專利名稱：微珠分析方法和微珠分析器的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微珠分析方法和微珠分析器。更具體而言，本發(fā)明涉及例如通過使 用承載有形成于其上的圖案的微珠進行的微珠分析，該圖案用于各個微珠的圖像識別。
背景技術：
例如，顆粒載體(通常稱作“微珠”)已經(jīng)用于核苷酸和蛋白質的生化分析。 例如，在核苷酸分析中，承載有探測核苷酸鏈(其具有與靶核苷酸鏈互補的堿基序列并 且被固定在微珠表面上)的微珠用于在靶核苷酸鏈與探測核苷酸鏈的相互作用中離析靶 核苷酸鏈?；蛘?，在蛋白質分析中，類似的通過使用具有被固定在微珠表面上的相對于 靶蛋白質的抗體的微珠來離析靶蛋白質。
如果預先用熒光物質來標記，則能夠光學檢測在微珠表面上所捕獲和分離的靶 核苷酸鏈或靶蛋白質。此外，測量微珠表面上的熒光強度使得能夠定量測定所分離的 靶物質。當靶物質是核苷酸鏈時，如果使用當結合于在靶核苷酸鏈和檢測核苷酸鏈之間 的相互作用中形成的混合鏈中時發(fā)射熒光的嵌入劑，則可以光學檢測所分離的靶核苷酸 鏈。
最近，使用上述微珠的生化分析需要在處理能力方面進一步提高，并且開發(fā)了 各種技術以進一步提高分析的處理速度。
例如，日本專利No.3468750(在下文中，稱為專利文獻1)公開了 “檢測樣本中 的多種分析物的方法，其通過多種分析物的分析反應產(chǎn)物來識別多種分析物，該方法包 括a)使各種類型的熒光顆粒與樣本接觸，各個熒光顆粒具有不同的熒光信號和不同的 分析反應產(chǎn)物，每個分析反應產(chǎn)物與樣本中的一個分析物特定地鍵合，每個熒光顆粒具 有至少一個在表面上標記有熒光染料的納米顆粒；b)將樣本加到標記試劑；c)通過檢測 標記來分析指示分析反應產(chǎn)物與分析物鍵合的熒光顆粒；同時，d)根據(jù)與各個熒光顆粒 相關的不同熒光信號的功能，來確定與各個分析物鍵合的熒光顆?！?參見其權利要求 23)。
根據(jù)現(xiàn)有技術，在由Luminec公司提供的“懸浮陣列技術(Suspension Array Technology)"中，通過用在所發(fā)射的光的顏色方面有所改變的兩種熒光著色劑標記微 珠，能夠識別多達100種微珠。通過在100種微珠上固定不同的探測核苷酸鏈或抗體，能 夠通過“懸浮陣列技術”在一次分析中同時分析100種不同的靶核苷酸鏈或靶蛋白質。
上述專利文獻1還記載了 “額外地通過微珠的尺寸和形狀來限定熒光顆?！?參 見其權利要求25)，并且公開了能夠使用微珠的尺寸和形狀作為用于識別微珠的附加參數(shù) (例如，參見專利文獻1第0037段等)。
才目應白勺， 在"Multifunctional encoded Particles for high-throughputbiomolecule analysis” (Science, 2007，第315卷，第5817號，第1393-6頁(在下文中，稱作非專利文獻1))中公開了形成使得能夠對微珠進行圖像識別的點編碼的技術。通過上述技術能 夠制備許多種(多于1,000,000種)微珠。該文獻記載了在通過在管道中通過光刻來制備微珠，該微珠承載有形成于微珠的橢圓表面的一半表面上的點代碼和固定在另一半表面 上的探測核苷酸鏈(參見非專利文獻1的圖1)。發(fā)明內(nèi)容
對于承載有諸如點編碼之類的識別圖案的微珠，在檢測從與作為固定在微珠表 面上的標記的靶物質鍵合或者與結合在靶物質中的嵌入劑鍵合的熒光物質發(fā)射的熒光的 過程中，擔心識別圖案自身會發(fā)射熒光。在根據(jù)微珠表面上的熒光強度來測量靶物質的 量的過程中，上述來自識別圖案的熒光成為噪音熒光(導致測量誤差的因素)。
此外，因為在各個微珠上形成圖案形狀不同的多種識別圖案，所以每個微珠上 所產(chǎn)生的噪音熒光的強度會根據(jù)圖案形狀的差別而發(fā)生變化。在這種情況下，需要在校 正每個微珠上的噪音熒光的影響之后再計算靶物質的量，這導致分析速度降低。
非專利文獻1中所公開的微珠具有兩半分開的橢圓表面用于形成點編碼的區(qū) 域和用于固定探測核苷鏈的區(qū)域。如果能夠只從探測核苷鏈固定區(qū)域中檢測熒光，則可 以使用微珠來檢測來自作為標記與靶核苷鏈鍵合的熒光物質的熒光，而不受來自識別圖 案的噪音熒光的影響。但是，該文獻沒有關于這種可能性的任何描述。
但是，為了制造這種具有分離地形成的點編碼形成區(qū)域和探測核苷鏈固定區(qū)域 的微珠，需要非常復雜的制備步驟。具體而言，需要執(zhí)行如下步驟將用于制備點編碼 形成區(qū)域的單體流和用于制備檢測核苷鏈的流體在它們彼此接觸的情況下在管道中進行 饋送，并且用UV光照射用于點編碼形成區(qū)域的單體流以進行光刻(參見非專利文獻1中 的圖1)。將點編碼形成區(qū)域與探測核苷鏈固定區(qū)域分開也引起了增大微珠的整體尺寸的 問題。
因此，需要如下的的微珠分析方法其高精度檢測來自作為標記與靶物質鍵合 的熒光物質等的熒光，不受來自識別圖案的噪音熒光的影響，并且也不需要復雜的制備步驟。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，提供了一種微珠分析方法，其用于被形成為柱體形狀的 微珠，所述微珠具有彼此面對且大致平行放置的頂表面和底表面、以及從所述頂表面和 所述底表面延伸的側表面，并且所述微珠承載有形成于所述頂表面和所述底表面中的至 少一個表面上的識別圖案、以及固定在所述微珠的表面上的與分析物質具有親和性的物 質，所述方法從包括所述頂表面和所述底表面中的沒有形成識別圖案的區(qū)域以及所述側 表面在內(nèi)的區(qū)域檢測由于所述分析物質和與所述分析物質具有親和性的所述物質的相互 作用而從所述微珠表面發(fā)射的熒光。
上述分析方法包括如下步驟
(1)將所述微珠與所述分析物質混合；
(2)獲得包括所述識別圖案的所述微珠的透射圖像，并且由所述透射圖像檢測所 述識別圖案；并且
(3)獲得所述微珠的熒光圖像，并且由所述熒光圖像檢測來自包括所述微珠的所 述頂表面和所述底表面中的沒有形成所述識別圖案的區(qū)域以及輪廓區(qū)域在內(nèi)的區(qū)域的所 述熒光。
通過檢測來自上述區(qū)域的熒光，能夠檢測排除從識別圖案獲得的噪音熒光的高強度熒光。
在上述微珠分析方法中，當將所述微珠放置在測量襯底上、并且所述微珠的所 述頂表面和所述底表面中的一個表面與所述測量襯底的表面接觸時，通過圖像獲取裝置 獲得所述透射圖像和所述熒光圖像，所述圖像獲取裝置安裝在與所述測量襯底表面面對 的位置。
當如上所述排列的微珠被保持在測量襯底上時，通過圖像獲取裝置所獲得的透 射圖像包括可靠的識別圖案。
優(yōu)選的，當將所述微珠放置在表面粗糙化的測量襯底的表面上時，或者當在液 體中將所述微珠放置在所述測量襯底的表面上時，獲得所述透射圖像和所述熒光圖像。
通過如上所述將微珠放置在測量襯底上，能夠獲得沒有產(chǎn)生干涉條紋的透射圖 像和熒光圖像。
此外，可以在拍攝所述微珠的所述頂表面和所述底表面中中的一個的圖像時， 獲得所述透射圖像，可以在拍攝所述微珠的所述側表面的圖像時，獲得所述熒光圖像。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施例，還提供了一種微珠分析器，其用于分析微珠，所述 微珠在其表面上承載有識別圖案，所述微珠分析器包括圖像獲取裝置，其用于獲得所 述微珠的透射圖像和熒光圖像；用于由所述透射圖像檢測所述識別圖案的裝置；和用于 在所述熒光圖像中檢測來自沒有形成所述微珠的所述識別圖案的區(qū)域的熒光的裝置。
上述微珠分析器還包括測量襯底，其用于放置所述微珠，其中所述測量襯底 的表面和所述圖像獲取裝置被放置為彼此面對，所述測量襯底是表面粗糙化的。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施例，提供了一種微珠分析器，其用于分析被形成為柱體 形狀的微珠，所述微珠具有彼此面對且大致平行放置的頂表面和底表面、以及從所述頂 表面和所述底表面延伸的側表面，并且所述微珠承載有形成于所述頂表面和所述底表面 中的至少一個表面上的識別圖案。所述微珠分析器包括用于透射圖像的圖像獲取裝 置，其用于獲得所述微珠的透射圖像；和用于熒光圖像的圖像獲取裝置，其用于獲得所 述微珠的熒光圖像。所述用于透射圖像的圖像獲取裝置獲得所述微珠的所述頂表面和所 述底表面中的一個表面的透射圖像，所述用于熒光圖像的圖像獲取裝置獲得所述微珠的 所述側表面的熒光圖像。
上述微珠分析器可以包括管道。在這種情況下，所述用于透射圖像的圖像獲取 裝置和所述用于熒光圖像的圖像獲取裝置獲得在所述管道中流動的所述微珠的圖像。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施例，提供了一種微珠分析器，其用于分析微珠，所述微 珠在其表面上承載有識別圖案，所述微珠分析器包括圖像獲取部分，其獲得所述微珠 的透射圖像和熒光圖像；第一部分，其由所述透射圖像檢測所述識別圖案；和第二部 分，其在所述熒光圖像中檢測來自沒有形成所述微珠的所述識別圖案的區(qū)域的熒光。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施例，提供了一種微珠分析器，其用于分析被形成為柱體 形狀的微珠，所述微珠具有彼此面對且大致平行放置的頂表面和底表面、以及從所述頂 表面和所述底表面延伸的側表面，并且所述微珠承載有形成于其所述頂表面和所述底表 面中的至少一個表面上的識別圖案。所述微珠分析器包括用于透射圖像的圖像獲取部 分，其獲得所述微珠的透射圖像；和用于熒光圖像的圖像獲取部分，其獲得所述微珠的 熒光圖像。所述用于透射圖像的圖像獲取部分獲得所述微珠的所述頂表面和所述底表面中的一個表面的透射圖像，所述用于熒光圖像的圖像獲取部分獲得所述微珠的所述側表 面的熒光圖像。
在本發(fā)明中，“識別圖案”是形成于微珠上的特定形狀，“識別圖案”能夠被 諸如CCD相機和圖像分析軟件之類的通用圖像識別裝置所識別。識別圖案是用于區(qū)別各 個微珠的形狀，并且具體形狀、尺寸和其他特征不受具體限制。識別圖案的典型示例包 括所謂的點涂層、條形碼等。
在本發(fā)明中，“分析物質”包括范圍廣泛的在使用微珠的生化分析中所分析的 化合物，例如核酸、蛋白質和肽。例如，分析物質可以包括諸如類固醇激素和兒茶酚胺 之類的體內(nèi)小分子、諸如微粒體和線粒體之類的細胞內(nèi)細胞器官、病毒、或者諸如微生 物細胞或哺乳動物細胞之類的各種細胞等。
“與分析物質具有親和性的物質”包括范圍廣泛的能夠與分析物質發(fā)生相互作 用、并且能與具有親和性的分析物質鍵合的化合物，例如核酸、蛋白質、肽、糖鏈、以 及各種合成化合物和天然化合物。
分析物質和與分析物質具有親和性的物質的組合的示例包括“核酸-核酸”、 “蛋白質(或肽)_蛋白質(包括抗體)”、“蛋白質(或肽)_核酸(適體)”和“蛋白質-糖鏈”。對于“核酸-核酸”的組合，“相互作用”是在具有相互互補的堿基序列 的核酸之間形成雙鏈?；蛘撸瑢τ凇暗鞍踪|-蛋白質”的組合，例如，“相互作用”是 蛋白質-蛋白質鍵合，例如在受體蛋白質和配體蛋白質之間的鍵合或者在抗原蛋白質和 抗體之間的鍵合。
糖鏈包括相互鍵合的單糖鏈以及用脂類或蛋白質修飾的單糖鏈，還包括寡糖、 糖脂、和糖蛋白質等。核酸包括DNA和RNA，還有通過改變核糖區(qū)和磷酸主鏈區(qū)的結 構所獲得的核酸類似物(例如LNA(鎖核酸)和PNA)等。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，提供了高精度檢測例如來自作為標記與靶物質鍵合的熒 光物質的熒光的微珠分析方法，該方法不受來自識別圖案的噪音熒光的影響，并且不需 要復雜的制備步驟。
根據(jù)以下對于附圖中所示的本發(fā)明最佳實施方式的詳細描述，本發(fā)明的上述及 其他目的、特征和優(yōu)點將變得更加清楚。


圖1是用于說明在根據(jù)本發(fā)明的實施例的微珠分析方法中所使用的微珠的示例 的示意圖，其中圖(A)是俯視圖，圖(B)是側視圖2A至圖2C是用于說明形成于微珠的編碼區(qū)中的識別圖案的示意圖3A至圖3C是用于說明固定在微珠的表面上的探測物質的示意圖4A和圖4B是說明承載有形成于其上的識別圖案的微珠的透射圖像和熒光圖 像的示例的照片(不是繪圖)，其中圖4A是透射圖像，圖4B是熒光圖像；
圖5是用于說明根據(jù)本發(fā)明的實施例的微珠分析器的示意性結構的示意圖(第一 示例)；
圖6是用于說明根據(jù)本發(fā)明的實施例的微珠分析器中的測量襯底的結構的示意 圖7是用于說明熒光檢測裝置進行熒光檢測的區(qū)域的示意圖8是用于說明根據(jù)本發(fā)明的實施例的微珠分析器的示意性結構的示意圖(第二 示例)；并且
圖9A和圖9B是說明承載有形成于其上的識別圖案的微珠的透射圖像和熒光圖 像的其他示例的照片(不是繪圖)，其中圖9A是透射圖像，圖9B是熒光圖像。
具體實施方式
在下文中，將參考附圖描述本發(fā)明的實施例。下面所描述的實施例是本發(fā)明的 典型實施方式，并且應當理解，本發(fā)明的范圍并非由此限定。將按照下列順序來描述本 發(fā)明
1.微珠
(1)識別圖案
(2)探測物質
(3)產(chǎn)生微珠的方法
(i)膜形成步驟
( )成形步驟
(iii)分離步驟
(iv)探測物質固定步驟
2.微珠分析方法(第一示例)
(1)微珠分析方法概述
(2)微珠分析器(第一示例)
(3)微珠分析方法的具體過程
(i)反應過程
( )保持過程
(iii)檢測過程
(a)檢測識別圖案
(b)檢測熒光
3.微珠分析方法(第二示例)
(1)微珠分析器(第二示例)
(2)微珠分析方法的具體過程
⑴管道饋送過程
( )檢測過程
(a)檢測識別圖案
(b)檢測熒光
1.微珠
(1)識別圖案
在根據(jù)本發(fā)明的實施例的微珠分析方法中，使用承載有形成于微珠上的識別圖 案和固定在微珠上的與分析物質具有親和性的物質的微珠。圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的實 施例在微珠分析方法中所使用的微珠的示例。圖1的(A)是示意性俯視圖，圖1的(B)8是示意性側視圖。
在圖1中，微珠由附圖標記1表示，并且被形成為柱體形狀，該柱體形狀具有 彼此面對且大致平行放置的頂表面11和底表面12、以及從頂表面和底表面延伸的側表 面13。盡管下面將作為示例描述的微珠具有從上方觀察均為圓形的頂表面11和底表面 12，并且微珠1整體是圓柱形，但是用于本發(fā)明的實施例中的微珠在形狀上可以是三角 棱柱、四角棱柱或其他多角棱柱。但是，為了根據(jù)下面描述的方法形成包含識別圖案的 透射圖像，需要將頂表面11和底表面12形成為柱體形狀，使得頂表面和底表面彼此相對 且大致平行地放置。
微珠1的厚度H和頂表面11 (或底表面12)的直徑D是任意確定的，但是優(yōu)選 的是，通過使得厚度H小于直徑D而使整個微珠1形成為板狀形狀。
微珠1在頂表面11和底表面12中的至少一個表面上(圖1中是頂表面11)具有 編碼區(qū)111，在編碼區(qū)111上形成用于對各個微珠的圖像識別的圖案。頂表面11上除了 編碼區(qū)111之外的區(qū)域是沒有形成識別圖案的非編碼區(qū)112。可以在底表面12上形成編 碼區(qū)111，或者可以在頂表面11和底表面12兩者上都形成編碼區(qū)111。
圖2A至圖2C是用于說明形成于微珠1的編碼區(qū)111中的識別圖案的示意性俯 視圖。這里，微珠1被解釋為包括分別承載有不同的識別圖案的1A、IB和IC這3種微 珠的一組微珠。
從微珠的頂表面11穿透到底表面12的多個通孔2形成于圖2A到2C中所示的各 個微珠1A、IB和IC的編碼區(qū)111中(參見圖中的點狀圖案陰影圓圈)。在編碼區(qū)111 中可以在五行五列的矩陣中形成最多總共25個通孔2，這些通孔形成了用于識別微珠1的 識別圖案。對于微珠1A、IB或IC來說，根據(jù)在25個位置中形成有通孔2的位置來識 別各個微珠1A、IB或1C。
具體來說，對于圖2A中所示的微珠1A，在可能的25個位置中的9個位置上形 成通孔2。在圖中，形成通孔2的位置由點狀圖案陰影圓圈表示，而沒有形成通孔的位置 由帶黑圈的白點表示。對于圖2B中所示的微珠1B，同樣在九個位置形成通孔2，但是 圖案的位置與微珠IA中的圖案位置不同。因此，根據(jù)所形成的通孔2的位置，能夠分別 識別微珠IA和微珠IB。
或者，對于圖2C中所示的微珠1C，在10個位置形成通孔。因此，根據(jù)所形成 的通孔2的數(shù)量，能夠使微珠IC區(qū)別于微珠IA或微珠1B。
編碼區(qū)111中所形成的通孔2的數(shù)量在0到25的范圍內(nèi)是任意的，可以在從25 個位置中所選出的任意位置處形成通孔。如上所述，通過任意改變通孔2的數(shù)量和位 置，能夠在微珠1的編碼區(qū)111中形成不同的圖案。因為通過圖像識別裝置來檢測圖案， 所以能夠識別高達2的25次冪種微珠。
上述識別圖案只是示例。如果在用于本發(fā)明的實施例的微珠上所形成的識別圖 案是已知的圖像識別裝置可識別的圖案，則該圖案的形狀和尺寸并不受特別限制。
(2)探測物質
將與分析物質具有親和性的物質固定在微珠1的表面上。圖3A至圖3C是示出 了固定在微珠1的表面上且與分析物質具有親和性的物質的示意圖。在下文中，分析物 質將被稱為“靶物質”，與分析物質具有親和性的物質將被稱為“探測物質”。
將由附圖標記PA所表示的探測物質固定在圖3A中所示的微珠IA的表面上。 探測物質PA是與靶物質相適配的化合物，例如具有特定堿基序列的核酸、具有特定氨基 酸序列的蛋白質或肽、或者糖鏈。將探測物質PA至少固定在包括編碼區(qū)111和非編碼區(qū) 112在內(nèi)的頂表面11上以及微珠IA的側表面13上，另外還可以將探測物質固定在底表 面12上。如果在底表面12上也形成了識別圖案，則將探測物質PA固定在底表面12的 編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩者上。
當靶物質是核酸時，探測物質PA是具有與靶核苷酸鏈的堿基序列互補的堿基序 列的核苷酸鏈。通過與探測物質PA雜交(形成雙鏈)，能夠以此方式在微珠IA上捕捉 和分離樣本中的靶核苷酸鏈。這種情況下，如果探測物質PA具有與靶核苷酸鏈的堿基 序列的至少一部分互補的堿基序列，并且探測物質PA在特定雜交反應條件下能夠形成雙 鏈，則探測物質PA的堿基數(shù)量(長度)是任意的，并且堿基數(shù)量不受具體限制。通常， 探測物質PA的堿基數(shù)量是幾個到幾打(dozen)個堿基，優(yōu)選的是約10到30個堿基。
當靶物質是蛋白質時，探測物質PA是肽(例如，蛋白質配體的部分氨基酸序 列)、抗體、或者能與靶蛋白質相互作用的物質(例如，受體蛋白質)。在靶蛋白質與探 測物質PA的相互作用中，能夠以此方式在微珠IA上捕捉和分離樣本中的靶蛋白質。
另一方面，將由附圖標記PB或PC所表示的探測物質分別固定在圖3B或3C中 所示的微珠IB或IC的表面上。探測物質PB或PC是與靶物質相適配的化合物，例如 具有特定堿基序列的核酸、具有特定氨基酸序列的蛋白質或肽、或者糖鏈。同樣對于微 珠IB或1C，將探測物質至少固定在包括編碼區(qū)111和非編碼區(qū)112在內(nèi)的頂表面11上 以及側表面13上。
固定在微珠IA的表面上的探測物質PA和固定在微珠IB和IC的表面上的探測 物質PB和PC是與不同的靶物質具有親和性的物質。因此，能夠在微珠1A、IB和IC 的表面上分別捕捉和分離不同的靶物質(TA、TB和TC)。在這種情況下，例如，探測物 質PA、PB和PC是具有不同序列的核苷酸、蛋白質或者肽，或者是抗原性不同的抗體。
在探測物質PA、PB和PC分別與靶物質TA、TB和TC的相互作用中，保持有 捕捉到的靶物質的微珠1A、IB和IC發(fā)射熒光。例如，熒光是從作為標記與靶物質鍵合 的熒光物質或者從結合在探測物質和靶物質之間的嵌入劑發(fā)射的。根據(jù)本發(fā)明的實施例 的微珠分析方法能夠通過同時地檢測熒光并通過使用圖形識別裝置識別形成于各個微珠 上的識別圖案，來同時分析多種靶物質。
(3)產(chǎn)生微珠的方法
例如，可以按照下列步驟制備根據(jù)本發(fā)明的實施例的微珠分析方法中所使用的 微珠。
⑴膜形成步驟
首先，在襯底上形成薄膜(用于微珠的材料)。例如，供使用的襯底是玻璃襯底 或硅襯底。用于襯底的材料不受具體限制，可以使用光刻技術中通常所使用的適當選擇 的材料。
在襯底上形成聚合物、二氧化硅或金屬(鋁、鉻、金、銀等)的薄膜。根據(jù)薄 膜的材料厚度，可以通過已知的方法形成薄膜，例如使用旋轉涂布機或狹縫涂布機的涂 覆、或通過噴涂、或通過氣相沉積(例如物理氣相沉積(PVD)或化學氣相沉積(CVD))。10根據(jù)形成的微珠的所需厚度(在圖1中，參見附圖標記H)來適當選擇薄膜的厚度。
可以優(yōu)選使用諸如環(huán)氧基抗蝕劑(例如SU-8)、聚酰亞胺基抗蝕劑、丙烯酸抗 蝕劑、或酚醛基抗蝕劑之類的光刻抗蝕劑作為薄膜材料。通過使用聚合物光刻抗蝕劑薄 膜，能夠以比二氧化硅薄膜和金屬薄膜更低的成本制備微珠，并且獲得具有更低比重的 微珠。將微珠與包含靶物質的樣本混合，并在分析過程中分散在液相中。如果微珠的比 重較大，則難以在液相中長時間保持分散狀態(tài)穩(wěn)定。
使用SU-8作為聚合物是特別有利的。SU-8是化學放大型環(huán)氧基負型光刻抗蝕 劑。SU-8是美國IBM研發(fā)的作為用于通過組合利用超薄抗蝕劑膜形成技術和光刻技術 來形成精細結構的材料。
通過旋轉涂布進行膜的形成，可以輕松調(diào)整SU-8膜的厚度。此外，SU-8高度 透光，并且對各種溶劑、酸和堿以及熱具有較高程度的耐受性。因此，通過使用SU-8能 夠很容易的制備具有各種厚度的微珠。還能夠在制備微珠和使用微珠進行分析的步驟中 獲得穩(wěn)定的性能。
(ii)成形步驟
隨后，通過光刻使所形成的薄膜成形為特定形狀。當使用諸如SU-8的抗蝕劑作 為微珠材料時，根據(jù)需要來加熱薄膜以用于固化(預烘焙)。然后通過具有微珠的完整形 狀和繪制在其上的識別圖案的光掩模(在下文中，被簡稱為“掩模”)使膜曝光。光照 射過的襯底被浸入顯影液，以去除不需要的區(qū)域中的薄膜。再用沖洗液(異丙醇IPA) 沖洗襯底，以完全去除不需要的區(qū)域。然后，進行襯底的后烘培，使薄膜上產(chǎn)生的微珠 形狀保持在襯底上。
然后，通過根據(jù)所制備的微珠識別圖案的所需形狀來設計掩模的形狀，能夠形 成在襯底上具有任意識別圖案形狀的微珠。通過使用無掩模曝光機可以實現(xiàn)光照射。
如果使用二氧化硅或金屬作為微珠材料，則將通常使用的抗蝕劑旋轉涂布在薄 膜的表面上，并根據(jù)需要預烘焙襯底。然后通過與上述相似的掩模使襯底曝光。將曝光 的襯底浸入顯影液，以去除不需要的區(qū)域中的抗蝕劑。再用沖洗液(主要是超純水)數(shù) 次沖洗襯底，以去除不需要的區(qū)域，并且后烘焙襯底。在通過蝕刻對薄膜進行圖案化之 后，完全去除抗蝕劑。這樣，在襯底上剩余的薄膜上出現(xiàn)微珠形狀。
(iii)分離步驟
將成形之后的薄膜從襯底分離。例如，可以通過將襯底浸入堿性或酸性分離溶 液，來分離薄膜?；蛘?，可以通過同時進行超聲處理和浸沒，來加速分離。
分離的微珠具有從薄膜獲得的柱體形狀，其具有彼此面對且大致平行排列的兩 個表面。通過調(diào)整所形成的膜的厚度，可以任意選擇彼此面對且大致平行排列的兩個表 面之間的距離(即，微珠厚度(參見圖1中的附圖標記H))。
(iv)探測物質固定步驟
隨后，使分離薄膜之后獲得的微珠的表面經(jīng)過官能團修飾，以用于固定探測物 質。
例如，修飾的官能團可以是羥基、氨基、羧基、異硫氰酸酯基、環(huán)氧基、或順 丁烯二酰亞胺基。在通常的制造DNA和蛋白質芯片中，已經(jīng)實行官能團修飾來引入連接 體，以在襯底表面上固定核苷酸鏈或肽。在本發(fā)明中也可以使用類似的方法。
將作為具體示例來描述用羥基修飾微珠表面。在這種情況下，首先使微珠表面 經(jīng)過氨丙基三乙氧基硅烷處理，可以使微珠修飾，然后將微珠浸入溶有Y-戊內(nèi)酯的二 甲基甲酰胺(DMF)中，以發(fā)生反應?；蛘?，通過在使微珠表面經(jīng)過縮水甘油氧基丙基 甲氧基硅烷處理之后，將微珠浸入四甘醇和加入少量濃硫酸的液體混合物中，以發(fā)生反 應，可以進行修飾。
最后，將探測物質固定在官能團修飾的微珠表面上。例如，當固定核酸或肽作 為探測物質時，隨著將核苷酸或氨基酸溶液(在下文中，統(tǒng)稱為“單體溶液”)逐滴加到 微珠表面上，通過逐步合成(step synthesis)可以將探測物質固定在微珠上。
根據(jù)所需的核苷酸或氨基酸序列，通過重復地進行將含有相應的基團或氨基酸 的單體溶液相繼地逐滴加入以在薄膜的將要成為微珠區(qū)域的一部分上發(fā)生鍵合反應的合 成循環(huán)，可以執(zhí)行核酸或肽的逐步合成。
例如，當固定核酸時，首先通過吸管逐滴加入含有核苷的單體溶液，然后，使 5-乙硫基四氮唑溶液通過逐滴加入而發(fā)生反應。在沖洗和干燥之后，通過逐滴加入氧化 溶液并與氧化溶液反應，使核苷亞磷酸三酯轉變成核苷磷酸三酯。沖洗之后，逐滴加入 混合乙酸酐/四氫呋喃溶液，以發(fā)生反應，將通過官能團修飾所引入的未反應的羥基封 端(be capped)。在沖洗和干燥之后，逐滴加入含有二氯乙酸的二氯甲烷溶液，以從微珠 連接的核苷5'-羥基中去除雙甲氧基三苯甲基保護基。在沖洗和干燥之后，重復(a)核 苷鍵合、(b)沖洗、(c)氧化、(d)沖洗和(e)去除雙甲氧基三苯甲基保護基和(f)沖洗 的步驟，最后，使核酸基脫保護。以此方式能夠固定具有所需堿基序列的核酸。
或者，例如，當固定肽時，通過重復以下步驟來制備肽在微珠上通過逐滴加 入含有使α-氨基和側鏈官能團通過縮合而受到適當保護的氨基酸的單體溶液來進行縮 合，并最終去除所得到的受保護的肽上的各種保護基。以此方式能夠固定具有所需氨基 酸序列的肽。
通過在微珠上逐滴加入含有預先制備的核酸或肽的溶液，在所引入的官能團與 預先制備的核酸或肽的反應中，可以實現(xiàn)核酸或肽的固定。
通過用吸管或微量分注器點注溶液或者通過噴墨點注，可以實現(xiàn)逐滴加入單體 溶液或預先制備的核酸或肽溶液?？梢栽谔綔y物質固定步驟之后執(zhí)行上述分離步驟。在 這種情況下，在將探測物質固定在成形步驟中形成于襯底上的微珠形成區(qū)域中的薄膜的 表面上之后，分離薄膜，以產(chǎn)生微珠。
2.微珠分析方法(第一示例)
(1)微珠分析方法概述
在根據(jù)本發(fā)明的實施例的微珠分析方法中，在上述微珠1的表面上形成識別圖 案，通過使用固定有探測物質的微珠來檢測熒光和識別圖案。這樣，同時分析多種靶物 質。
具體來說，例如，在通過使用微珠1完成單核苷酸多性態(tài)6ΝΡ)分析的情況 下，假設探測物質PA的堿基序列是與一個SNP相對應的堿基序列，并且探測物質PB和 PC的堿基序列是分別與其他SNP相對應的堿基序列。將由微珠1Α、IB和IC組成的一組 微珠與熒光標記樣本核酸混合，以與各個探測物質發(fā)生雜交反應。在反應之后，通過測 量熒光強度并且檢測各個微珠的表面上的識別圖案，來確定樣本核酸中所含的各個SNP的量。
可以通過使用每個都具有形成于表面上的識別圖案和與微珠特定對應的固定探 測物質的微珠，在分析中通過檢測熒光和識別圖案，以此方式能夠同時分析多種靶物 質。但是，上述系統(tǒng)具有問題，即，在從作為標記而與靶物質鍵合的熒光物質和嵌入劑 中檢測熒光的過程中，識別圖案自身會產(chǎn)生噪音熒光。
圖4A和4B示出了承載有形成于其上的識別圖案的微珠的透射圖像和熒光圖像 的示例。圖4A和圖4B各自示出了在將承載有固定探測物質且用熒光物質直接加以標記 的微珠1放置在樣本支架上使得微珠分散之后從上方拍攝的圖像。圖4A是透射圖像，而 圖4B是熒光圖像。
在圖4B所示的熒光圖像中可以確認，形成于微珠1上的識別圖案發(fā)射較強的熒 光。注意，可靠地沿著微珠的輪廓(在下面詳細描述)檢測來自作為標記與探測物質鍵 合的熒光物質的熒光。
在根據(jù)微珠表面上的熒光強度測量靶物質的量的過程中，由于識別圖案而產(chǎn)生 的熒光成為噪音熒光，即，測量誤差因素。此外，在每個微珠上形成圖案形狀不同的識 別圖案(參見圖2A至圖2C中的微珠1A、IB和1C)，由于圖案形狀不同，所以在每個微 珠上所產(chǎn)生的噪音熒光的強度可能存在不同。在這種情況下，需要在修正噪音熒光對各 個微珠的影響之后再計算靶物質的量，這會導致分析速度降低。
在圖4A中所示的透射圖像中，可以確認產(chǎn)生了干涉條紋(牛頓環(huán))。當兩個元 件(在這種情況下是微珠和樣本支架)在互相貼到一起時在兩者之間形成的間隙(空氣 層)的厚度等于或小于特定值時，產(chǎn)生上述干涉條紋。由此產(chǎn)生的干涉條紋使得圖像識 別裝置很難在透射圖像中檢測識別圖案，并且引起產(chǎn)生熒光圖像的熒光強度的變化。
例如，為了檢測來自作為標記與靶物質鍵合的熒光物質的熒光，同時為了防止 由于識別圖案而產(chǎn)生的噪音熒光和干涉條紋，根據(jù)本發(fā)明的實施例的微珠分析方法采用 下列步驟。在下文中，以微珠1用作示例，將參考圖5和圖6來描述根據(jù)本發(fā)明的實施 例的微珠分析方法中的具體步驟，圖5和圖6示出了在微珠分析方法中所使用的微珠分析 器的示意結構的第一示例。
(2)微珠分析器(第一示例)
首先，將描述微珠分析器的示意結構。圖5示出了為獲取放置在測量襯底31上 的微珠1的透射圖像所用的光源32，和為獲取熒光圖像所用的光源33。例如，使用鹵素 燈或水銀燈作為光源32，而例如使用半導體激光器作為光源33。通過透鏡34將從光源 32施加到微珠1上并且反射、透射的光收集到圖像獲取裝置35中。同樣，例如，通過 透鏡34，將通過來自光源33的激光照射而從例如作為標記與固定在微珠1上的靶物質鍵 合的熒光物質發(fā)射的熒光收集到圖像獲取裝置35中。圖像獲取裝置35可以是諸如CCD 或CMOS元件之類的面型圖像傳感器，圖像獲取裝置35獲得微珠1的透射圖像和熒光圖 像，并且分別輸出到圖像識別裝置36和熒光檢測裝置37。分析裝置38顯示出由圖像識 別裝置36和熒光檢測裝置37所檢測得到的識別圖案和熒光強度輸出的綜合分析結果。盡 管圖5示出了獨立安裝的圖像識別裝置36、熒光檢測裝置37和分析裝置38的結構，但是 上述裝置也可以例如與通用計算機、程序和顯示器結合。
可以使測量襯底31的表面粗糙化，以防止產(chǎn)生干涉條紋(參見圖6)。當在測量襯底31與其上支撐的微珠1之間存在厚度等于或小于特定值的間隙(空氣層)時，將產(chǎn) 生干涉條紋。測量襯底31的表面上形成的不規(guī)則結構311通過將微珠1保持在突部上并 且維持凹部與微珠1之間的間隙不小于特定值，防止了干涉條紋。通過表面噴砂或在表 面上采用防牛頓環(huán)膜，可以實現(xiàn)測量襯底31的表面粗糙化處理。例如，通過在襯底上涂 布含有分散的無機顏料的涂料溶液以對一個或兩個表面進行表面粗糙化所獲得的膜可以 用作防牛頓環(huán)膜。供使用的防牛頓環(huán)膜優(yōu)選是在透光性方面優(yōu)異的膜，其具有通過涂布 含有分散在粘合劑中的玻璃珠或樹脂顆粒所制備的不規(guī)則表面膜。
(3)微珠分析方法的具體過程
(i)反應過程
首先，將微珠1與含有靶物質的樣本混合，使得固定在微珠表面上的探測物質 與靶物質之間發(fā)生反應，以將靶物質捕捉在微珠表面上。
在用熒光物質標記靶物質之后，或者在熒光嵌入劑被結合在靶物質和探測物質 之間的相互作用所形成的復合體中之后而存在熒光嵌入劑的情況下，混合微珠1和樣 本。
( )保持過程
然后，根據(jù)需要收集并沖洗微珠1，以去除除了微珠吸附的靶物質之外的物質 (污染物)，然后，將微珠1以分散的方式放置在微珠分析器的測量襯底31上(參見圖 6)。
分散在測量襯底31上的微珠1被保持在測量襯底31上，微珠1以其彼此面對且 大致平行放置的兩個表面中的一個表面(頂表面11或底表面1 與測量襯底的表面接觸 的方式排列。通過在該方向上支撐微珠1，能夠通過安裝成面對測量襯底的圖像獲取裝置 35，來獲得頂表面11和/或底表面12的編碼區(qū)上所形成的識別圖案的圖像。
通過使微珠1的厚度H小于頂表面(或底表面12)的直徑D，而使全部的微珠1 更接近板狀形狀，能夠將微珠1更可靠地排列在測量襯底31上。
(iii)檢測過程
(a)檢測識別圖案
隨后，將來自光源32和33的光施加到被保持在測量襯底31上的微珠1上，并 通過圖像獲取裝置35拍攝微珠1的透射圖像和熒光圖像。
如果微珠1被保持在測量襯底31上，則由于在保持過程中微珠1被排列成其頂 表面11或底表面12與測量襯底的表面接觸，所以在通過圖像獲取裝置35獲得的透射圖 像中更可靠地包含識別圖案。還可以通過在測量襯底31的表面上形成不規(guī)則表面311， 獲得沒有干涉條紋的透射圖像和沒有熒光強度變化的熒光圖像。
將通過圖像獲取裝置35所獲得的透射圖像輸出至圖像識別裝置36。圖像識別裝 置36在透射圖像中檢測識別圖案，并將識別圖案作為電子信號輸出至分析裝置38?？梢?通過通用圖像分析程序或其修改程序來檢測識別圖案。
通過在液體中將微珠1放置在測量襯底31上的方法，也可以防止產(chǎn)生干涉條 紋。當在測量襯底31和被保持在測量襯底31上的微珠1之間存在厚度等于或小于特定 值的間隙(空氣層)時，產(chǎn)生干涉條紋。因此，如果在液體中將微珠1放置在測量襯底 的表面上，則沒有在測量襯底31和微珠1之間形成空氣層的可能性，因此防止了產(chǎn)生干14涉條紋。
具體來說，將懸浮在液體中的微珠1逐滴加到測量襯底上，以將微珠放置在測 量襯底上。如果擔心逐滴加入的液體由于干燥而消失，可以根據(jù)需要再次逐滴加入液 體，以將一直被放置在液體中的微珠放置在測量襯底31上。供使用的液體優(yōu)選的是具有 與微珠1具有相同的折射率的液體，并且優(yōu)選的是反應過程中所使用的緩沖溶液或者具 有更高鹽濃度的緩沖溶液。
(b)檢測熒光
將由圖像獲取裝置35所獲得的熒光圖像輸出到熒光檢測裝置37中。熒光檢測 裝置37從熒光圖像的預定區(qū)域中檢測熒光，并將轉換成電子信號的熒光強度輸出至分析 裝置38。
圖7示出了由熒光檢測裝置37進行檢測的熒光檢測區(qū)域(參見圖中的附圖標記 L)。
如上所述，通過將微珠1布置成以其頂表面11或底表面12與測量襯底的表面接 觸的方式，微珠1被保持在測量襯底31上。因此，如圖所示，通過安裝成面對測量襯底 表面的圖像獲取裝置35所獲得的熒光圖像，是從頂表面11或底表面12的方向所拍攝的 圖像。
在上述熒光圖像中，熒光檢測裝置37檢測來自頂表面12或側表面13中沒有承 載識別圖案的區(qū)域的熒光。通過檢測來自將形成識別圖案的編碼區(qū)111排除在外的區(qū)域 中的熒光，能夠在沒有產(chǎn)生來自編碼區(qū)111中的識別圖案的噪音熒光的情況下檢測熒光 (參見圖4B)。
在熒光圖像中，熒光檢測裝置37還同時檢測來自微珠1的輪廓區(qū)域的熒光。微 珠1的輪廓區(qū)域通過聚集來自側表面13的熒光而發(fā)射較強的熒光(參見圖4B)。因此， 通過同時地檢測來自輪廓區(qū)域的熒光，能夠提高S/N比并使向分析裝置38輸出的信號放 大。
例如，以下面的方式確定用于由熒光檢測裝置37進行熒光檢測的區(qū)域L。
首先，隨著從熒光圖像取出任意色彩序列或者通過由色彩信息進行重新計算， 來將熒光圖像計算為單色圖像并二值化。然后通過使用特定亮度作為閾值，將熒光圖像 二值化為0或1。隨后，計算亮度從0變成1或者從1變成0的點，取得了邊界(輪廓)。
然后，參考預先存儲的編碼區(qū)111的尺寸，識別邊界中的區(qū)域中的非編碼區(qū) 112。并且，界定包括邊界在內(nèi)的輪廓區(qū)域，輪廓寬度W延伸到包括非編碼區(qū)112但是 不包括編碼區(qū)111的區(qū)域的寬度，所得到的輪廓區(qū)域被界定為熒光檢測區(qū)域L。
如果熒光檢測區(qū)域L是不包括編碼區(qū)111但是包括輪廓區(qū)域的區(qū)域，則熒光檢測 區(qū)域L不受特別限制，并且如圖所示，熒光檢測區(qū)域可以是包括全部輪廓區(qū)域和部分非 編碼區(qū)112的區(qū)域、包括全部輪廓區(qū)域和全部非編碼區(qū)112的區(qū)域、或者包括部分輪廓區(qū) 域和部分非編碼區(qū)112的區(qū)域。不僅可以通過上述方法，還可以通過其他適合所使用的 微珠的形狀(多角棱柱，例如三角棱柱或四角棱柱)的方法來界定熒光檢測區(qū)域L。
如上所述，在根據(jù)本發(fā)明的實施例的微珠分析方法中，通過檢測來自微珠的非 編碼區(qū)和輪廓區(qū)域的熒光，能夠檢測不具有由編碼區(qū)中形成的識別圖案中所產(chǎn)生的噪音 熒光的高強度熒光。因此，通過上述方法，能夠在高靈敏度下分析靶物質，并且執(zhí)行高精度的定量測定。
已經(jīng)描述了從頂表面11或底表面12的方向上獲得熒光圖像的情況，但是本發(fā)明 不限于此。
3.微珠分析方法(第二示例)
(1)微珠分析器(第二示例)
圖8示出了用于本發(fā)明的實施例的微珠分析器的第二示例。與上述第一示例中 的微珠分析器重相同的構件將用相同的附圖標記說明。
在第二示例的微珠分析器中，盡管可以如圖5和圖6所示獲得測量襯底31上的 微珠1的圖像，但是可以如圖8所示獲得管道61中的微珠1的圖像。
管道61不受具體限制，但是優(yōu)選使用由能夠透射可見光和熒光的透明材料(例 如，玻璃、石英或透明樹脂)通過蝕刻形成的管道61、通過模制形成的管道61、或者透 明材料管。管道61的結構和諸如將液體送入管道61的泵的裝置不受具體限制，但是優(yōu) 選的是如下面所描述的在管道61中安裝用于相對于光源和圖像獲取裝置固定微珠1的方 向的裝置。
固定裝置的示例包括以不允許微珠通過的間隔放置的多個柱子的柱狀結構、具 有比微珠的厚度H淺且比微珠寬一點的凹坑的凹坑結構、或者與所謂的流式細胞儀相似 的結構，其中一個接一個將微珠饋送入管道61中，以排列微珠1。
將來自光源32和33的光施加到管道61中的微珠1上或者施加到測量襯底31 上，通過圖像獲取裝置65和66獲得透射圖像和熒光圖像。圖像獲取裝置65和66可以 是諸如CCD或CMOS之類的面型圖像傳感器。與第一示例中的微珠分析器類似，通過 透鏡63和64收集的光優(yōu)選用于圖像獲取。
可以分開安裝用于獲取透射圖像的圖像獲取裝置65和用于獲取熒光圖像的圖像 獲取裝置66。例如，用于透射圖像的圖像獲取裝置65面對微珠1的頂表面11或底表面 12，圖像獲取裝置65獲取從頂表面11或底表面12反射的光，或者通過頂表面11或底表 面12透射的光，因而從頂表面11或底表面12獲得透射圖像?；蛘撸糜跓晒鈭D像的圖 像獲取裝置66面對微珠1的側表面13，圖像獲取裝置66獲得從側表面13發(fā)射的熒光， 并從側表面13獲得熒光圖像。
所安裝的圖像獲取裝置65和66的位置不受具體限制。例如，如果通過例如由 鏡面反射可以獲得來自頂表面11或底表面12的透射圖像和來自側表面13的熒光圖像， 則用于透射圖像的圖像獲取裝置65可以安裝在并不面對頂表面11也不面對底表面12的 位置，用于熒光圖像的圖像獲取裝置66可以安裝在并不面對側表面13的位置。
將在下面通過使用在第二示例中的微珠分析器來描述分析方法的具體過程。
(2)微珠分析方法的具體過程(第二示例)
例如，通過與“2.微珠分析方法(第一示例)”中的“(1)反應過程”相似的 方法將靶物質鍵合到微珠1，并且微珠1用于檢測操作。
⑴管道饋送過程
將微珠1以懸浮在液體中的狀態(tài)被饋送通過管道61，使得微珠1經(jīng)過由圖像獲 取裝置65和66獲得微珠1的圖像的位置。雖然液體優(yōu)選具有與微珠1相同的折射率， 但是該液體優(yōu)選是不改變靶物質的性質或不會分解靶物質且適合保持靶物質的液體，例如，在捕捉靶物質時所使用的緩沖溶液或者具有更鹽濃度的緩沖溶液。此外，最好不要 將諸如空氣之類的氣泡引入管道61中。
( )檢測過程
(a)檢測識別圖案
將來自光源32和33的光施加在管道61中經(jīng)過成像位置的微珠1上，通過圖像 獲取裝置65和66獲得透射圖像和熒光圖像。如果用于透射圖像的圖像獲取裝置65直接 或通過光學裝置(例如透鏡63或反射鏡)面對形成識別圖案的區(qū)域，則所獲得的透射圖 像可靠地包括識別圖案。
與第一示例中的微珠分析器的情況一樣，將所獲得的透射圖像輸出至圖像識別 裝置36，分析裝置38檢測識別圖案。
(b)檢測熒光
用于熒光圖像的圖像獲取裝置66直接或通過光學裝置(例如透鏡64或反射鏡) 面對微珠1的側表面13，但是并不面對頂表面11或底表面12。因為用于熒光的圖像獲 取裝置66并不面對承載有所形成的識別圖案的表面，不檢測來自識別圖案的熒光，所以 能夠在沒有噪音熒光的情況下檢測熒光。
圖9A和9B是從側表面13拍攝的微珠1的熒光圖像，圖9A是用互補靶物質(完 全匹配)獲得的圖像，而圖9B是用非互補靶物質(失配)獲得的圖像。
因為在微珠1的輪廓區(qū)域(即，微珠1的側表面)中收集來自熒光物質的熒光， 并且該熒光是高強度發(fā)射的，所以如圖9A和9B所示，來自側表面13的熒光圖像在完全 匹配的情況和失配的情況之間存在明顯不同。因此，通過從側表面13拍攝熒光圖像，能 夠提高S/N比，并增強從熒光檢測裝置37向分析裝置38輸出的信號。
為了高精度檢測識別圖案，最好使得用于透射圖像的圖像獲取裝置65的光軸垂 直于頂表面11或底表面12，并從垂直于頂表面11或底表面12的方向獲得透射圖像，并 且，為了提高S/N比，最好使得用于熒光圖像的圖像獲取裝置66的光軸垂直于側表面 13，并從垂直于側表面13的方向獲得熒光圖像。例如，圖像獲取裝置65或66的光軸是 組成光接收單元的透鏡的光軸。
如上所述，具有更高S/N比的根據(jù)本發(fā)明的實施例的微珠分析器和微珠分析方 法能夠以高靈敏度來評測熒光。此外，因為如果從微珠1的側表面13獲得熒光圖像，則 不需要在頂表面11或底表面12上形成非編碼區(qū)112，所以能夠減小微珠1的尺寸并提高 處理能力(每單位時間的處理容量)。
根據(jù)本發(fā)明的實施例的微珠分析方法能夠高精度地檢測例如來自作為標記與靶 物質鍵合的熒光物質的熒光，而不受來自識別圖案的噪音熒光的影響，該微珠分析方法 能夠有助于進一步提高通過使用微珠進行的各種生化分析的處理能力和處理速度。
本申請包含與2009年9月15日遞交于日本特許廳的日本在先專利申請JP 2009-213360和2010年6月30日遞交于日本特許廳的日本在先專利申請JP 2010-148819 中所公開內(nèi)容相關的主題，上述申請的全部內(nèi)容通過引用結合于此。
本領域技術人員應當理解，在所附權利要求書的范圍或其等價范圍內(nèi)，可以根 據(jù)設計需求和其他因素進行各種修改、組合、重組和變更。
權利要求
1.一種微珠分析方法，其用于被形成為柱體形狀的微珠，所述微珠具有彼此面對且 大致平行放置的頂表面和底表面、以及從所述頂表面和所述底表面延伸的側表面，并且 所述微珠承載有形成于所述頂表面和所述底表面中的至少一個表面上的識別圖案、以及 固定在所述微珠的表面上的與分析物質具有親和性的物質，所述方法包括如下步驟從包括所述頂表面和所述底表面中的沒有形成識別圖案的區(qū)域以及所述側表面在內(nèi) 的區(qū)域檢測由于所述分析物質和與所述分析物質具有親和性的所述物質的相互作用而從 所述微珠表面發(fā)射的熒光。
2.根據(jù)權利要求1所述的微珠分析方法，還包括下列步驟將所述微珠與所述分析物質混合；獲得包括所述識別圖案的所述微珠的透射圖像，并且由所述透射圖像檢測所述識別 圖案；并且獲得所述微珠的熒光圖像，并且由所述熒光圖像檢測來自包括所述微珠的所述頂 表面和所述底表面中的沒有形成所述識別圖案的區(qū)域以及輪廓區(qū)域在內(nèi)的區(qū)域的所述熒光。
3.根據(jù)權利要求2所述的微珠分析方法，其中，當將所述微珠放置在測量襯底上、并且所述微珠的所述頂表面和所述底表面 中的一個表面與所述測量襯底的表面接觸時，通過圖像獲取裝置獲得所述透射圖像和所 述熒光圖像，所述圖像獲取裝置安裝在與所述測量襯底表面面對的位置。
4.根據(jù)權利要求3所述的微珠分析方法，其中，當將所述微珠放置在表面粗糙化的測量襯底的表面上時，獲得所述透射圖像 和所述熒光圖像。
5.根據(jù)權利要求3所述的微珠分析方法，其中，當在液體中將所述微珠放置在所述測量襯底的表面上時，獲得所述透射圖像 和所述熒光圖像。
6.根據(jù)權利要求2所述的微珠分析方法，其中，當拍攝所述微珠的所述頂表面和所述底表面中的一個的圖像時，獲得了所述 透射圖像，當拍攝所述微珠的所述側表面的圖像時，獲得了所述熒光圖像。
7.—種微珠分析器，其用于分析微珠，所述微珠在其表面上承載有識別圖案，所述 微珠分析器包括圖像獲取裝置，其用于獲得所述微珠的透射圖像和熒光圖像；用于由所述透射圖像檢測所述識別圖案的裝置；和用于在所述熒光圖像中檢測來自沒有形成所述微珠的所述識別圖案的區(qū)域的熒光的裝置。
8.根據(jù)權利要求7所述的微珠分析器，還包括測量襯底，其用于放置所述微珠，其中所述測量襯底的表面和所述圖像獲取裝置被放置為彼此面對，所述測量襯底是 表面粗糙化的。
9.一種微珠分析器，其用于分析被形成為柱體形狀的微珠，所述微珠具有彼此面對 且大致平行放置的頂表面和底表面、以及從所述頂表面和所述底表面延伸的側表面，并 且所述微珠承載有形成于所述頂表面和所述底表面中的至少一個表面上的識別圖案，所述微珠分析器包括用于透射圖像的圖像獲取裝置，其用于獲得所述微珠的透射圖像；和 用于熒光圖像的圖像獲取裝置，其用于獲得所述微珠的熒光圖像， 其中，所述用于透射圖像的圖像獲取裝置獲得所述微珠的所述頂表面和所述底表面 中的一個表面的透射圖像，并且其中，所述用于熒光圖像的圖像獲取裝置獲得所述微珠的所述側表面的熒光圖像。
10.根據(jù)權利要求9所述的微珠分析器，還包括管道，其中，所述用于透射圖像的圖像獲取裝置和所述用于熒光圖像的圖像獲取裝置獲得 在所述管道中流動的所述微珠的圖像。
11.一種微珠分析器，其用于分析微珠，所述微珠在其表面上承載有識別圖案，所述 微珠分析器包括圖像獲取部分，其獲得所述微珠的透射圖像和熒光圖像； 第一部分，其由所述透射圖像檢測所述識別圖案；和第二部分，其在所述熒光圖像中檢測來自沒有形成所述微珠的所述識別圖案的區(qū)域 的熒光。
12.—種微珠分析器，其用于分析被形成為柱體形狀的微珠，所述微珠具有彼此面對 且大致平行放置的頂表面和底表面、以及從所述頂表面和所述底表面延伸的側表面，并 且所述微珠承載有形成于其所述頂表面和所述底表面中的至少一個表面上的識別圖案， 所述微珠分析器包括用于透射圖像的圖像獲取部分，其獲得所述微珠的透射圖像；和 用于熒光圖像的圖像獲取部分，其獲得所述微珠的熒光圖像， 其中，所述用于透射圖像的圖像獲取部分獲得所述微珠的所述頂表面和所述底表面 中的一個表面的透射圖像，并且其中，所述用于熒光圖像的圖像獲取部分獲得所述微珠的所述側表面的熒光圖像。
全文摘要
本發(fā)明提供了微珠分析方法和微珠分析器。微珠被形成為柱體形狀，其具有彼此面對且大致平行放置的頂表面和底表面、以及從頂表面和底表面延伸的側表面，微珠承載有形成于頂表面和底表面中的至少一個表面上的識別圖案以及固定在微珠的表面上的與分析物質具有親和性的物質。微珠分析方法包括以下步驟從包括頂表面和底表面中的沒有形成識別圖案的區(qū)域以及側表面在內(nèi)的區(qū)域檢測由于分析物質和與分析物質具有親和性的物質的相互作用而從微珠表面發(fā)射的熒光。
文檔編號G01N21/64GK102023208SQ20101027721
公開日2011年4月20日 申請日期2010年9月8日 優(yōu)先權日2009年9月15日
發(fā)明者伊東和峰, 坂本直久, 岸井典之, 岸本拓哉, 市村真理, 町田賢三 申請人:索尼公司