專利名稱：凍干型血小板抗原譜細胞的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域。
背景技術：
血小板抗體是由異體或自身血小板抗原作用機體產生的，包括同種異體抗體、自 身抗體、同種抗體、藥物依賴性抗體和非特異性抗體五類，這些抗體作用于人體血小板可 導致血小板發(fā)生破壞并引起胎母同種異體免疫血小板減少癥(FMAIT)、血小板輸注無效癥 (PTR)、輸血后紫癜(PTP)等多種血小板免疫疾病。準確、快速、簡便的檢測和鑒定出血小板抗體對血小板免疫性疾病的診斷、治療等 方面起著重要的作用。然而，目前國際上尚缺乏標準化的血小板抗原譜細胞供臨床常規(guī)檢 測應用，主要原因是血小板在液態(tài)環(huán)境下極易發(fā)生聚集并丟失其抗原性。目前各實驗室在 檢測血小板抗體時只能采用自行制備的血小板抗原，因為不知道血小板的抗原，導致同一 份樣本在各實驗室檢測的結果很難一致。另外隨機選用的血小板進行血小板抗體檢測時極 易造成血小板抗體的漏檢，導致錯誤的檢測和診斷結果。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為了解決臨床缺乏血小板抗原譜細胞，易出現抗體漏檢和不能確 定抗體特異性的問題，組建ΗΡΑ-Γ6，15基因分型的血小板抗原譜細胞系，可廣泛應用于血 小板抗體的檢測和特異性鑒定的凍干型血小板抗原譜細胞的制備方法。本發(fā)明步驟是
a、血小板抗原ΗΡΑ-Γ6和HPA-15系統(tǒng)基因分型的檢測
采集獻血員EDTA抗凝全血，通過鹽析法提取DNA，其純度應在1. 6以上；對獻血員樣本 進行HPA-廣6，15系統(tǒng)進行基因分型，擴增條件如下95°C預變性5min后，95°C 30s, 60°C 30s, 72°C 50s，30 個循環(huán)，72°C延伸 5min ；
b、組建血小板抗原譜細胞系
血小板抗原譜細胞根據0型獻血員的血小板抗原分型結果建立10組HPA-廣6，15系統(tǒng) 的抗原譜，其抗原分型見表1 ；
c、血小板懸液的制備采集篩選好的10名獻血員新鮮EDTA抗凝全血，900rpm離心 30min ；取上層富血小板血漿，3000rpm離心30min ；棄血漿，用凍干保護液充分懸浮壓積血 小板，并調節(jié)血小板濃度為10(T150X107L ；
d、負載將血小板懸液置于37°C恒溫箱中負載4h，期間每隔30min振蕩混勻一次；
e、冷凍干燥將負載后的血小板懸液分裝后，置于凍干機中進行冷凍干燥；其凍干條 件見表2。本發(fā)明凍干保護液包括0. 2M pH7. 0 PBS，0. 2M pH7. 0 PBS中含30 50 mmol/L的 海藻糖和廣3%的牛血清白蛋白。本發(fā)明將凍干型血小板抗原譜細胞用生理鹽水溶解后，用來進行血小板抗體檢測及特異性鑒定實驗。本發(fā)明的優(yōu)點用基因分型的0型血獻血員的血小板制備成穩(wěn)定的血小板抗原譜 細胞凍干品，為臨床提供可長期保存的抗原，防止臨床漏檢血小板抗體，也使得血小板抗體 檢測和鑒定易于常規(guī)化，標準化。本發(fā)明關鍵在于檢測0型獻血員HPA-廣6，15基因分型，根據分型的結果建立血小 板抗原譜。HPA基因分型的血小板抗原譜細胞，經冷凍干燥制備成抗原性穩(wěn)定的凍干品，在 血小板抗體檢測時可確定抗體的特異性，同時解決了血小板抗原難以穩(wěn)定保存的難題。


圖1是本發(fā)明固相凝集法反應格局圖----------陽性；
圖2是本發(fā)明固相凝集法反應格局圖----------弱陽性；
圖3是本發(fā)明固相凝集法反應格局圖----------陰性。
具體實施例方式本發(fā)明步驟是
a、血小板抗原ΗΡΑ-Γ6和HPA-15系統(tǒng)基因分型的檢測
采集獻血員EDTA抗凝全血，通過鹽析法提取DNA，其純度應在1. 6以上；對獻血員樣本 進行HPA-廣6，15系統(tǒng)進行基因分型，擴增條件如下95°C預變性5min后，95°C 30s, 60°C 30s, 72°C 50s，30個循環(huán)，72°C延伸5min ；電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結果。b、組建血小板抗原譜細胞系
HPA是血小板上特異性抗原，具有多態(tài)性。在血小板輸血、妊娠、移植時易造成產生相應 抗體并引起相關的血小板相關免疫性疾病。血小板抗原譜細胞根據0型獻血員的血小板抗原分型結果建立10組HPA-廣6，15 系統(tǒng)的抗原譜，其抗原分型見表1 ；
表1. 10組血小板抗原譜細胞的HPA-廣6，15系統(tǒng)的抗原分型
權利要求
一種凍干型血小板抗原譜細胞的制備方法，其特征在于a、血小板抗原HPA 1~6和HPA 15系統(tǒng)基因分型的檢測采集獻血員EDTA抗凝全血，通過鹽析法提取DNA，其純度應在1.6以上；對獻血員樣本進行HPA 1~6，15系統(tǒng)進行基因分型，擴增條件如下95℃預變性5min后，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 50s，30個循環(huán)，72℃延伸5min ；b、組建血小板抗原譜細胞系血小板抗原譜細胞根據O型獻血員的血小板抗原分型結果建立10組HPA 1~6，15系統(tǒng)的抗原譜，其抗原分型見表1； c、血小板懸液的制備采集篩選好的10名獻血員新鮮EDTA抗凝全血，900rpm離心30min；取上層富血小板血漿，3000rpm離心30min；棄血漿，用凍干保護液充分懸浮壓積血小板，并調節(jié)血小板濃度為100~150×109/L ；d、負載將血小板懸液置于37℃恒溫箱中負載4h，期間每隔30min振蕩混勻一次；e、冷凍干燥將負載后的血小板懸液分裝后，置于凍干機中進行冷凍干燥；其凍干條件見表2。
2.權利要求1所述的凍干型血小板抗原譜細胞的制備方法，其特征在于凍干保護液 包括0. 2M pH7. 0 PBS，0. 2M ρΗ7· 0 PBS中含30 50 mmol/L的海藻糖和Γ3%的牛血清白蛋白。
3.權利要求1所獲得凍干型血小板抗原譜細胞的用途，其特征在于將凍干型血小板 抗原譜細胞用生理鹽水溶解后，用來進行血小板抗體檢測及特異性鑒定實驗。
全文摘要
一種凍干型血小板抗原譜細胞的制備方法，屬于生物技術領域。本發(fā)明的目的是為了解決臨床缺乏血小板抗原譜細胞，易出現抗體漏檢和不能確定抗體特異性的問題，組建HPA-1~6，15基因分型的血小板抗原譜細胞系，可廣泛應用于血小板抗體的檢測和特異性鑒定的凍干型血小板抗原譜細胞的制備方法。本發(fā)明步驟是a、血小板抗原HPA-1~6和HPA-15系統(tǒng)基因分型的檢測；b、組建血小板抗原譜細胞系；c、血小板懸液的制備；d、負載；e、冷凍干燥。本發(fā)明關鍵在于檢測O型獻血員HPA-1~6,15基因分型，根據分型的結果建立血小板抗原譜。HPA基因分型的血小板抗原譜細胞，經冷凍干燥制備成抗原性穩(wěn)定的凍干品，在血小板抗體檢測時可確定抗體的特異性，同時解決了血小板抗原難以穩(wěn)定保存的難題。
文檔編號G01N33/531GK101957364SQ201010285608
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月19日 優(yōu)先權日2010年9月19日
發(fā)明者孔維臣, 楊文沖, 段生寶, 童軍, 邰慧波, 鞠海英 申請人:李勇