專利名稱：基于蛋白a固定化抗體的微珠免疫分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫檢測方法，特別涉及一種基于蛋白A固定化抗體的微珠免疫分析 方法。
背景技術(shù)：
蛋白A是葡萄球菌蛋白A (staphylococcus protein A, SPA)的簡稱，是一種從金 黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)細胞壁中分離的蛋白質(zhì)。蛋白A主要有5個結(jié)合 抗體的功能域，每個結(jié)構(gòu)域大約由58個氨基酸殘基組成(1、Karen L. A, Julia D. B, Emily S.S.aureus IgG—bindingproteins SpA and Sbi :Host specificity and mechanisms of immune complex format ion, Mo lecular Immuno logy, 2008,45 1600-1611 ；2、逢少蕉，梁浩， 宋淑亮，葡萄球菌蛋白A活性機制與現(xiàn)代應(yīng)用，生命的化學，2008，28卷第6期，748-751)?，F(xiàn)有的雙抗夾心法存在的主要缺陷在于在抗體偶聯(lián)過程中，由于抗體的倒伏， 造成抗體分子的失活，從而使其無法對抗原進行正確的識別。蛋白A可以與抗體的Fc端 特異性結(jié)合，這種結(jié)合不會影響抗體的活性，且能使抗體分子識別抗原的區(qū)域F(ab)端暴 露出來，使抗體的活性能夠得到較好的保持，有利于后續(xù)的檢測。蛋白A與抗體Fc端的 結(jié)合沒有選擇性，導(dǎo)致其能與信號分子FITC (fluorescein isothiocyanate)標記的抗體 直接結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。利用酶切技術(shù)及熒光標記技術(shù)對信號分子FITC進 行處理，切去抗體的Fc端并標記上FITC，從而降低檢測中的背景熒光(3、Brogan K L， Wolfe K N,Jones PA,et al. Directoriented immobilization ofF(ab&prime ；)antibody fragments on gold. Analytica Chimica Acta, 2003,496 (1-2) 73-80 ；4> SjOdahl J. Repetitive Sequences in Protein A from Staphylococcusaureus. Arrangement of Five Regions within the Protein, Four being Highly Homologous andFc-Binding. European Journal ofBiochemistry, 1977, 73 (2) 343-351 ；5> HiiseyinA, Nilay B, Ziibeyde B. Antibody purification with protein A attached supermacroporous poly(hydroxyethylmethacrylate)cryogel, Biochemical Engineering Journal,2009, 45 201-208)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)氨基微珠上抗體分子定向偶聯(lián)的基于蛋白A 固定化抗體的微珠免疫分析方法。所述基于蛋白A固定化抗體的微珠免疫分析方法包括以下步驟1)用橋聯(lián)試劑對氨基微珠表面進行處理，再將蛋白A在緩沖液中偶聯(lián)到氨基微珠 上；2)將偶聯(lián)了蛋白A的氨基微珠與AFPfelphafetoprotein，甲胎蛋白)抗體1進行 孵育，得抗體固定化微珠；3)將抗體固定化微珠與人血清樣品進行孵育，使抗體固定化微珠特異性識別人血清樣品中的抗原AFP，得結(jié)合了抗原AFP的抗體固定化微珠；4)將結(jié)合了抗原AFP的抗體固定化微珠與AFP抗體2進行孵育，使抗原AFP與AFP 抗體2結(jié)合，得處理后的抗體固定化微珠；5)將FITC標記的能夠識別AFP抗體2的二抗與步驟4)所得的處理后的抗體固定 化微珠進行孵育，檢測熒光強度，即得人血清樣品中的AFP，完成基于蛋白A固定化抗體的 微珠免疫分析。在步驟1)中，所述橋聯(lián)試劑可采用戊二醛溶液等，所述戊二醛溶液的體積比濃度 可為5% 15% ；所述處理的條件為溫度25 40°C，時間1 3h ；所述緩沖液可采用常規(guī) PBS溶液等，所述偶聯(lián)的溫度可為25 40°C，偶聯(lián)的時間可為1 3h ；在進行偶聯(lián)前，還可用硼氫化鈉對橋聯(lián)試劑處理后的氨基微珠進行再次處理，再 次處理條件為將氨基微珠浸入6%的硼氫化鈉水溶液中l(wèi)h。在步驟2)中，所述孵育的溫度可為4 20°C，孵育的時間可為5 28h ；所述AFP 抗體1可為鼠抗人AFP抗體。在步驟3)中，所述孵育的溫度可為37°C，孵育的時間可為1 3h ；進行孵育前還 可將步驟2)所得抗體固定化微珠進行如下處理用含30mol/L DMP ( 二甲基庚二酸亞胺脂——二鹽酸化物)的硼酸緩沖液對微珠 進行處理2次，每次45min，最后用含有乙醇胺的硼酸緩沖液終止反應(yīng)。在步驟4)中，所述孵育的溫度可為37°C，孵育的時間可為2 5h ；所述AFP抗體 2可為兔抗人AFP抗體；在步驟5)中，所述孵育的溫度為4 10°C，孵育的時間為1 3h ；進行孵育前還 可使用胃蛋白酶將FITC標記的能夠識別AFP抗體2的二抗進行酶切；所述能夠識別AFP抗 體2的二抗可為羊抗兔抗體。本發(fā)明所述基于蛋白A固定化抗體的微珠免疫分析方法與現(xiàn)有雙抗夾心方法相 比，具有諸多優(yōu)勢。首先，現(xiàn)有雙抗夾心方法在固定抗體過程中可能導(dǎo)致抗體的倒伏，使抗 體識別抗原的F(ab)端功能域被掩蓋，無法正常識別抗原，降低了氨基微珠識別抗原的能 力。而本發(fā)明基于蛋白A特異性識別抗體Fc端的特性，能夠使抗體的F(ab)端功能域完全 暴露出來，使檢測效果得到顯著改善。同時，通過使用胃蛋白酶對識別抗原的第二個抗體進 行切割，再用FITC對切割后的抗體進行標記，將其作為信號分子來降低檢測背景。由于胃 蛋白酶的切割會切去抗體Fc端，相當于將熒光標記抗體與蛋白A結(jié)合的位點切除，理論上 熒光標記抗體就不可能直接偶聯(lián)到微珠上，降低了非特異性吸附，避免了假陽性的出現(xiàn)，提 高了檢測的精確度。


圖1為不同濃度AFP的檢測曲線。在圖1中，橫坐標為人血清樣品通過計算得 到的AFP濃度(ng/ml)，縱坐標為流式細胞儀測出的熒光強度；擬合曲線函數(shù)為F(X)= 1312. 13+2. 089X，相關(guān)系數(shù)(R2)達到了 0. 9967。圖2為FITC標記熒光光譜圖，在圖2中，橫坐標為波長(nm)，縱坐標為熒光信號 值；曲線1為未切割的FITC標記的抗體，購自北京中衫金橋；曲線2為切割后的FITC標記 的抗體(胃蛋白酶切割購自北京中衫金橋的FITC標記的抗體即得)；曲線3為去離子水。
圖3為FITC標記紫外吸收光譜圖，在圖3中，橫坐標為激發(fā)光的波長(nm)，縱坐標 為紫外分光光度計測出的信號值A(chǔ) ；曲線1為未切割的FITC標記的抗體，購自北京中衫金 橋；曲線2為申請人制備的FITC標記的抗體；曲線3為切割后的FITC標記的抗體(胃蛋白 酶切割購自北京中衫金橋的FITC標記的抗體即得)。圖4為不同抗體的熒光強度對比圖。在圖4中，橫坐標為抗體，縱坐標為熒光強 度；1為切割后的FITC標記的抗體(胃蛋白酶切割購自北京中衫金橋的FITC標記的抗體 即得)；2為申請人制備的FITC標記的抗體；3為未切割的FITC標記的抗體，購自北京中衫 金橋；圖中的a是檢測正常人血清的結(jié)果，b是檢測AFP濃度為80ng/ml的人血清的檢測結(jié)^ ο
具體實施例方式實施例11)用5%的戊二醛于25°C對氨基微珠表面進行處理Ih ；2)利用醛基與氨基的希夫堿反應(yīng)與蛋白A進行偶聯(lián)，將蛋白A分子修飾到氨基微 珠表面，偶聯(lián)緩沖液為PBS溶液，偶聯(lián)溫度為25°C，時間為3h ；3)利用硼氫化鈉將蛋白A與微珠形成的碳氮雙鍵進行還原，處理條件為將氨基 微珠放入6%的硼氫化鈉水溶液中處理Ih ；4)利用蛋白A與抗體Fc端定向結(jié)合的特點，在磷酸緩沖液中將抗體與氨基微珠進 行孵育過夜，孵育溫度為4°C，即得抗體固定化微珠；5)運用DMP (二甲基庚二酸亞胺脂——二鹽酸化物)對抗體固定化微珠進行固定， 處理方法為用DMP含量為30M的硼酸緩沖液對微珠進行處理2次，每次45min，最后用含有 乙醇胺的硼酸緩沖液終止反應(yīng)；6)將抗體固定化微珠與人類血清進行混合孵育，溫度為37°C，時間為Ih ；7)將抗體固定化微珠與兔抗人AFP混合孵育，孵育溫度為37°C，時間Ih ；8)將抗體固定化微珠與FITC標記的羊抗兔抗體混合孵育，孵育溫度為4°C，時間 2h ；9)用流式細胞儀對微珠熒光強度進行檢測，從而檢測血清樣本中的AFP(參見圖 1)。該實施例主要是通過蛋白A活化的微珠對血清樣品中的AFP進行檢測，在圖1 中，縱坐標的值為流式細胞儀測出的熒光強度值，橫坐標是人血清樣品通過計算得到的 AFP濃度。隨著AFP濃度的降低，血清樣品的熒光信號值下降，其擬合曲線函數(shù)為F(x)= 1312. 13+2.089X，相關(guān)系數(shù)(R2)達到了 0.9967。在橫坐標所示濃度范圍內(nèi)進行檢測時，血 清樣品的熒光信號與濃度幾乎呈線性關(guān)系。在流式細胞儀的檢測過程中，每個樣品檢測10000個微珠的信號值，再計算平均 值，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義，圖1中熒光強度值均為扣除背景熒光后的數(shù)值。實施例21)取三組氨基微珠，用5%的戊二醛于25°C對氨基微珠表面進行處理Ih ；2)利用醛基與氨基的希夫堿反應(yīng)與蛋白A進行偶聯(lián)，將蛋白A分子修飾到氨基微 珠表面，偶聯(lián)緩沖液為PBS溶液，偶聯(lián)溫度為25°C，時間為3h ；
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3)利用硼氫化鈉將蛋白A與微珠形成的碳氮雙鍵進行還原，處理條件為將氨基 微珠放入6%的硼氫化鈉水溶液中處理Ih ；4)利用蛋白A與抗體Fc端定向結(jié)合的特點，在磷酸緩沖液中將抗體與氨基微珠進 行孵育過夜，孵育溫度為4°C，即得抗體固定化微珠；5)運用DMP (二甲基庚二酸亞胺脂-二鹽酸化物)對抗體固定化微珠進行固定，處 理方法為用DMP含量為30M的硼酸緩沖液對微珠進行處理2次，每次45min，最后用含有乙 醇胺的硼酸緩沖液終止反應(yīng)；6)將抗體固定化微珠與人類血清進行混合孵育，溫度為37°C，時間為Ih ；7)將抗體固定化微珠與兔抗人AFP混合孵育，孵育溫度為37°C，時間Ih ；8)用FITC對切割的羊抗兔抗體進行標記；9)將3組微珠分別用未切割的FITC標記羊抗兔抗體，切割后的FITC標記羊抗兔 抗體，購買的FITC標記羊抗兔抗體孵育，孵育溫度為4°C，時間2h ；10)用流式細胞儀對微珠進行熒光強度的檢測，檢測血清中的AFP。該實施例主要是通過對熒光標記的抗體進行切割，去掉其Fc端，進一步降低背 景，增大信噪比，切割后的背景較未切割降低了很多(參見圖2、圖3)，并且可以檢測出到更 低濃度的樣品，提高檢測的可靠性(參見圖4)。
權(quán)利要求
基于蛋白A固定化抗體的微珠免疫分析方法，包括以下步驟1)用橋聯(lián)試劑對氨基微珠表面進行處理，再將蛋白A在緩沖液中偶聯(lián)到氨基微珠上；2)將偶聯(lián)了蛋白A的氨基微珠與AFP抗體1進行孵育，得抗體固定化微珠；3)將抗體固定化微珠與人血清樣品進行孵育，使抗體固定化微珠特異性識別人血清樣品中的抗原AFP，得結(jié)合了抗原AFP的抗體固定化微珠；4)將結(jié)合了抗原AFP的抗體固定化微珠與AFP抗體2進行孵育，使抗原AFP與AFP抗體2結(jié)合，得處理后的抗體固定化微珠；5)將FITC標記的能夠識別AFP抗體2的二抗與步驟4)所得的處理后的抗體固定化微珠進行孵育，檢測熒光強度，即得人血清樣品中的AFP，完成基于蛋白A固定化抗體的微珠免疫分析。
2.如權(quán)利要求1所述的基于蛋白A固定化抗體的微珠免疫分析方法，其特征在于在 步驟1)中，所述橋聯(lián)試劑為戊二醛溶液，所述戊二醛溶液的體積比濃度為5% 15%。
3.如權(quán)利要求1所述的基于蛋白A固定化抗體的微珠免疫分析方法，其特征在于在 步驟1)中，所述處理的條件為溫度25 40°C，時間1 3h ；所述偶聯(lián)的緩沖液為常規(guī)PBS 溶液，所述偶聯(lián)的溫度為25 40°C，偶聯(lián)的時間為1 3h。
4.如權(quán)利要求1所述的基于蛋白A固定化抗體的微珠免疫分析方法，其特征在于在 步驟1)進行偶聯(lián)前，用硼氫化鈉對橋聯(lián)試劑處理后的氨基微珠進行再次處理，再次處理條 件為將氨基微珠浸入6%的硼氫化鈉水溶液中l(wèi)h。
5.如權(quán)利要求1所述的基于蛋白A固定化抗體的微珠免疫分析方法，其特征在于在 步驟2)中，所述孵育的溫度為4 20°C，孵育的時間為5 28h ；所述AFP抗體1為鼠抗人 AFP抗體。
6.如權(quán)利要求1所述的基于蛋白A固定化抗體的微珠免疫分析方法，其特征在于在 步驟3)中，所述孵育的溫度為37°C，孵育的時間為1 3h。
7.如權(quán)利要求1所述的基于蛋白A固定化抗體的微珠免疫分析方法，其特征在于在 步驟3)中進行孵育前，將步驟2)所得抗體固定化微珠進行如下處理用含30mol/L 二甲基庚二酸亞胺脂-二鹽酸化物的硼酸緩沖液對微珠進行處理2次， 每次45min，最后用含有乙醇胺的硼酸緩沖液終止反應(yīng)。
8.如權(quán)利要求1所述的基于蛋白A固定化抗體的微珠免疫分析方法，其特征在于在 步驟4)中，所述孵育的溫度為37°C，孵育的時間為2 5h ；所述AFP抗體2為兔抗人AFP 抗體。
9.如權(quán)利要求1所述的基于蛋白A固定化抗體的微珠免疫分析方法，其特征在于在 步驟5)中，所述孵育的溫度為4 10°C，孵育的時間為1 3h。
10.如權(quán)利要求1所述的基于蛋白A固定化抗體的微珠免疫分析方法，其特征在于在 步驟5)中，進行孵育前使用胃蛋白酶將FITC標記的能夠識別AFP抗體2的二抗進行酶切； 所述能夠識別AFP抗體2的二抗為羊抗兔抗體。
全文摘要
基于蛋白A固定化抗體的微珠免疫分析方法。涉及免疫檢測方法，提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)氨基微珠上抗體分子定向偶聯(lián)的基于蛋白A固定化抗體的微珠免疫分析方法。包括以下步驟用橋聯(lián)試劑對氨基微珠表面進行處理，將蛋白A偶聯(lián)到氨基微珠上，再與AFP抗體1進行孵育，得抗體固定化微珠；將抗體固定化微珠與人血清樣品進行孵育，結(jié)合了抗原AFP的抗體固定化微珠與AFP抗體2進行孵育，F(xiàn)ITC標記的能夠識別AFP抗體2的二抗與抗體固定化微珠進行孵育，檢測熒光強度，即得人血清樣品中的AFP。
文檔編號G01J1/00GK101936987SQ20101028503
公開日2011年1月5日 申請日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月16日
發(fā)明者周雷激, 趙征寰 申請人:廈門大學