專利名稱：萊克多巴胺殘留的時間分辨免疫分析檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種化學(xué)品污染殘留的檢測試劑盒及其制備 方法，具體涉及一種檢測萊克多巴胺殘留的時間分辨免疫分析試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
食品安全是關(guān)系到廣大人民的日常生活的一件大事。食品安全問題主要包括食品 中的物理危害、化學(xué)危害和微生物危害等幾個因素，其中化學(xué)危害主要包括獸藥殘留、農(nóng)藥 殘留、重金屬、環(huán)境有害物等。在過去的幾十年中，隨著集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，獸藥作為添加劑及藥物廣泛在畜 牧業(yè)中使用，由此導(dǎo)致的動物性食品中獸藥的殘留問題日益突出。其主要是指動物在使用 藥物預(yù)防、治療疾病時，使用促生長飼料藥物添加劑后藥物以原形或其代謝產(chǎn)物蓄積在動 物的組織器官或可食性產(chǎn)品(如奶、蛋)中。同一動物不同臟器獸藥殘留量不同，按殘留量 由高到低一般為肝>膽汁>腎>肌肉，注射部位及脂肪的殘留量一般也較多。非法添加和 加大藥量，不遵守休藥期規(guī)定，任意擴(kuò)大使用范圍和濫用藥物等行為造成的獸藥殘留事件， 已嚴(yán)重危害到人民群眾的健康，嚴(yán)重者甚至可以引起死亡，同時這些殘留藥物也會對環(huán)境 產(chǎn)生影響，對周圍食品產(chǎn)生再次污染。萊克多巴胺(Ractopamine，簡稱RAC)，又名雷托巴胺，化學(xué)名為1_(4_羥基苯 基)-2 [1-甲基-3- (4-羥基苯基)-丙氨基]-乙醇鹽酸鹽，屬于D 2-腎上腺受體激動劑類 藥物，是繼克倫特羅后最常被濫用添加的D2-腎上腺受體激動劑類藥物，其結(jié)構(gòu)式如式(I)
所示它是一種醫(yī)藥原料，一種可用于治療沖血性心力衰竭癥的強(qiáng)心藥。還可以用于治 療肌肉萎縮癥，增長肌肉，減少脂肪蓄積，并對胎兒和新生兒生長有益。美國FDA在2000年 批準(zhǔn)，可以用于動物營養(yǎng)重新配劑，廣泛地用于畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)。可以同時提高動物的日增
重，提高飼料利用率，提高動物的蛋白質(zhì)含量。但由于D 2-興奮劑易在動物臟器中積聚殘 留，并可通過食物鏈進(jìn)入人體，嚴(yán)重危害人類健康。目前，萊克多巴胺是最常用的添加劑之 一，在我國濫用尤其嚴(yán)重，其逐步取代克侖特羅，成為不法分子謀取經(jīng)濟(jì)利益的新手段。建 立快速、簡單、方便、有效的檢測手段是目前控制萊克多巴胺非法使用的迫切任務(wù)。目前，檢測RAC殘留的方法主要有以下幾種高效液相色譜法(HPLC)、氣相色 譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CE)以及免疫分析方法(IA)。儀器方法雖然靈敏精確，但需要昂貴的專業(yè)儀器，分析費(fèi)時，成本較高。免疫分析 方法具有簡單、快速、靈敏及成本低的特點(diǎn)，可達(dá)痕量(μ g kg—1)水平，是目前世界各國推行 并實施的一種高通量初篩方法，時間分辨免疫分析檢測方法屬于免疫分析方法的一種，其 實際上是在熒光分析(FIA)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，是一種特殊的熒光分析。時間分辨免疫分析(TRFIA)的基本原理是其采用了特殊的鑭系金屬即三價稀土 離子(Eu3+、Tb3+、Dy3+、Sm3+)及螯合劑(代替熒光物質(zhì)、同位素或酶)。標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽、激 素、抗體、核酸探針或生物活性細(xì)胞，待反應(yīng)體系(如抗原抗體反應(yīng)、核酸探針反應(yīng)、生物素 親和素反應(yīng)、靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞的殺傷反應(yīng)等)發(fā)生后，用時間分辨分析儀測定最后產(chǎn)物 中的熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光值的強(qiáng)弱，判斷體系中分析物的濃度，達(dá)到定量分析的目的。時間分辨免疫分析檢測方法在國外已被廣泛應(yīng)用于臨床檢測，近年在許多新領(lǐng)域 得到應(yīng)用，如免疫組織化學(xué)、微陣列，并可用于雙標(biāo)記、三標(biāo)記和四標(biāo)記等多標(biāo)記免疫分析。 熒光免疫檢測方法作為一項具有廣闊發(fā)展?jié)摿Φ男屡d生物學(xué)技術(shù)，已經(jīng)給標(biāo)記免疫學(xué)帶來 一場革命。本發(fā)明對免疫檢測技術(shù)進(jìn)一步應(yīng)用于食品中獸藥殘留的快速檢測提供一種新途 徑。但目前尚無采用時間分辨免疫分析法檢測萊克多巴胺的相關(guān)技術(shù)報道，更沒有一 種適合進(jìn)行萊克多巴胺時間分辨免疫分析檢測的試劑盒，以便于實現(xiàn)高靈敏度、操作簡單 的大批量快速檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測萊克多巴胺殘留的時間 分辨免疫分析檢測試劑盒。本發(fā)明的另一個目的是提供所述檢測萊克多巴胺殘留的方法，高靈敏度、操作簡 單，能大批量快速檢測。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)提供一種檢測萊克多巴胺殘留的時間分辨免疫分析檢測試劑盒，包括包被了萊克 多巴胺抗原的酶標(biāo)板、萊克多巴胺抗體、鑭系元素標(biāo)記羊抗兔或羊抗鼠抗體(二抗)；所述 鑭系元素包括Eu3+、Tb3+、Dy3+、Sm3+等稀土元素。所述萊克多巴胺抗原是碳二亞胺法(EDC)、活潑酯法(DCC、NHS)、混合酸酐法(氯 甲酸異丁酯)將萊克多巴胺半抗原與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到的。所述載體蛋白包括牛血清 白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)等載體蛋白。將萊克多巴胺與氯乙酸鈉進(jìn)行鹵代反應(yīng)，取代萊克多巴胺分子上的羥基，合成含 有2個碳的羧基間隔臂的萊克多巴胺半抗原；或?qū)㈨樁∠┒狒c萊克多巴胺中的氨基進(jìn) 行?；磻?yīng)，合成含有4個碳的羧基間隔臂的萊克多巴胺半抗原。將含有2個碳的羧基間隔臂的半抗原用于免疫原的制備，將含有4個碳的羧基間 隔臂的半抗原用于包被原的制備，免疫原與包被原通過柱層析進(jìn)行純化，純度經(jīng)SDS-PAGE 電泳鑒定。本發(fā)明免疫原與包被原采用不同的半抗原結(jié)構(gòu)將更有利于提高檢測的靈敏度。所述萊克多巴胺抗體包括單克隆抗體、兔多克隆抗體或基因工程抗體。單克隆抗體的制備動物免疫以含有2個碳的羧基間隔臂的半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原對Balb/c小鼠進(jìn)行間隔免疫，間接免疫分析檢測并得到血液里含有萊克多巴胺特異性抗體的 小鼠脾臟。細(xì)胞融合與克隆取產(chǎn)生特異性抗體的Balb/c小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP20融 合，采用間接競爭時間分辨免疫分析方法測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法或 顯微克隆法對陽性孔進(jìn)行克隆化，得到并建立產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成細(xì)胞懸液，分裝 于凍存管，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍 存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅 菌石蠟油，7 14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，7 10天后采集腹水。經(jīng)辛酸-飽和硫酸胺 法或親和層析法進(jìn)行腹水純化，純度經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，小瓶分裝，-20°C保存。萊克多巴胺兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以萊克多巴胺與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原對新 西蘭大白兔進(jìn)行免疫，多次免疫后測定血清抗體效價，心臟采血，經(jīng)硫酸胺分級沉淀得到純 化的多克隆抗體。萊克多巴胺基因工程抗體的制備基因工程抗體主要指小分子抗體，包括Fab (由完整的輕鏈和Fd構(gòu)成)，F(xiàn)v (由Vh 和\構(gòu)成)，ScFv (單鏈抗體，Vh和\之間由一條連接肽連接而成)，單域抗體(僅由Vh組 成)等經(jīng)基因工程技術(shù)改造后的抗體。制備方法為提取萊克多巴胺單克隆細(xì)胞或經(jīng)萊克多巴胺免疫原免疫后的小鼠 脾細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計抗體輕重鏈擴(kuò)增引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出抗體的輕 重鏈基因，插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中表達(dá)，利用免疫親和方法進(jìn)行純化，純度由 SDS-PAGE電泳鑒定。所述鑭系元素標(biāo)記羊抗兔或羊抗鼠抗體的制備，以Eu3+標(biāo)羊抗兔為例，取溶 解于0. 05mol/L PBS pH7. 0的5mg/mL羊抗鼠IgG Iml，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖鹽條件， 洗脫液為50mmol/L pH 9. 6NaC03-NaHC03緩沖液。收集蛋白峰，經(jīng)紫外吸收分析定量 (1. 46A280-0. 74A260)，用上述洗脫液稀釋羊抗鼠至2mg/mL。取500 μ L稀釋后的羊抗鼠IgG 加入含0. 2mg的Eu3+-N2-[ρ-異氰酸-芐基]-二乙酸烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的棕色小 瓶中，置于28°C恒溫烘箱中反應(yīng)48h，反應(yīng)液用50mmol/L Tris-HCl pH 7. 8緩沖液平衡的 SepharoseCL-6B (1 X 30cm)層析，測定每管的熒光計數(shù)值，檢測稀釋后的第一個計數(shù)峰，稀 釋后備用。標(biāo)記率=標(biāo)記個/IgG分子數(shù)為了方便現(xiàn)場操作和批量檢測，所述試劑盒還可以包括萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液、增 強(qiáng)液、濃縮洗滌液、樣品稀釋濃縮液。優(yōu)選地，還可以包括盒體、包被緩沖液、洗滌緩沖液、封閉液和蓋板膜。所述萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液是濃度為1000 μ g/L的萊克多巴胺(RAC)標(biāo)準(zhǔn)品貯備 液，使用前再配成濃度梯度為8 μ g/L、4 μ g/L,2 μ g/L、1 μ g/L、0. 5 μ g/L、0 μ g/L的萊克多 巴胺(RAC)標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。所述增強(qiáng)液包括β - 二酮體、三辛基氧化磷(TOPO)、TritonX-100、冰醋酸和鄰苯二甲酸氫鉀(pH值為2.0 3. 2)；將6mL冰醋酸用0. lmol/L的鄰苯二甲酸氫鉀調(diào)pH值至 3. 2，加入 15 μ mol β - 二酮體(β -ΝΤΑ)，50 μ mol 三辛基氧化膦，ImL Triton X-100，加三 蒸水定容至1L。所述濃縮洗液包括0. 5 1. 5 % (體積比濃度)。吐溫20的磷酸鹽緩沖液(pH值7. 4，0. lmol/L)，為常規(guī)使用濃度的15 25倍。所述濃縮稀釋液pH值7. 4 8. 0,0. 1 0. 25mol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 (Tris-HCl)，為常規(guī)使用濃度的5 15倍。酶標(biāo)板是96孔酶標(biāo)板，采用聚苯乙烯微孔板，該微孔板包被有濃度為75 μ g/L抗 萊克多巴胺抗原，并封閉微孔表面未吸附位點(diǎn)；以封閉液室溫封閉，所述封閉液包括溶于 PBS的脫脂奶粉溶液(5g脫脂奶粉100mL PBS)。以稀釋液稀釋至終濃度3 % (體積比濃 度)的小牛血清3mL (滅活)。本發(fā)明主要試劑以工作液的形式提供，節(jié)省操作時間，試劑盒的制備方法如下(1)包被了萊克多巴胺抗原的酶標(biāo)板的制備方法將RAC-OVA以包被緩沖液稀釋 為75μ g/L，向酶標(biāo)板微孔中加入抗原100 μ L，放入4°C冰箱中包被過夜，室溫平衡后洗板 兩次，以脫脂奶粉封閉液(250yL)37°C封閉lh，洗板三次，用無塵吸水紙上拍干，干燥后用 鋁膜真空密封保存。固定萊克多巴胺抗原載體為以下物質(zhì)中的一種，例如聚苯乙烯、硝酸纖 維素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交聯(lián)葡萄糖、玻璃、硅橡膠或瓊脂糖凝膠等。(2) RAC抗體稀釋液的制備方法將RAC單克隆抗體用辛酸-硫酸銨法純化后，用 PBS稀釋成lmg/mL分裝備用。(3)Eu3+ 標(biāo)羊抗鼠用含 0. 2%的 pH 7. 85Tris_HCl 稀釋 200 倍(4)萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制以濃度為1000 μ g/L的RAC作為貯備液，使用前 再配成濃度梯度為0、0. 1,0. 3,0. 9,2. 7,8. 1 μ g/L的RAC標(biāo)準(zhǔn)品工作液。(5)增強(qiáng)液的配制6mL冰醋酸用0. lmol/L的鄰苯二甲酸氫鉀調(diào)pH值至3. 2，加 Λ 15 μ mol Q- 二酮體(□ -NTA)，50 μ mol 三辛基氧化膦(Τ0Ρ0)，ImL Triton X-100，加三 蒸水定容至1L。(6)包被緩沖液的配制取 Na2CO3O. 375g，NaHCO3O. 732g，NaCl 2. 250g， NaN3O. 100g，加蒸餾水至250mL，得0. lmol/L碳酸鹽緩沖液。(7)洗滌緩沖液(PBST)的配制取 KH2P040. 4g，Na2HPO4 · 12Η205· 8g，NaCl 16. Og, KCl 0. 4g, Tween-201. OmL，加蒸餾水至 2000mL。(8)封閉液1)脫脂奶粉5g溶于IOOmL PBS ；2)小牛血清3mL(滅活)，以稀釋液
稀釋至終濃度3%。(9)稀釋液(50mmol/L Tris-HCl, pH 7. 85)取 Tris-base 6. 4g, NaCl 9. 0g, NaN3O. 4g，以濃HCl (12M)調(diào)整其pH值為7. 85，加蒸餾水定容至IL0本發(fā)明同時提供了檢測萊克多巴胺殘留的方法，包括以下步驟(1)樣品前處理；a.尿液樣本處理清澈尿液樣品可以直接進(jìn)行檢測分析。若尿樣呈渾濁狀，2000r/min離心5min或 過濾，用上清液檢測。b.飼料樣本處理
將飼料粉碎，稱取2g置于50mL試管中，加入12mL10%氨化甲醇(pH值為9 10的 氨水溶液9份+甲醇1份)，充分混勻振蕩廣2min。加入9mL乙酸乙酯，振蕩20min。5000r/ min(4000g)離心lOmin。取有機(jī)相500 μ L于另一試管中，用氮?dú)獯蹈伞＜尤霕悠废♂屢?500 μ L稀釋后直接檢測。稀釋倍數(shù)10應(yīng)在結(jié)果計算中考慮。c.組織(肌肉、肝臟、腎臟等)樣本處理將組織破碎，用超聲儀或類似儀器將組織均質(zhì)化，稱取2g均質(zhì)化后的組織樣本置 于可密封的試管中，加IOmL純甲醇，渦旋混勻5min。10000r/min離心5min或3000r/min離 心20min，取上清。沉淀中再加入IOmL純甲醇，渦旋混勻后離心(方法同前)，取上清。混 勻兩次離心上清，取出IOmL用氮?dú)獯蹈伞ＨmL樣品稀釋液重新充分溶解后用于檢測(注 意溶解后請立即進(jìn)行分析檢測)。稀釋倍數(shù)為1。(2)利用本發(fā)明試劑盒對標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品進(jìn)行檢測。(3)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品溶液熒光值計算樣品濃度。應(yīng)用所述試劑盒進(jìn)行檢測具體包括以下步驟(1)將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于20 24°C環(huán)境中平衡不少于30min，將酶標(biāo) 板條固定，做兩個平行實驗，按順序編號。(2)在標(biāo)準(zhǔn)品孔加入50 μ L標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品孔加/入50 μ L待測樣品，然后每孔加 入50 μ L萊克多巴胺單克隆抗體工作液，混勻；振蕩反應(yīng)45min。(3)待反應(yīng)后洗板六次，并在吸水紙上拍干，以保證完全除去孔中的液體。每孔加 入100 μ L銪標(biāo)二抗工作液，振蕩反應(yīng)45min。(4)待反應(yīng)后洗板六次，并在吸水紙上拍干，以保證完全除去孔中的液體。每孔加 入200 μ L增強(qiáng)液，混勻，避光室溫輕拍振蕩5min。(5)用時間分辨免疫分析(TRFIA)檢測儀測定各孔熒光值。(6)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光值與濃度半對數(shù)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品溶液熒 光值計算樣品濃度。檢測結(jié)果處理與分析以所獲標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光值的平均值計算百分熒光值，以百分熒光值為縱坐標(biāo)，萊克 多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的半對數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程。用同樣的方法計算 樣品溶液的百分熒光值，根據(jù)方程式求出對應(yīng)樣品的萊克多巴胺濃度。所述百分熒光值的 計算式為百分熒光值(％) = (B/B0) X 100其中，B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品的平均熒光值，Btl為O μ g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均熒光值。檢測結(jié)果的分析還可以利用計算機(jī)專業(yè)軟件進(jìn)行計算與分析，對萊克多巴胺線性 檢測范圍為0. 1 8. 1 μ g/L，檢測限可達(dá)到0. 01 μ g/L，整個檢測過程需2h就可以完成。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用鑭系元素作標(biāo)記物，DTTA為螯合劑，建立了對萊克多巴胺的定量分析 方法，此法操作流程短、簡單、快速，精密度和準(zhǔn)確度均較好，樣品前處理簡單，尤其是采用 銪(Eu3+)作標(biāo)記物，DTTA為螯合劑，效果好，成本低。濃縮洗滌液為含0. 5 1. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(pH7. 4,0. lmol/L)，為正常 使用濃度的15 25倍；所述樣品稀釋濃縮液為pH7. 4 8. 0,0. 1 0. 25mol/L的磷酸鹽緩沖液，為正常使用濃度的5 15倍。以便于減少體積，方便在試劑盒中配備。本發(fā)明采用密封保存的方式保證所述酶標(biāo)板的空白板的熒光值低于1000，保證沒 有稀土元素的污染。本發(fā)明使用酸性增強(qiáng)液，使銪離子(Eu3+)從螯合物中解離下來，游離的Eu3+在三辛 基氧化膦協(xié)同下，重新與二酮體形成一種新的能夠高效率地接受激發(fā)光的螯合物。在 激發(fā)光激發(fā)下，銪離子獲能，經(jīng)過電子躍遷并返回基態(tài)，便可發(fā)射出極強(qiáng)的熒光信號，在時 間分辨免疫(TRFIA)分析儀上讀出其熒光值，其靈敏度可達(dá)16Xl(T18m0lEU3+。


圖1萊克多巴胺(RAC)的半抗原一級ESI-MS圖譜圖2萊克多巴胺(RAC)的半抗原二級ESI-MS圖譜圖3標(biāo)準(zhǔn)曲線
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。下述實施例中所使用的試驗 方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑 得到的試劑和材料。實施例1半抗原的制備萊克多巴胺半抗原的合成路線如下所示
權(quán)利要求
一種檢測萊克多巴胺殘留的時間分辨免疫分析檢測試劑盒，其特征在于包括包被了萊克多巴胺抗原的酶標(biāo)板、萊克多巴胺抗體、鑭系元素標(biāo)記羊抗兔或羊抗鼠抗體；所述鑭系元素為Eu3+、Tb3+、Dy3+或Sm3+。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述萊克多巴胺抗原是將萊克多巴胺和 載體蛋白偶聯(lián)得到；所述萊克多巴胺抗體包括單克隆抗體、兔多克隆抗體或基因工程抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于還包括萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液、增強(qiáng)液、濃 縮洗滌液和樣品稀釋濃縮液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液是以濃度 為1000 μ g/L的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品配成的濃度梯度為8μ g/L、4 μg/L、2μ g/L、1μ g/L、 0. 5μ g/L、0μ g/L的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品工作液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述增強(qiáng)液包括β-二酮體、三辛基氧化 磷、Triton X-100、冰醋酸和pH值為2. 0 3. 2的鄰苯二甲酸氫鉀。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述濃縮洗液包括0.5 1. 5%的吐溫 20的磷酸鹽緩沖液，所述磷酸鹽緩沖液pH值為7. 4，濃度為0. lmol/L ；所述濃縮稀釋液為 pH 值 7. 4 8. 0,0. 1 0. 25mol/L 的 Tris-HCl。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的時間分辨免疫分析試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)板是96孔酶 標(biāo)板，包被有濃度為75μ g/L抗萊克多巴胺抗原，并封閉微孔表面未吸附位點(diǎn)；所述封閉液 包括溶于PBS的脫脂奶粉溶液。
8.一種萊克多巴胺的檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)樣品前處理；(2)用權(quán)利要求1 7任一項所述的試劑盒進(jìn)行檢測；(3)結(jié)果處理與分析。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于所述樣品前處理為(1)尿液樣本處理清澈尿液樣品可以直接進(jìn)行檢測分析；若尿樣呈渾濁狀，2000r/min離心5min或過濾， 用上清液檢測；或(2)飼料樣本處理將飼料粉碎，稱取2g置于50mL試管中，加入12mL10%氨化甲醇，充分混勻振蕩1 2min，加入9mL乙酸乙酯，振蕩20min，5000r/min離心lOmin，取有機(jī)相500 μ L于另一試管 中，用氮?dú)獯蹈桑尤霕悠废♂屢?00 μ L稀釋后直接檢測；或(3)組織樣本處理所述組織包括肌肉、肝臟或腎臟；將組織破碎和均質(zhì)化，稱取2g均質(zhì)化后的組織樣本 置于可密封的試管中，加IOmL純甲醇，渦旋混勻5min，10000r/min離心5min或3000r/min 離心20min，取上清，沉淀中再加入IOmL純甲醇，渦旋混勻后離心，取上清，混勻兩次離心上 清，取出IOmL用氮?dú)獯蹈桑mL樣品稀釋液重新充分溶解后用于檢測。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于20 24°C環(huán)境中平衡不少于30min，將酶標(biāo)板條 固定，做平行實驗，按順序編號；(2)在標(biāo)準(zhǔn)品孔加入50μ L標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品孔加入50 μ L待測樣品，然后每孔加入(50 μ L萊克多巴胺單克隆抗體工作液，混勻；振蕩反應(yīng)；(3)步驟(2)所述振蕩反應(yīng)后洗板，拍千，每孔加入100μ L銪標(biāo)二抗工作液，振蕩反應(yīng)；(4)步驟(3)所述振蕩反應(yīng)后洗板，拍干，每孔加入200μL增強(qiáng)液，混勻，避光室溫輕拍 振蕩；(5)用TRFIA檢測儀測定各孔熒光值；(6)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光值與濃度半對數(shù)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品溶液熒光值 計算樣品濃度。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種萊克多巴胺殘留的時間分辨免疫分析檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明所述試劑盒包被有萊克多巴胺抗原的酶標(biāo)板，鑭系元素標(biāo)記羊抗兔或羊抗鼠抗體、萊克多巴胺抗體等。本發(fā)明還公開了應(yīng)用上述試劑盒檢測萊克多巴胺殘留的方法。本發(fā)明提供的檢測萊克多巴胺的試劑盒采用間接競爭時間分辨免疫分析技術(shù)，靈敏度高、穩(wěn)定性好，大大簡化了操作步驟和反應(yīng)時間，減少了因操作復(fù)雜引起的誤差，降低了成本，非常適合大量樣品的篩查，具有重要的現(xiàn)實意義。
文檔編號G01N33/577GK101995460SQ20101026899
公開日2011年3月30日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者孫遠(yuǎn)明, 徐振林, 李麗華, 李振峰, 楊金易, 沈玉棟, 王弘, 雷紅濤 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)