專利名稱：軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，具體是一種 貝類樣品中軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
軟骨藻酸(Domoic Acid, DA)是赤潮毒素的一種，由于其中毒后的特征癥狀為喪 失記憶，所以又稱失去記憶性貝毒。DA最早是從一種大型紅藻——樹枝軟骨藻分離所得。 分子式為C15H21NO6，分子量為311. 34，純品為白色固體粉末，熔點(diǎn)為223 224°C，可溶于水 (8mg/mL)，微溶于甲醇(0. 6mg/mL)，在紫外光譜區(qū)的最大吸收波長為242nm。DA主要由海洋 硅藻產(chǎn)生，通過食物鏈被海洋生物所富集，不僅具有相當(dāng)?shù)纳鷳B(tài)風(fēng)險(xiǎn)，更是威脅到了人類健 康。有研究表明海獅食用被DA污染的魚類會(huì)出現(xiàn)早產(chǎn)、流產(chǎn)等生殖障礙。也有研究表明在 低劑量DA的暴露下，仔鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力產(chǎn)生了永久性損傷。1987年在加拿大愛德華王 子島發(fā)生食用被DA污染的紫貽貝的集體中毒事件引起了人們的普遍關(guān)注，中毒者產(chǎn)生嘔 吐、腹瀉，部分人員出現(xiàn)了記憶混亂、記憶喪失、方向辨別障礙，甚至死亡。因此各國相繼制 定了 20μ g/g貝肉的水產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。我國目前并未有相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。目前為止對(duì)于DA的分析已經(jīng)建立了多種方法，用于常規(guī)檢測(cè)的主要是小白鼠生 物檢測(cè)法、高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)法及免疫檢測(cè)法。小白鼠生物法由于檢測(cè)限達(dá)不到要 求，正在被逐步淘汰，但由于其操作方法簡單，設(shè)備要求低仍被一些國家所使用，而高效液 相色譜法以其低檢測(cè)限，高靈敏度受到各國的青睞，已成為不少國家的標(biāo)準(zhǔn)方法。但是高效 液相色譜法對(duì)儀器及技術(shù)人員的要求高，并且不適用于大量樣品的檢測(cè)。而免疫學(xué)方法，正 好結(jié)合了上述兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，儀器操作簡單、檢測(cè)限較低，適用于基層部門的常規(guī)檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒及 其檢測(cè)方法，使得本發(fā)明滿足對(duì)樣品的前處理要求低，還可以減少試劑盒的操作步驟；對(duì)儀 器設(shè)備要求低、試劑保存時(shí)間長、自動(dòng)化程度高、無污染等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明涉及一種軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包含軟骨藻酸特異性抗體、包 被了軟骨藻酸抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、包被緩沖液、封閉液、洗滌液、 抗體稀釋液、顯色劑與終止液；所述的酶標(biāo)板采用96或40孔酶標(biāo)板，包被有能與抗軟骨藻酸抗體特異結(jié)合的軟 骨藻酸抗原，并封閉微孔表面未吸附軟骨藻酸抗原的位點(diǎn)。所述軟骨藻酸特異性抗體為兔抗軟骨藻酸多克隆抗體。所述軟骨藻酸抗原是采用碳二亞胺法、活潑酯法或混合酸酐法將軟骨藻酸小分子 半抗原與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到。所述酶標(biāo)記二抗是辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體。所述包被緩沖液為0. 05-0. lmol/L, pH9. 6的碳酸鹽緩沖液。
3
所述封閉液為1-3%的聚乙烯醇溶液。所述洗滌液為含0. 05-5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。所述抗體稀釋液為含4-10%的聚乙二醇溶液。所述顯色液為由顯色劑A和顯色劑B組成，顯色劑A為過氧化氫，顯色劑B為四甲
基聯(lián)苯胺。所述終止液為l-5mol/L的硫酸溶液。本發(fā)明涉及上述試劑盒用于貝類樣品中軟骨藻酸的檢測(cè)方法，包括以下步驟①樣品前處理②用上述試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，向包被有軟骨藻酸抗原的酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn) 品或樣品溶液和抗體稀釋液；③溫育后洗滌拍干，再加入酶標(biāo)二抗；④進(jìn)一步溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值；⑤分析檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理為將軟骨藻酸包被抗原吸附于固相載體上，加入系列標(biāo) 準(zhǔn)品或樣品溶液和軟骨藻酸特異性多克隆抗體稀釋液，待測(cè)樣品中的軟骨藻酸和預(yù)包被的 抗原競爭結(jié)合特異性抗體，加入酶標(biāo)二抗進(jìn)行酶活性放大作用，顯色后終止。樣品吸光度值 與其殘留物軟骨藻酸的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣品中軟骨藻酸的濃度范 圍。本發(fā)明的檢測(cè)軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競爭ELISA方法定性或 定量檢測(cè)貝類樣品中軟骨藻酸的含量；對(duì)樣品的前處理要求低。采用高特異性的軟骨藻酸 多克隆抗體，主要試劑以工作液的形式提供，可以減少試劑盒的操作步驟，為使用者節(jié)省時(shí) 間并降低因操作步驟冗繁而造成的誤差，本發(fā)明具有特異性高、靈敏度高、精確度高和準(zhǔn)確 度高等特點(diǎn)，對(duì)儀器設(shè)備要求低、試劑保存時(shí)間長、自動(dòng)化程度高、無污染等優(yōu)點(diǎn)，適用于大 批量樣品篩選的定性、定量檢測(cè)，可在貝類食品的快速檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。


圖1軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前 提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的 條件。實(shí)施例1試劑盒組分的制備1. 1軟骨藻酸人工抗原的合成取Img軟骨藻酸(DA)溶于少量溶劑(二甲基亞砜水=1 9)中，加入0. 8mg N-羥基琥珀酰亞胺(20mg/mL，臨用現(xiàn)配)、1.2mg水溶性碳二亞胺(10mg/mL，臨用現(xiàn)配)及 少量0. lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7. 0)，混合均勻后置于25°C培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)2h。隨后轉(zhuǎn)移
4至4°C冰箱內(nèi)，放置過夜。第二天加入2mg鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)，補(bǔ) 加少量0. lmol/L磷酸鹽緩沖液，混合均勻后置于25°C培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)3h。將混合液置入超 濾管內(nèi)管，4500rpm離心15min后，適量稀釋，分裝后保存于_20°C。1. 2軟骨藻酸特異性多克隆抗體的制備將上述軟骨藻酸-KLH偶聯(lián)物用生理鹽水稀釋成lmg/ml溶液備用。選用4只體重1.8_2kg健康雌性新西蘭大白兔。將偶聯(lián)物與等量弗氏完全佐劑 通過注射器混合成油包水的乳濁液，按lmg/kg體重的量首次免疫，采取頸背部皮下多點(diǎn)注 射。每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，劑量及方法同首次免 疫。從第三次免疫開始，每次免疫后7天，耳緣靜脈取血1ml，進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)，當(dāng)抗體效 價(jià)不再升高時(shí)，不加佐劑進(jìn)行最后一次(第9次)免疫，7天后心臟放血，室溫靜置30min 后，37°C溫育lh，使血液凝固，后4°C過夜，4000r/min離心15分鐘，除去血塊，血清部分辛 酸-硫酸銨法進(jìn)行純化透析，即得多克隆抗體，分裝后，冰凍保存。1. 3酶標(biāo)板的準(zhǔn)備用包被緩沖液(0. 05-0. lmol/L, pH9. 6的碳酸鹽緩沖液)將軟骨藻酸和牛血清白 蛋白(BSA)的偶聯(lián)物DA-BSA稀釋成lug/ml，96孔板每孔包被100μ 1，4°C過夜。倒出孔內(nèi)液 體，用洗滌液振蕩洗滌3次，每次3min，拍干。每孔加200μ1封閉液(1%聚乙烯醇溶液)， 37°C封閉2h。倒出孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。實(shí)施例2檢測(cè)軟骨藻酸酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測(cè)軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下列組分(1)包被了軟骨藻酸與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)物的酶標(biāo)板；(2)濃度為8. 4ug/L的軟骨藻酸特異性多克隆抗體工作液；(3)辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體； (4)軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度分別為Ong/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、 100ng/mL、500ng/mL、1 μ g/mL、10 μ g/mL ；(5)包被緩沖液為0. 05mol/L, pH9. 6的碳酸鹽緩沖液；(6)封閉液為的聚乙烯醇溶液；(7)洗滌液為含0. 05 %吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；(8)抗體稀釋液為含4%的聚乙二醇溶液；(9)底物顯色液由顯色劑A和顯色劑B組成，顯色劑A為過氧化氫，顯色劑B為四
甲基聯(lián)苯胺；(10)反應(yīng)終止液為lmol/L的硫酸溶液。實(shí)施例3貝類樣品中軟骨藻酸的檢測(cè)3. 1樣品前處理取生鮮帶殼或冷凍后在室溫下半解凍的樣品，用刀切開閉殼肌取出貝肉，將可食 部分與中腸腺分離，放在網(wǎng)孔細(xì)小的金屬網(wǎng)上浙水5min。取5g樣品，加入IOmL勻漿液 (50%甲醇水溶液)，勻漿后，漩渦振蕩lmin，超聲提取5min ；4000rpm離心20min。移出上 清液至25mL容量瓶，剩余殘?jiān)偌尤雱驖{液5mL，重復(fù)提取兩次，上清液均移至25mL容量瓶 內(nèi)，蒸餾水定容。0. 22 μ m濾膜過濾。
5
3. 2用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)向軟骨藻酸半抗原與卵血清蛋白(BSA)偶聯(lián)物包被的酶標(biāo)板微孔中加入50 μ 1用 4%聚乙二醇的抗體稀釋液稀釋的多克隆抗體，同時(shí)，每孔再加入待測(cè)樣品50 μ 1，每塊板同 時(shí)做標(biāo)線，37°C溫育lh。洗滌3次，用吸水紙拍干。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗 工作液100μ 1，37°C溫育lh，洗滌5次，拍干。每孔加新鮮配制的底物顯色液100 μ 1，顯色 IOmin后每孔加終止液50 μ 1。輕輕震蕩混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的吸光度值。3. 3結(jié)果分析計(jì)算百分吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品吸光度值的平均值(A)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo) 準(zhǔn))的吸光度值(A0)再乘以100%，即抑制率。抑制率(%) = (Α/Α0Χ 100% )公式中A為標(biāo)準(zhǔn)溶液或者樣本溶液的平均吸光度值，A0為Ong/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的平 均吸光度值。以軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)、以抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線，校正曲線在0. 01 10 μ g/mL有良好的線性，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品中軟骨藻酸的濃度可以 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。實(shí)施例4試劑盒靈敏度測(cè)定利用軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，由圖1可 得直線方程為Y = 109. 40-15. 45X，抑制率(Α/Α0)與軟骨藻酸的對(duì)數(shù)值在濃度為0. 01 10 μ g/mL范圍內(nèi)呈顯著的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為R2 = 0. 9682，以抑制率為90%時(shí)的濃度作 為最低檢測(cè)限，可得最低檢測(cè)限約為18ng/mL。實(shí)施例5回收率實(shí)驗(yàn)取3個(gè)濃度的軟骨藻酸標(biāo)樣，添加到樣品中，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)重復(fù)，進(jìn)行測(cè)定。試劑盒回收率的結(jié)果如下，紅心貝為95. 2 101. 3%，扇貝為49. 6 84. 7%，文 蛤?yàn)?7. 2 65%實(shí)施例5試劑盒保存期實(shí)驗(yàn)試劑盒保存條件為2_8°C，經(jīng)過6個(gè)月的測(cè)定，試劑盒的最大吸光度值(零添加)、 50%抑制濃度、軟骨藻酸添加實(shí)際測(cè)定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運(yùn)輸和使用過程中，會(huì) 有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37°C保存條件下放置兩周，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表 明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20°C冰 箱冷凍5天，測(cè)定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在 2-8°C保存12個(gè)月以上。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)貝類樣品中軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，包括包含軟骨藻酸特異性抗體、包被了軟骨藻酸抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、包被緩沖液、封閉液、洗滌液、抗體稀釋液、顯色劑與終止液；所述酶標(biāo)板采用96或40孔酶標(biāo)板，包被有能與抗軟骨藻酸抗體特異結(jié)合的軟骨藻酸抗原，并封閉微孔表面未吸附軟骨藻酸抗原的位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所述軟骨藻酸 特異性抗體為兔抗軟骨藻酸多克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所述軟骨藻酸 抗原是采用碳二亞胺法、活潑酯法或混合酸酐法將軟骨藻酸小分子半抗原與載體蛋白進(jìn)行 偶聯(lián)得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所述酶標(biāo)記二 抗是辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所述包被緩沖 液為0. 05-0. lmol/L, ρΗ9· 6的碳酸鹽緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所述封閉液為 1-3%的聚乙烯醇溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所述洗滌液為 含0. 05-5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所述抗體稀釋 液為含4-10%的聚乙二醇溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所述顯色液為 由顯色劑A和顯色劑B組成，顯色劑A為過氧化氫，顯色劑B為四甲基聯(lián)苯胺。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測(cè)貝類樣品中軟骨藻酸的方法，其特征在于， 包括以下步驟①樣品前處理；②用上述試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，向包被有軟骨藻酸抗原的酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或 樣品溶液和抗體稀釋液；③溫育后洗滌拍干，再加入酶標(biāo)二抗；④進(jìn)一步溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值；⑤分析檢測(cè)結(jié)果。
全文摘要
一種生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒。試劑盒包括包含軟骨藻酸特異性抗體、包被了軟骨藻酸抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、包被緩沖液、封閉液、洗滌液、抗體稀釋液、顯色劑與終止液；檢測(cè)方法為用試劑盒對(duì)經(jīng)過前處理的樣品進(jìn)行檢測(cè)；向包被有軟骨藻酸抗原的酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液和抗體稀釋液；溫育后洗滌拍干，再加入酶標(biāo)二抗；進(jìn)一步溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值；分析檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明具有特異性高、靈敏度高、精確度高和準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，對(duì)儀器設(shè)備要求低、試劑保存時(shí)間長、自動(dòng)化程度高、無污染等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101949923SQ20101028345
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月16日
發(fā)明者劉元嫄, 程金平, 高利利 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)