專利名稱：用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)人體中hmga2含量的體外診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫體外診斷試劑領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種采用酶聯(lián)免疫法的檢測(cè)HMGA2抗原的體外診斷試劑盒及制備方法。
背景技術(shù)：
高遷移率蛋白A(High mobility group A，HMGA)家族是細(xì)胞核內(nèi)一組小分子的染色體結(jié)合蛋白，包括HMGAla，HMGAlb，和HMGA2三種成員。各成員分子內(nèi)均含有三個(gè)短的 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能與DNA分子小溝內(nèi)的A-T豐富區(qū)結(jié)合，在形成高度立體結(jié)構(gòu)特異的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體中具有構(gòu)筑因子(architecturalfactor)的作用。HMGA2在細(xì)胞內(nèi)的正常功能除已知的與胚胎發(fā)育有關(guān)外，其他尚未完全明確，但由于編碼基因位于許多腫瘤細(xì)胞染色體斷裂點(diǎn)的簇集區(qū)，它的異常表達(dá)與腫瘤的關(guān)系在國(guó)際上已日益引起關(guān)注，由于其生物學(xué)行為類似癌基因，已逐漸被視為一種潛在的腫瘤診斷和判斷預(yù)后的生物標(biāo)記。乳腺癌是嚴(yán)重危及人體生命的惡性腫瘤。它是乳房腺上皮細(xì)胞在多種致癌因子的作用下發(fā)生了基因突變，隨之乳腺細(xì)胞便喪失了正常細(xì)胞的特性，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞連接松散，癌細(xì)胞很容易脫落游離，隨血液或淋巴液等播散全身，形成早期的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，直接威脅人的生命，給乳腺癌的臨床治愈增加了很大困難。影響腫瘤發(fā)展的基因可分為兩類 一類基因在DNA水平發(fā)生突變直接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，如BRCA1，BRCA2, P53等；另一類是不同層次表達(dá)水平出現(xiàn)變化促使腫瘤的生成和發(fā)展，如C-erbB2，Nm23等。乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展均是受到來(lái)自以上兩類多種基因共同調(diào)控的結(jié)果。乳腺癌常發(fā)病于40歲以上的婦女，根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布乳腺癌發(fā)生每年遞增 0. 2 0. 3%，每3分鐘就有一名婦女被診斷為乳癌，每13分鐘就有一名患者死于乳癌。乳癌發(fā)病率在我國(guó)居女性惡性腫瘤的第二位，且有逐年上升趨勢(shì)，在某些地區(qū)已處于第一位。 近年發(fā)現(xiàn)其發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)，它已嚴(yán)重威脅婦女的身心健康。目前，中、美、德等國(guó)研究人員均已經(jīng)證明了 HMGA2與多種癌癥有著特定的關(guān)系。自1997年P(guān)iere等利用RNA印跡分析檢測(cè)HMGA2在乳腺組織中的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其在浸潤(rùn)性乳腺癌高度表達(dá)，在正常乳腺或良性乳腺病變中幾乎不表達(dá)以來(lái)，至今國(guó)外已有某些科研機(jī)構(gòu)組對(duì)其染色體定位、序列和結(jié)構(gòu)等作了一定的基礎(chǔ)性研究，作為乳腺癌的特異基因，它在乳腺癌的輔助診斷，判斷預(yù)后以及基因治療等方面作用是不可低估的。早期診斷是提高乳腺癌5年生存率的關(guān)鍵，尋求簡(jiǎn)單而又可靠的早期診斷方法， 提高早期診斷率是當(dāng)前迫切需要解決的問(wèn)題。盡管組織病理學(xué)等診斷學(xué)是臨床工作的金標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤大小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否，雌、孕激素受體狀態(tài)以及血管浸潤(rùn)等多種病理情況已經(jīng)對(duì)乳腺癌判定預(yù)后和選擇治療方案有了許多指導(dǎo)意義，但隨著分子生物學(xué)研究的不斷拓展和深入，發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用乳腺癌相關(guān)的特異腫瘤標(biāo)志物已成為可能，這為研究乳腺癌的診斷提供了更多更新的信息
發(fā)明內(nèi)容
為了解決目前臨床上檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物單一、靈敏度低、其他方法有弊端、放免試劑有限期短、放射性廢棄物污染危害等多種因素干擾、底物大部分有毒等不足，本發(fā)明提供了一種采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)人體HMGA2含量的體外診斷試劑盒及其制備方法。本發(fā)明涉及一種用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)體內(nèi)HMGA2含量的體外診斷試劑盒。它是由 HMGA2固相板、酶標(biāo)記物、顯色劑、終止液、洗滌液組成。其中所述的固相板為兔抗人HMGA2 包被板、酶標(biāo)記物為HRP與兔抗人HMGA2結(jié)合的溶液。所述的的HMGA2固相板是用0. 2M pH值為6. 5的磷酸鹽緩溶液配置成所需的抗體濃度，并將包被液負(fù)載于固相載體上，用含PH7. 4的牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖溶液封閉后，真空干燥，鋁箔袋密封，2-8 °C保存。所述的酶標(biāo)記物配置方法為含有10% -30%的HRP的磷酸鹽緩沖溶液。使用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)人體HMGA2，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，特意型號(hào)，與其他方法學(xué)診斷腫瘤標(biāo)志物的結(jié)果符合度極高。是一種新型腫瘤標(biāo)志物的診斷試劑盒。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上優(yōu)選結(jié)果為所述的酶結(jié)合物為含有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的溶液，底物為TMB，終止液為IN的
鹽酸溶液。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供了一種新型檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，包括一下步驟1.包被固相載體的制備以兔抗人HMGA2抗體包被固相載體采用一下方法制備 用0. 2M pH值為6. 5的磷酸鹽緩溶液配置成所需的抗體濃度，并將包被液負(fù)載于固相載體上，用含1%ρΗ7. 4的牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖溶液封閉后，真空干燥，鋁箔袋密封，2-8°C 保存。2.酶標(biāo)記物的制備將將0. OlM pH9. 6碳酸鹽緩沖液透析的抗人HMGA2加入含有 HRP的溶液中，反應(yīng)結(jié)合后通過(guò)層析柱純化、分裝、低溫避光保存。
具體實(shí)施例方式將兔抗HMGA2抗體用于制備ELISA試劑盒的制備和操作如下1.微孔包被多克隆兔抗人HMGA2包被到96孔I型微孔板上。在0. 2M NaP04, pH值為6. 5的緩沖液中制備0. 01mg/mL兔抗人HMGA2多克隆的抗體溶液。將100 μ L抗體溶液添加到各微孔中，并在4°C溫育整夜。然后除去抗體溶液，用300 μ L IOmM PH值7. 4的磷酸鹽緩沖液沖洗各微孔，然后添加150 μ L含牛血清白蛋白溶液，PH值7. 4的IOmM磷酸鹽緩沖液到各微孔中。微孔板在室溫中溫育整夜。除去含牛血清白蛋白的溶液，往各微孔中添加250 μ L含2. 5%蔗糖溶液，PH值為7. 4的IOmM磷酸鹽緩沖液，溫育四小時(shí)。除去蔗糖溶液，真空干燥微孔板整夜。微孔板保持干燥。2.辣根過(guò)氧化物酶的結(jié)合使用前，用IL PH值9. 6的0. OlM碳酸氫鈉緩沖液透析5mg兔抗人HMGA2多克隆抗體，2-8°C下整夜。此外，7. 5mg辣根過(guò)氧化物酶溶解于1. 9L蒸餾水中，混合時(shí)逐滴將0. 4mL 0. IM的高碘酸鈉溶液加入辣根過(guò)氧化物酶溶液中。在暗處混合25分鐘，然后用IL PH值 4. 3的ImM醋酸鹽緩沖液透析該溶液，2-8°C下整夜。之后將透析的辣根過(guò)氧化物酶溶液添加到純化的兔抗人HMGA2多克隆抗體中，該溶液在室溫下暗處混合3-4小時(shí)。將定量的硼氫化鈉溶液添加到反應(yīng)混合物中，并置于2-8°C下兩小時(shí)，期間不時(shí)混合。最后，用IL PH值 7. 2，含0. 85%氯化鈉的0. 05M磷酸鉀緩沖液透析該溶液。再用S-300柱進(jìn)一步純化該結(jié)合物溶液。3.人HMGA2標(biāo)準(zhǔn)曲線用胎牛血清將重組人HMGA2(取自 HMGene，Inc.)稀釋到 0，1. 5，3. 0，6. 0，12，24， 48，96，及 192ng/mL.該實(shí)驗(yàn)按下列步驟進(jìn)行指定數(shù)量的微孔安放在支架上。往各孔中添加100 μ L標(biāo)準(zhǔn)品。室溫下在3，OOOrpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上振蕩溫育60分鐘。除去溫育的混合物，用蒸餾水沖洗微孔五次。除去所有殘留水滴。往各孔中添加100 μ L兔抗人HMGA2辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物試劑。室溫下在3，OOOrpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上振蕩溫育60分鐘。除去溫育的混合物，用蒸餾水沖洗微孔五次。除去所有殘留水滴。添加lOOyLTMB。室溫下在3，OOOrpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上振蕩溫育20分鐘。添加100 μ L IN HCl終止顯色反應(yīng)。在15分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處讀取吸收值。4.終止液的制備配置過(guò)程(以配置IOOOml為例)量取或稱取916. 7ml純化水于適當(dāng)容器中；I量取83. 3ml濃鹽酸緩慢加至916. 7ml純化水中，充分溶解即可。5.洗滌液的制備(以配置IOOOml為例)量取或稱取795ml純化水于適當(dāng)容器中I量取200ml 0. 5M磷酸鉀緩沖液(pH = 7. 20)于上述溶液中，充分混勻I稱取85. Og NaCl于上述溶液中，充分溶解I量取5ml Tween 20于上述溶液中，充分溶解I用6N HCL 或 5N NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 7. 00 (士 0. 1) 20 倍稀釋后 pH 為 7. 20I根據(jù)需要過(guò)0. 22 μ m的濾膜。使用時(shí)用蒸餾水稀釋20倍。6.人 HMGA2 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線
權(quán)利要求
1.用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)人體中HMGA2含量的體外診斷試劑盒，其特征在于，所述體外診斷試劑盒是有HMGA2固相板、酶標(biāo)記物、顯色劑、終止液、洗滌液組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述固相板是包被了兔抗人HMGA2多克隆抗體的96孔微孔板。其包被濃度為0. 01mg/mL兔抗人HMGA2多克隆抗體，溶液含有 ρΗ6· 5的0. 2mol/L磷酸鈉及Ph7. 4的牛血清白蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的酶標(biāo)記物為HMGA2辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述顯色劑為TMB。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的終止液為IN的鹽酸溶液。
6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的洗滌液為0.5M磷酸鉀緩沖液。使用時(shí)用蒸餾水稀釋20倍。
7.如權(quán)利要求1所述的試劑盒的方法，其特征在于包括一下步驟配制兔抗人HMGA2 多克隆抗體，以HRP為抗體結(jié)合物，配置顯色劑、終止液及洗滌液，分裝上述組分并組裝為成品。
8.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述以兔抗人HMGA2抗體包被固相載體采用以下方法制備用0. 2M pH值為6. 5的磷酸鹽緩溶液配置成所需的抗體濃度，并將包被液負(fù)載于固相載體上，用含1%ρΗ7. 4的牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖溶液封閉后，真空干燥，鋁箔袋密封，2-8°C保存。
9.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的酶標(biāo)記物配置方法為含有 10% -30%的HRP的磷酸鹽緩沖溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)體內(nèi)HMGA2含量的體外診斷試劑盒。它是由HMGA2固相板、酶標(biāo)記物、顯色劑、終止液、洗滌液組成。用于人體中HMGA2含量的測(cè)定。其優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)限低，是一種新型腫瘤標(biāo)志物，同時(shí)對(duì)于膠體金法、化學(xué)發(fā)光法的其他檢測(cè)腫瘤結(jié)果一致性較好，因此，對(duì)大中小型醫(yī)院均適用，具有臨床實(shí)用性，為臨床診斷腫瘤與預(yù)后檢測(cè)腫瘤情況提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102375064SQ20101026530
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者張開山 申請(qǐng)人:杭州華得森生物技術(shù)有限公司