下游引物為:P2SEQ ID NO. 2。以上述擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，制備內(nèi)控核酸片段用上游引物為P1-2SEQ ID NO. 3 ；下 游引物為:P2SEQ ID NO. 2。檢測(cè)用HBV目的核酸擴(kuò)增特異性引物分別是P3 (上游)5，-biotin-SEQ ID NO. 4-3，P4 (下游)5，-FITC-SEQ ID NO. 5-3，檢測(cè)用HBV內(nèi)控核酸擴(kuò)增特異性引物分別是P3 (上游)5，-biotin-SEQ ID NO. 4-3，P5 (下游)5，-Dig-SEQ ID NO. 6-3，實(shí)驗(yàn)流程1)內(nèi)控核酸片段制備首先使用一對(duì)特異性的引物對(duì)目的核酸或含有目的核 酸片段的質(zhì)粒進(jìn)行單管一重?cái)U(kuò)增，反應(yīng)體系為25yL，其中包括10XBuffer 2. 5 μ L、 dNTPs(10mM)0.5yL、MgCl2(25mM)1.5yL3|*Pl(SEQ IDN0. 1)、P2(SEQ IDN0. 2)各 1 μ L、 rTaq DNApolymerase (5U/ μ L) 0. 125 μ L,補(bǔ)水至 25 μ L,混勻。在 94 "C 預(yù)變性 2 分鐘后， 于90°C 10秒、70°C 30秒的條件下擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，最后于72°C延伸2分鐘。之后用引物 P1-2(SEQ ID NO. 3)、P2(SEQ ID NO. 2)對(duì)稀釋IO5倍的上述目的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò) 增反應(yīng)條件和反應(yīng)程序同上，純化擴(kuò)增產(chǎn)物，以去除反應(yīng)中多余的引物、寡核苷酸、鹽離子 等。最后使用紫外分光光度計(jì)，測(cè)定A2JA280處的比值以及A26tl處的紫外吸收峰，計(jì)算純化 產(chǎn)物中內(nèi)控核酸的濃度，從而得到已知濃度的內(nèi)控核酸片段(SEQID N0. 7)。目的核酸和內(nèi) 控核酸的擴(kuò)增片段長度均為173bp。2)樣本提取在十份HBV病毒血清及一份正常人血清中加入相應(yīng)內(nèi)控核酸片段， 并使用深圳匹基生物工程有限公司生產(chǎn)的乙肝病毒核酸擴(kuò)增熒光定量檢測(cè)試劑盒對(duì)十一 份血清平行提取。最終獲得病毒血清核酸提取液十份及正常人血清核酸提取液一份。3)PCR擴(kuò)增同時(shí)加入HBV樣本擴(kuò)增特異性引物及相應(yīng)內(nèi)控引物進(jìn)行單管 二重?cái)U(kuò)增在收集的核酸提取液中加入IOXBuffer 2. 5 μ L、dNTPs (IOmM) 0. 5 μ L、 MgCl2(25mM) 1· 5μ L、引物 P3(SEQ IDN0. 4)、P4 (SEQ IDN0. 5)、P5 (SEQ IDN0. 6)各 1 μ L、rTaq DNApolymerase (5U/μ L)0. 125 μ L，補(bǔ)水至 25 μ L，混勻。PCR 反應(yīng)程序同上。4)試紙條檢測(cè)取3 μ L步驟3)中的擴(kuò)增產(chǎn)物與97 μ LPBS緩沖液充分混勻，滴在 免疫層析試紙條點(diǎn)樣孔處，肉眼觀察顯色結(jié)果(一般于15分鐘內(nèi)顯色)。在試紙條的有色 顆粒結(jié)合墊上固定有鏈親和素結(jié)合的乳膠顆粒，檢測(cè)線上固定有抗FITC的抗體，內(nèi)控線上 固定有抗Dig的抗體，質(zhì)控線上固定有BSA-Biotin。由圖4的結(jié)果可以看出，將正常人血清 擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣在試紙條上，質(zhì)控線和內(nèi)控線均有顯色，而檢測(cè)線無顯色，檢測(cè)結(jié)果為陰性，
9與樣本實(shí)際情況相符。將十份病毒血清擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣在試紙條上其中九份樣本的檢測(cè)試 紙條上出現(xiàn)三條帶，質(zhì)控線、內(nèi)控線及檢測(cè)線均有顯色，檢測(cè)結(jié)果為陽性，與樣本實(shí)際情況 相符；一份病毒血清擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣在試紙條上，試紙條上只出現(xiàn)質(zhì)控線，內(nèi)控線及檢測(cè)線均 不顯色，說明這份樣本出現(xiàn)假陰性，需重新測(cè)定。實(shí)施例2 (對(duì)加入內(nèi)控的試紙條法的半定量性能進(jìn)行考察)實(shí)驗(yàn)流程1)PCR擴(kuò)增分別將6種不同濃度的含HBV目的核酸序列的質(zhì)粒模板(5X101、 5X102、5X103、5X104、5X105、5X106copies/y L)和一定濃度的 HBV 內(nèi)控核酸片段 (50copies/yL)混合后作為模板，用HBV樣本擴(kuò)增特異性引物及相應(yīng)內(nèi)控引物進(jìn)行單管二 重?cái)U(kuò)增。HBV內(nèi)控核酸片段序列、HBV引物序列、相應(yīng)內(nèi)控核酸片段引物序列、反應(yīng)體系及反 應(yīng)程序同實(shí)施例1。2)試紙條檢測(cè)實(shí)施步驟同上，結(jié)果見圖5。由圖5的結(jié)果可以看出，當(dāng)病毒目的 核酸片段的濃度和內(nèi)控核酸濃度相同時(shí)(兩者均為50COpieS/yL)，檢測(cè)線與內(nèi)控線顯色 強(qiáng)度基本一致；當(dāng)病毒目的核酸片段的濃度繼續(xù)升高時(shí)，檢測(cè)線顯色強(qiáng)度不發(fā)生明顯變化， 而內(nèi)控線顯色強(qiáng)度逐漸減弱，病毒目的核酸片段的濃度達(dá)5X IO5Copies/μ L時(shí)，內(nèi)控線用 肉眼已無法觀察到。檢測(cè)線與內(nèi)控線顯色強(qiáng)度的相對(duì)強(qiáng)弱可以作為參考，用于對(duì)血液病原 體感染濃度進(jìn)行大致推斷。實(shí)施例3利用實(shí)施例1的方法對(duì)不同含量的HBV病毒血清進(jìn)行半定量檢測(cè)，其中內(nèi)控核 酸片段的濃度為 5000copies/yL，引物 P3(SEQ ID NO. 4)、P4 (SEQ ID NO. 5)各 lyL、引 物P5 (SEQ ID NO. 6) 0. 25 μ L待測(cè)血清中HBV病毒的濃度分別為1 X 102copies/100 μ L血 清、1 X 103copies/100 μ L 血清、1 X 104copies/100 μ L 血清、1 X 105copies/100 μ L 血清、 1 X 106copies/100 μ L血清。檢測(cè)結(jié)果如圖6，從圖6可看出，隨著待測(cè)血清中HBV病毒濃 度的提高，檢測(cè)線相對(duì)于內(nèi)控線的顯色強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，每100微升病毒血清含有病毒量大 于IO6Copies時(shí)，內(nèi)控線消失。
權(quán)利要求
一種加入內(nèi)控核酸片段對(duì)目的核酸進(jìn)行試紙條半定量可視化檢測(cè)的方法，其特征在于包括如下步驟(1)針對(duì)目的核酸制備與目的核酸片段Tm值相近的內(nèi)控核酸片段；(2)在待檢樣本中加入濃度及序列均已知的內(nèi)控核酸片段，同時(shí)提取待檢樣本中的核酸以及內(nèi)控核酸；(3)以步驟(2)提取得到的提取液為模板，在單管中加入針對(duì)目的核酸片段和內(nèi)控核酸片段的修飾有檢測(cè)用抗原的混合引物同時(shí)擴(kuò)增目的核酸片段和內(nèi)控核酸片段，得到帶有檢測(cè)用抗原的擴(kuò)增產(chǎn)物混合液；(4)將步驟(3)得到的含目的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物和內(nèi)控核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增產(chǎn)物混合液點(diǎn)樣在免疫層析試紙條上進(jìn)行免疫層析，通過層析方向上不同位置條帶的有無對(duì)目的核酸進(jìn)行定性，通過比較目的核酸與內(nèi)控核酸檢測(cè)條帶的顯色強(qiáng)度，估測(cè)被測(cè)樣本的拷貝數(shù)，對(duì)目的核酸進(jìn)行半定量分析；所述的層析方向上不同位置條帶處分別修飾有與檢測(cè)用抗原相對(duì)應(yīng)的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)所述的內(nèi)控核酸片段與目的核酸 片段在堿基數(shù)目和堿基構(gòu)成上均相同，堿基排列不同。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)所述的得到帶有檢測(cè)用抗原的擴(kuò) 增產(chǎn)物，可通過如下的兩種方法得到(i)以步驟(2)提取得到的提取液為模板，在單管中加入針對(duì)目的核酸片段和內(nèi)控核 酸片段的混合引物同時(shí)擴(kuò)增目的核酸片段和內(nèi)控核酸片段用一對(duì)基因特異性引物擴(kuò)增目 的核酸片段，該基因特異性上、下游引物分別修飾A抗原及B抗原，擴(kuò)增產(chǎn)物為帶有A抗原 及B抗原的目的核酸片段；用一對(duì)基因特異性引物擴(kuò)增內(nèi)控核酸片段，該基因特異性上、下 游引物分別修飾A抗原及C抗原，擴(kuò)增產(chǎn)物為帶有A抗原及C抗原的內(nèi)控核酸片段；( )以步驟(2)提取得到的提取液為模板，在單管中加入針對(duì)目的核酸片段和內(nèi)控核 酸片段的混合引物同時(shí)擴(kuò)增目的核酸片段和內(nèi)控核酸片段用一對(duì)基因特異性引物對(duì)目的 核酸片段進(jìn)行非對(duì)稱性擴(kuò)增，其中非限制性引物修飾B抗原，最終擴(kuò)增產(chǎn)物為帶有B抗原的 單鏈目的核酸片段；用一對(duì)基因特異性引物對(duì)內(nèi)控核酸進(jìn)行非對(duì)稱性擴(kuò)增，其中非限制性 引物修飾C抗原，最終擴(kuò)增產(chǎn)物為帶有C抗原的單鏈內(nèi)控核酸片段；設(shè)計(jì)一條修飾有A抗 原的目的核酸特異性探針和一條修飾有A抗原的內(nèi)控核酸特異性探針，加入擴(kuò)增體系，在 擴(kuò)增的同一管中分別與帶有B抗原的單鏈目的核酸片段及帶有C抗原的單鏈內(nèi)控核酸片段 互補(bǔ)，通過特異性雜交形成帶有檢測(cè)用抗原的擴(kuò)增產(chǎn)物目的核酸-探針復(fù)合物及內(nèi)控核 酸_探針復(fù)合物；或者，用一對(duì)基因特異性引物對(duì)目的核酸進(jìn)行非對(duì)稱性擴(kuò)增，其中非限制性引物修飾A 抗原，最終擴(kuò)增產(chǎn)物為帶有A抗原的單鏈目的核酸；用一對(duì)基因特異性引物對(duì)內(nèi)控核酸進(jìn) 行非對(duì)稱性擴(kuò)增，其中非限制性引物也修飾A抗原，最終擴(kuò)增產(chǎn)物為帶有A抗原的單鏈內(nèi)控 核酸；設(shè)計(jì)一條修飾有B抗原的目的核酸特異性探針和一條修飾有C抗原的內(nèi)控核酸特異 性探針，加入擴(kuò)增體系，在擴(kuò)增的同一管中分別與帶有A抗原的目的核酸及內(nèi)控核酸互補(bǔ)， 通過特異性雜交形成帶有檢測(cè)用抗原的擴(kuò)增產(chǎn)物目的核酸_探針復(fù)合物及內(nèi)控核酸_探 針復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于步驟(4)中所述的免疫層析試紙條為“三條線”免疫層析試紙條，其有色顆粒結(jié)合墊中的有色顆粒為表面修飾特異性抗A抗體的 有色顆粒；其包被膜上設(shè)有三條線將特異性抗B抗體固定于包被膜上形成的檢測(cè)線，將特 異性抗C抗體固定于包被膜上形成的內(nèi)控線，將A抗原修飾的蛋白固定于包被膜上形成的 質(zhì)控線。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的有色顆粒為膠體金、膠體硒或乳膠顆粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(4)對(duì)目的核酸進(jìn)行定性的依 據(jù)為如果質(zhì)控線及檢測(cè)線均顯色，則檢測(cè)結(jié)果為陽性，表明溶液中含有目的核酸；如果質(zhì)控 線、內(nèi)控線顯色而檢測(cè)線不顯色，則檢測(cè)結(jié)果為陰性，表明溶液中不含目的核酸；如果僅質(zhì) 控線顯色而內(nèi)控線、檢測(cè)線均不顯色，則結(jié)果為假陰性，表明提取、擴(kuò)增或試紙條檢測(cè)過程 中某一步或某幾步出現(xiàn)問題，結(jié)果不可信；如果質(zhì)控線不顯色，表明試紙條質(zhì)量出現(xiàn)問題， 結(jié)果不可信；步驟(4)對(duì)目的核酸進(jìn)行半定量的依據(jù)為在檢測(cè)線顯色的前提下，通過對(duì)檢 測(cè)線和內(nèi)控線的顯色強(qiáng)度進(jìn)行比較，估測(cè)被測(cè)樣本的拷貝數(shù)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本核酸濃 度的相對(duì)定量。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的待檢樣本為待檢血液、組織、分泌 物、尿液或糞便。
全文摘要
本發(fā)明屬于核酸檢測(cè)領(lǐng)域，公開了一種加入內(nèi)控核酸對(duì)病原體核酸進(jìn)行半定量檢測(cè)的方法。本發(fā)明在目的核酸的提取、擴(kuò)增以及試紙條檢測(cè)全程中加入相應(yīng)內(nèi)控，使內(nèi)控和目的片段平行接受操作，最終通過試紙條上檢測(cè)線、內(nèi)控線及質(zhì)控線三條帶的顯色有無和強(qiáng)度對(duì)比進(jìn)行半定量檢測(cè)。本發(fā)明使目的核酸在被處理的全過程都有相應(yīng)內(nèi)控作為陽性對(duì)照，避免了在試紙條檢測(cè)的過程中由于提取、擴(kuò)增或點(diǎn)樣失誤等環(huán)節(jié)使結(jié)果出現(xiàn)假陰性的情況。同時(shí)通過比較內(nèi)控線與樣本線的顯色強(qiáng)度，在免疫層析試紙條定性功能的基礎(chǔ)上引入了半定量功能，估測(cè)被測(cè)樣本的拷貝數(shù)，使檢測(cè)結(jié)果更為詳細(xì)、準(zhǔn)確和可靠。本發(fā)明操作便利、快速，可滿足臨床實(shí)際需要。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101957373SQ20101025855
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月20日
發(fā)明者周國華, 楊賢, 黃歡 申請(qǐng)人:華東醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所