專利名稱：一種檢測羊多頭蚴的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
專利說明本發(fā)明涉及有蹄動物的腦和脊髓內(nèi)寄生蟲病免疫抗體檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及針 對羊感染多頭蚴的診斷及其檢測需要的一種酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
腦多頭蚴病(Coenuriasis)又叫腦包蟲病，是由帶科的多頭帶絳蟲
(Taeniamulticeps)的中絳期幼蟲-腦多頭蚴(Coenurus cerebralis)寄生于綿羊、山
羊、黃牛、牦牛和駱駝等有蹄動物的腦和脊髓等處引起的一種寄生蟲病，也偶見有人感染此 病的報道；其成蟲寄生于犬、豺、狼和狐貍等的小腸內(nèi)。本病多發(fā)于6 18個月齡的綿羊， 病程緩慢，患病動物多以死亡為轉(zhuǎn)歸，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，血清學(xué)診斷技術(shù)被應(yīng)用于腦多頭蚴病的診斷，但由于所用的診斷抗原主 要是多頭蚴原頭節(jié)抗原和囊液抗原等蟲體天然抗原，它們來源十分有限，不能滿足實際的 需要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及其在寄生蟲學(xué)的應(yīng)用，帶科絳蟲基因重組抗原已經(jīng) 成為研究的焦點(diǎn)而且取得了突破性進(jìn)展，各國學(xué)者對用于絳蟲蚴病診斷的候選基因作了大 量研究工作。在診斷中，大分子蛋白在不同絳蟲間易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異性低，因而目前 側(cè)重于低分子量診斷抗原的研究。在豬囊蟲病的診斷方面，成功克隆表達(dá)了糖蛋白抗原 (LLGP)中的GP50、Tsl4和T24蛋白，8kDa的Ts8Bl和Ts8B2以及IOkDa蛋白；細(xì)粒棘球蚴 病上也成功克隆表達(dá)出了 AgB2、EpCl、硫氧還蛋白過氧化物酶(EgTPx)p29等小分子量蛋 白。以上抗原用于診斷，均有較好的敏感性和特異性。本研究借鑒豬囊尾蚴病和細(xì)粒棘球蚴病診斷抗原成功克隆表達(dá)的經(jīng)驗，通過分子 生物學(xué)的方法，人工合成一種可以用于腦多頭蚴病診斷的重組抗原，并構(gòu)建一種簡單、快速 的腦多頭蚴病診斷方法及其所需的酶聯(lián)免疫試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測羊多頭蚴的酶聯(lián)免疫試劑盒，可快速有效的檢測羊 多頭蚴感染的抗體水平，從分子生物學(xué)的角度，為預(yù)防、診斷腦包蟲病奠定基礎(chǔ)。實現(xiàn)本發(fā)明之目的技術(shù)解決方案如下一種檢測羊多頭蚴的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括試劑盒1內(nèi)包被著包被原的診斷膜片 1. 1，酶標(biāo)記物1.2，陰性對照血清1.3，陽性對照血清1.4，底物溶液1. 5，洗滌液1. 6，其特征 是，所述包被原是羊多頭蚴基因重組抗原蛋白，所述酶標(biāo)記物是酶標(biāo)抗抗體。所述的檢測羊多頭蚴的基因重組抗原蛋白，其氨基酸序列為序列表SEQ ID NO 1 所示序列。所述的檢測羊多頭蚴的基因重組抗原蛋白的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO :2所 示序列。所述的檢測羊多頭蚴的基因重組抗原蛋白的重組體是pET-32a-Tm7重組表達(dá)質(zhì)粒。所述檢測羊多頭蚴的酶聯(lián)免疫試劑盒的酶標(biāo)抗抗體是羊腦多頭蚴病陽性羊血清 為一抗，辣根過氧化物酶偶聯(lián)兔抗羊IgG為二抗。所述檢測羊多頭蚴的酶聯(lián)免疫試劑盒的診斷膜片1. 1是包被有包被原的硝酸纖 維素膜NC，陰性對照血清1. 3是未患羊腦多頭蚴病的陰性對照血清，陽性對照血清1. 4是羊 腦多頭蚴病陽性對照血清，底物溶液1. 5是DAB緩沖液。洗滌液1. 6 是洗滌緩沖液(pH7. 4PBST,含 0. 05 % Tween-20)由 NaCl 8. 0g、 KC10. 2g、KH2PO4O. 2g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、Tween-200· 5mL 加蒸餾水至 IOOOmL 即成。以上
屬液體成分的均分裝在小瓶內(nèi)，并置于試劑盒中。依據(jù)以上所述的羊多頭蚴基因重組抗原蛋白的一種制備方法，其步驟如下(1)從羊腦內(nèi)采到的多頭蚴原頭節(jié)為原料，提取總RNA，RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出目的基 因的全序列，命名為Tm7基因。(2) PCR產(chǎn)物測序正確后，克隆出目的基因的開放閱讀框0RF，將其連接到pMD18_T 載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后測序，發(fā)現(xiàn)克隆到的目的基因的開放閱讀框為207bp，編碼 68個氨基酸。(3)將此片段亞克隆入pET_32a(+)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Tm7，經(jīng)轉(zhuǎn)化 大腸桿菌BL21 (DE3)后IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE和Western-blot檢測表達(dá)產(chǎn)物。(4)將目的蛋白樣品過Ni-Charged Resin柱純化，收集洗脫峰蛋白液，進(jìn)行電泳 檢測，獲得純度很高的目的蛋白即為基因重組抗原蛋白。測序結(jié)果表明Tm7基因的全序列為378bp，其中開放閱讀框(ORF)為207bp，編 碼69個氨基酸，該蛋白分子量約7. BkDa0本次的測序結(jié)果已登錄到GenBank，登錄號為 FJ603044。將該序列進(jìn)行BlastN比對，它與豬囊尾蚴診斷抗原NC-3基因(AJ012669) 和Ts76基因(AF216696)的相似性均為97% ；與細(xì)粒棘球絳蟲EpCl基因(AF481884)和 EF-hand基因(AY942148)的相似性均為83%。其ORF與豬帶絳蟲的NC-3基因的ORF和 Ts76基因序列的部分ORF同源性均高達(dá)99. 52%，在35位和152位處發(fā)生了 C_T、A_G的轉(zhuǎn) 換，在92位處發(fā)生了 C-G的顛換；與細(xì)粒棘球絳蟲的EpCl基因和EF-hand基因序列的部分 ORF同源性均為85. 99%。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明具有顯著的優(yōu)點(diǎn)與積極效果1、本研究利用基因重組方法在大腸桿菌中成功表達(dá)Tm7蛋白，表達(dá)產(chǎn)物為約 27kDa的融合表達(dá)蛋白，并能被羊腦多頭蚴病陽性血清識別。表達(dá)出的目的蛋白，純化后能 作為抗原建立檢測羊腦多頭蚴病抗體的重組蛋白間接ELISA方法，其間接ELISA方法檢測 敏感性可達(dá)93.3%，特異性達(dá)94. 1 %，初步證明Tm7重組蛋白具有作為診斷抗原的特點(diǎn)，而 且本診斷抗原可以進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。2、在上述研究基礎(chǔ)上建立的一種檢測羊多頭蚴的酶聯(lián)免疫試劑盒，簡單、有效、快 速，將有效檢測綿羊、山羊、黃牛、牦牛和駱駝等有蹄動物的腦和脊髓等處的多頭蚴寄生蟲 ??；在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域為防止該病的蔓延與發(fā)展具有重要意義。


圖1本發(fā)明所述的酶聯(lián)免疫試劑盒構(gòu)成圖示意圖。
圖2RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定示意圖。圖3所述目的基因ORF的PCR擴(kuò)增鑒定圖(重組pET32a-Tm7質(zhì)粒PCR鑒定)。圖4重組質(zhì)粒pET32a-Tm7雙酶切鑒定檢測凝膠電泳圖。圖5所述Tm7蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測圖。圖6重組載體菌表達(dá)產(chǎn)物與腦多頭蚴病陽性羊血清發(fā)生反應(yīng)的免疫印跡圖。圖7所述的重組蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖。圖中的數(shù)字與字母的含義 圖11 試劑盒、1. 1 包被著包被原的診斷膜片、1. 2 酶標(biāo)記物、1. 3陰性對照血清、 1.4陽性對照血清、1.5底物溶液、1.6洗滌液。圖2M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ； 1，2 重組 pET32a-Tm7質(zhì)粒PCR鑒定。圖3M1，M2 :DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 重組pET32a_Tm7質(zhì)粒PCR產(chǎn) 物；2，3:EcoR I和Xho I雙酶切pET32a-Tm7質(zhì)粒。圖4M 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，2 經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的重組菌；3 未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌；4 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含質(zhì)粒pET-32a(+)的菌體；5 未 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含質(zhì)粒pET-32a(+)的菌體。圖5M 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 未經(jīng)誘導(dǎo)的重 組菌；2 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌；3 未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌的免疫印跡條帶；4 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的 重組菌表達(dá)蛋白的免疫印跡條帶。圖6M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，2 未純化重組蛋白；3，4 過柱純化重組蛋白。
具體實施例方式結(jié)合附圖給出實施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。從圖1看出，所說的一種檢測羊 多頭蚴的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括試劑盒內(nèi)包被著包被原的診斷膜片，酶標(biāo)記物，陰性對照血 清，陽性對照血清，底物溶液，洗滌液，所述包被原是羊多頭蚴基因重組抗原蛋白，所述酶標(biāo) 記物是酶標(biāo)抗抗體。所述的包被原羊多頭蚴基因重組抗原蛋白的獲得必須做一系列實驗。實驗所需蟲體腦多頭蚴，采自四川省攀枝花市某羊場。剝離后的腦多頭蚴去除囊 液，用無菌生理鹽水沖洗3 4次，_70°C保存?zhèn)溆谩嶒炈杈N和質(zhì)粒，E. coli DH5 α和BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技 有限公司；PMD18-T載體購自TaKaRa公司；pET32a(+)載體由本發(fā)明人所在實驗室保存。實驗所需試劑，總RNA抽提純化試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄 試劑盒購自Fermentas公司；T4DNA連接酶購自Promega公司；EcoR I，Xho I購自TaKaRa 公司；DNAMarker，質(zhì)粒小提試劑盒，普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自天根生化科技 有限公司；蛋白質(zhì) Marker SM0431 購自 Fermentas 公司；Ni-Charged Resin 購自 Bio-Rad 公司；HRP-兔抗羊IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；陰、陽性血清由發(fā)明人實驗室自 行保存。腦多頭蚴總RNA的提取和鑒定按照上海華舜生物工程有限公司總RNA提取試劑盒說明提取腦多頭蚴的總 RNA, -70°C保存?zhèn)溆?。利用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。圖2看出所述的包被原羊多頭蚴基因重組抗原蛋白的獲得，還需要首先以多頭帶 絳蟲腦多頭蚴的原頭節(jié)RNA為模板，用本實驗設(shè)計的一對特異性引物，采用RT-PCR擴(kuò)增出 大小約400bp的片段，與預(yù)期片段大小相符，見圖2RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 將該片段克隆到PMD 18-T質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，同樣得到與預(yù)期相符的，約400bp的片段。測序結(jié)果表明Tm7基因的全序列為378bp，其中開放閱讀框(ORF)為 207bp，編碼69個氨基酸，該蛋白分子量約7. BkDa0本次的測序結(jié)果已登錄到GenBank，登 錄號為FJ603044，命名為Tm7基因。 圖3圖4看出是pMD-Tm7重組質(zhì)粒的構(gòu)建。以測序正確的pMD_Tm7質(zhì)粒為模板， 用加酶切位點(diǎn)的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增出的片段大小約為200bp，與預(yù)期片段大小相 符，如圖3。將Tm7的閱讀框基因片段與原核表達(dá)載體pET-32a(+)連接，構(gòu)建pET32a-Tm7 重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入Ε. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，用1. 0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，可見約200bp處有目的條帶，將PCR鑒定為陽性的pET32a-Tm7 轉(zhuǎn)化菌提取質(zhì)粒，用EcoR I和Xho I雙酶切重組pET32a-Tm7質(zhì)粒，也得到了與預(yù)期大小相 符的約200bp片段如圖4，證明了所克隆的目的片段成功插入了 pET-32a(+)載體。經(jīng)測序 證明，基因的完整開放閱讀框成功亞克隆入pET-32a(+)載體?；蛑亟M抗原蛋白的核苷酸 序列為表SEQID NO 2所示序列。 圖5看出是pET-32a-Tm7重組質(zhì)粒的表達(dá)。重組質(zhì)粒pET32a_Tm7和空質(zhì)粒 pET-32a(+)在 Ε. coli BL21(DE3)中，以 IPTG 終濃度為 1. Ommol/L 誘導(dǎo) 3h，SDS-PAGE 鑒定 菌體蛋白，可見重組菌誘導(dǎo)后較誘導(dǎo)前出現(xiàn)一個大小約為27kDa的明顯條帶，此條帶與預(yù) 期蛋白分子量大小相一致，表明此重組質(zhì)粒在E. coli中表達(dá)了含有目的蛋白的融合蛋白 如圖5。因此所述的檢測羊多頭蚴的基因重組抗原蛋白的重組體是pET-32a-Tm7重組表達(dá) 質(zhì)粒。根據(jù)重組菌在不同IPTG濃度和不同誘導(dǎo)時間下表達(dá)量的差異，得出其最佳誘導(dǎo)條件 為=IPTG終濃度為0. 25mmol/L誘導(dǎo)4h。圖6是重組蛋白的Western-blot分析。為進(jìn)一步鑒定表達(dá)產(chǎn)物，將純化的表達(dá)蛋 白經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至纖維素NC膜上，以腦多頭蚴病陽性羊血清為一抗，以辣根過氧化 物酶偶聯(lián)兔抗羊IgG為二抗，DAB緩沖液為底物，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。重組載體菌表達(dá)產(chǎn) 物可與腦多頭蚴病陽性羊血清發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)顯色帶如圖6，說明表達(dá)的蛋白質(zhì)具有反應(yīng)原 性。因此所述檢測羊多頭蚴的酶聯(lián)免疫試劑盒的酶標(biāo)抗抗體是羊腦多頭蚴病陽性羊血清為 一抗，辣根過氧化物酶偶聯(lián)兔抗羊IgG為二抗。圖7是重組蛋白的純化。將蛋白樣品過Ni-Charged Resin柱純化，收集洗脫峰蛋 白液，進(jìn)行電泳檢測，雜帶基本除去，得到純度很高的樣品，如圖7。紫外分光光度計測定，目 的蛋白的濃度為1. 86mg/ml。所述的檢測羊多頭蚴的基因重組抗原蛋白，其氨基酸序列為序 列表SEQ ID NO 1所示序列。綜上所述，羊多頭蚴基因重組抗原蛋白的一種制備方法，其步驟如下(1)從羊腦內(nèi)采到的多頭蚴原頭節(jié)為原料，提取總RNA，RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出目的基 因的全序列，命名為Tm7基因。(2) PCR產(chǎn)物測序正確后，克隆出目的基因的開放閱讀框0RF，將其連接到pMD18_T 載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后測序，發(fā)現(xiàn)克隆到的目的基因的開放閱讀框為207bp，編碼 68個氨基酸。(3)將此片段亞克隆入pET_32a(+)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Tm7，經(jīng)轉(zhuǎn)化 大腸桿菌BL21 (DE3)后IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE和Western-blot檢測表達(dá)產(chǎn)物。(4)將目的蛋白樣品過Ni-Charged Resin柱純化，收集洗脫峰蛋白液，進(jìn)行電泳 檢測，獲得純度很高的目的蛋白即為基因重組抗原蛋白。
的確定
下面是為建立檢測羊多頭蚴的酶聯(lián)免疫試劑盒所需的間接ELISA最佳工作條件 表1是方陣試驗的P/N值結(jié)果
權(quán)利要求
一種檢測羊多頭蚴的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括試劑盒1內(nèi)包被著包被原的診斷膜片1.1，酶標(biāo)記物1.2，陰性對照血清1.3，陽性對照血清1.4，底物溶液1.5，洗滌液1.6，其特征是，所述包被原是羊多頭蚴基因重組抗原蛋白，所述酶標(biāo)記物1.2是酶標(biāo)抗抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測羊多頭蚴的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是所述的羊多頭蚴 基因重組抗原蛋白，其氨基酸序列為序列表SEQID NO 1所示序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測羊多頭蚴的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是所述的羊多 頭蚴基因重組抗原蛋白的核苷酸序列為表SEQID NO 2所示序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測羊多頭蚴的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是所述基因重 組抗原蛋白的表達(dá)載體是pET-32a-Tm7重組表達(dá)質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測羊多頭蚴的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是所述酶標(biāo)抗抗體 是羊腦多頭蚴病陽性羊血清為一抗，辣根過氧化物酶偶聯(lián)兔抗羊IgG為二抗。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測羊多頭蚴的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是所述診斷膜片 1. 1是包被有包被原的硝酸纖維素膜NC，陰性對照血清1. 3是未患羊腦多頭蚴病的陰性對 照血清，陽性對照血清1. 4是羊腦多頭蚴病陽性對照血清，底物溶液1. 5是DAB緩沖液，洗 滌液1. 6是洗滌緩沖液(pH7. 4PBST)，以上屬液體成分的均分裝在小瓶中，并置于試劑盒1 中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羊多頭蚴基因重組抗原蛋白的制備方法，其步驟如下(1)從羊腦內(nèi)采到的多頭蚴原頭節(jié)為原料，提取總RNA，RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出目的基因的 全序列，命名為Tm7基因。(2)PCR產(chǎn)物測序正確后，克隆出目的基因的開放閱讀框0RF，將其連接到pMD 18-T載 體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci后測序，發(fā)現(xiàn)克隆到的目的基因的開放閱讀框為207bp，編碼68 個氨基酸。(3)將此片段亞克隆入pET-32a(+)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Tm7，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸 桿菌BL21 (DE3)后IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE和Western-blot檢測表達(dá)產(chǎn)物。(4)將目的蛋白樣品過Ni-ChargedResin柱純化，收集洗脫峰蛋白液，進(jìn)行電泳檢測， 獲得純度很高的目的蛋白即為基因重組抗原蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開一種檢測羊多頭蚴的酶聯(lián)免疫試劑盒，涉及寄生蟲病免疫抗體檢測技術(shù)領(lǐng)域。其包被原是羊多頭蚴基因重組抗原蛋白，酶標(biāo)記物是酶標(biāo)抗抗體；酶標(biāo)抗抗體是羊腦多頭蚴病陽性羊血清為一抗，辣根過氧化物酶偶聯(lián)兔抗羊IgG為二抗；羊多頭蚴基因重組抗原蛋白，其氨基酸序列為表SEQ ID NO1所示序列，其核苷酸序列為表SEQID NO2所示序列；表達(dá)重組體是pET-32a-Tm7重組表達(dá)質(zhì)粒；診斷膜片是包被有包被原的硝酸纖維素膜，陰性對照血清是未患羊腦多頭蚴病的陰性對照血清，陽性對照血清是羊腦多頭蚴病陽性對照血清，底物溶液是DAB緩沖液，洗滌液是pH7.4PBST緩沖液；上屬液體的均分裝在小瓶內(nèi)，置試劑盒中；人工合成重組抗原，構(gòu)建了簡單、快速的腦多頭蚴病診斷方法所需的酶聯(lián)免疫試劑盒。
文檔編號G01N33/531GK101968489SQ20101026167
公開日2011年2月9日 申請日期2010年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月25日
發(fā)明者古小彬, 安曉雪, 彭雪蓉, 楊光友, 王淑賢 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)