專利名稱：乙肝多位點基因檢測試劑盒及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外診斷類醫(yī)療器械，具體是一種適用于乙肝病毒多位點耐藥基因檢測的試劑盒。
背景技術(shù)：
乙肝是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種世界性疾病。全世界無癥狀乙肝病毒攜帶者(HBsAg攜帶者)超過2.8億，我國約占1.3億。據(jù)統(tǒng)計，目前我國有乙肝患者3000萬。 目前治療乙肝的重要抗病毒藥物是核苷酸類似物，臨床常用藥有拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋和替比夫定。這類藥物的使用可以有效延緩乙肝病情進(jìn)展，為慢性乙肝的治療帶來了突破性的進(jìn)展。但是這類藥物用藥期長，容易引起乙肝病毒變異，產(chǎn)生耐藥性，影響療效的穩(wěn)定性。針對市場上缺乏乙肝多位點耐藥性檢測的相關(guān)產(chǎn)品，本發(fā)明提供的一種乙肝多位點基因檢測試劑盒，不僅操作簡單，檢測質(zhì)量好，而且價格便宜，有利于醫(yī)生在治療病患時及時改變用藥計劃。

發(fā)明內(nèi)容
乙肝多位點基因檢測試劑盒包括DNA抽提試劑、PCR試劑、LDR試劑和標(biāo)準(zhǔn)品。DNA抽提試劑包括濃縮液和裂解緩沖液，只需準(zhǔn)備IOOyL含乙型肝炎病毒血清，加入濃縮液100 μ L，12000rpm離心IOmin ；棄上清；加入25 μ L裂解緩沖液混勻， IOO0C IOmin裂解；最后12000rpm離心lOmin，上清即為所用的乙肝DNA樣本。PCR試劑包括兩對PCR正向引物和反向引物、Taq聚合酶、聚合酶緩沖液、 dNTP和MgCl2。PCR引物序列如下，正向引物1 :CTACCAGCACGGGACCATGC ；反向引物 1CAAGATGTTGTACAGACTTGG ；正向弓丨物 2 GTCCCTTTTTACCTCTATTACCA ；反向弓丨物 2 TACATGCATATAAAGGCATTGAGG。PCR 擴(kuò)增體系為10 X PCR Buffer 2μ L ； 50mM MgCl22. 4 μ L ； IOmM dNTP Mix 2μ L ；2U/y L DNA 聚合酶 0. 5 μ L ； IO3-IO7 滴度的 DNA template 2μ L ；2mM 的引物2 μ L ；ddH20 9. 1 μ L。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件95°C 15min變性和酶激活；94°C 15s變性，50-60°C 0. 5-1. 5min 退火，72°C 0. 5-1. 5min 延伸，循環(huán) 35 次；最后 72°C 5min 延伸。LDR試劑包括相關(guān)位點的探針、Taq連接酶和連接酶緩沖液。LDR探針設(shè)計時引入了通用熒光標(biāo)記探針方案，降低了試劑盒的制造成本。LDR探針包括通用熒光標(biāo)記探針、通用模板、標(biāo)記探針和檢測探針，其中通用熒光標(biāo)記探針和通用模板具有極高的特異性，通用熒光標(biāo)記探針序列為GCATCACTCAGAGGG;通用模板序列為 CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG。通用熒光標(biāo)記探針已經(jīng)具有5‘磷酸化和3'熒光標(biāo)記，利用通用模板分別與通用熒光標(biāo)記探針、標(biāo)記探針互補配對，實現(xiàn)通用熒光標(biāo)記探針對標(biāo)記探針的熒光標(biāo)記。標(biāo)記探針包含三個部分，一部分為和模板配對部分，另一部分為隨機序列用于調(diào)整探針的長度，最后一部分則為和通用模板配對部分。檢測探針包括兩部分，一部分為和模板配對部分，另一部分則為隨機序列用于調(diào)整LDR產(chǎn)物長度。標(biāo)記探針和檢測探針的序列見表1。LDR擴(kuò)增反應(yīng)體系為10X連接酶配套緩沖液1 μ L ；2mM探針1 μ L ；2U/μ LTaq連接酶 0. 2 μ L ；PCR 產(chǎn)物 1 μ L ；CldH2O 7 μ L。LDR 反應(yīng)條件為94°C 2min 充分變性；94°C 15s 變性，55°C 2min連接，循環(huán)15次。表1 LDR探針序列
權(quán)利要求
1.一種乙肝多位點基因檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括DNA抽提試劑、PCR試劑、LDR試劑和標(biāo)準(zhǔn)品；DNA抽提試劑為DNA濃縮裂解試劑，包括濃縮液和裂解緩沖液；PCR 試劑包括兩對PCR正向引物和反向引物、Taq聚合酶、聚合酶緩沖液、dNTP和MgCl2 ；LDR試劑包括相關(guān)位點的探針、Taq連接酶和連接酶緩沖液，相關(guān)位點為rtL180M，YMDD/YIDD, YVDD, rtA181V/T, rtN236T, rtT184G, rtS202I 和 rtM250V ；標(biāo)準(zhǔn)品為野生型 HBV DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙肝多位點基因檢測試劑盒，其特征在于PCR擴(kuò)增位點包括拉米夫定、替米夫定、阿德福韋和恩替卡韋的耐藥位點，所用引物序列為正向引物 1 CTACCAGCACGGGACCATGC,反向引物 1 CAAGATGTTGTACAGACTTGG,正向引物 2 GTCCCTTTTTACCTCTATTACCA，反向引物 2 TACATGCATATAAAGGCATTGAGG
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙肝多位點基因檢測試劑盒，其特征在于PCR擴(kuò)增體系為10 XPCR Buffer2y L ；50mM MgCl22. 4 μ L ；IOmM dNTP Mix 2 μ L ;2U/μ LDNA 聚合酶 0. 5μ L ;103-107 滴度的 DNA template2 μ L ;2mM 的引物 2 μ L ;ddH20 9. 1 μ L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙肝多位點基因檢測試劑盒，其特征在于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件:95°C 15min變性和酶激活；94 °C 1 變性，50_60°C 0. 5_1.5min退火， 72 °C 0. 5-1. 5min延伸，循環(huán)35次；最后72 °C 5min延伸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙肝多位點基因檢測試劑盒，其特征在于 LDR探針的設(shè)計引入通用熒光標(biāo)記探針方案，其中通用熒光標(biāo)記探針和通用模板都具有極高的特異性，序列為通用熒光標(biāo)記探針GCATCACTCAGAGGG ；通用模板 CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙肝多位點基因檢測試劑盒，其特征在于標(biāo)記探針包含三個部分，一部分為和模板配對部分，另一部分為隨機序列用于調(diào)整探針的長度，最后一部分則為和通用模板配對部分；檢測探針包括兩部分，一部分為和模板配對部分，另一部分則為隨機序列用于調(diào)整LDR產(chǎn)物長度；序列如下
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙肝多位點基因檢測試劑盒，其特征在于LDR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10X連接酶配套緩沖液1 μ L ；2mM探針1 μ L ;2U/y L Taq連接酶0. 2 μ L ；PCR產(chǎn)物 1 μ L ；ddH20 7 μ L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙肝多位點基因檢測試劑盒，其特征在于LDR反應(yīng)條件為:94°C 2min充分變性；94°C 15s變性，55°C 2min連接，循環(huán)15次。
9.制備權(quán)利要求1-11任一項所述的一種乙肝多位點基因檢測試劑盒，包括以下步驟 制備乙肝DNA提取試劑E1試劑為濃縮液，25人份，共2. 5ml ；E2試劑為裂解緩沖液，25人份，共625yL ；制備 PCR 試劑=PI 試劑包括 10XPCR Buffer、dNTP、MgCl2、引物、ddH20, 25 人份，一共 486 μ L ；PE試劑包括G酶、UNG酶，25人份，一共27 μ L ；制備LDR試劑L1、L2試劑包括IOX連接酶配套緩沖液、探針、ddH20，25人份，各 216 μ L ；LE試劑包括Taq連接酶，25人份，一共5. 4 μ L ；制備標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品為野生型HBV DNA, 25人份，共50 μ L。
10.使用權(quán)利要求1-11所述的一種乙肝多位點基因檢測試劑盒，包括以下步驟 乙肝DNA提取準(zhǔn)備100 μ L含乙型肝炎病毒血清，加入濃縮液EllOO μ L，12000rpm離心IOmin ；棄上清；加入25 μ L裂解緩沖液Ε2混勻，100°C IOmin裂解；最后12000rpm離心 lOmin，上清即為所用的乙肝DNA樣本；PCR擴(kuò)增在200μ 1的PCR薄壁管中，加入17μ 1試劑ΡΙ，1μ 1試劑ΡΕ，2μ 1樣本DNA， 充分混勻后短暫離心，最后加入20 μ 1石蠟油進(jìn)行PCR擴(kuò)增；LDR擴(kuò)增取2個200 μ 1 PCR薄壁管，在管1中加入9 μ 1試劑Ll和0. 2 μ 1試劑LE，， 在管2中加入9 μ 1試劑L2和0. 2 μ 1試劑LE，最后在管1和管2中分別加入1 μ IPCR產(chǎn)物，充分混勻后短暫離心，最后加入10 μ 1石蠟油進(jìn)行LDR擴(kuò)增；毛細(xì)管電泳在每個上樣孔中加入10 μ ILoading Buffer, 0. 25 μ 1內(nèi)參標(biāo)EMandard R0X，最后加入0. 5 μ 1的Ll產(chǎn)物和0. 5 μ 1的L2產(chǎn)物，充分混勻后上樣，進(jìn)行測序膠電泳。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乙肝多位點基因檢測試劑盒及其制備和使用方法，該試劑盒包括DNA抽提試劑、PCR試劑、LDR試劑和標(biāo)準(zhǔn)品；DNA抽提試劑為DNA濃縮裂解試劑，包括濃縮液和裂解緩沖液；PCR試劑包括兩對PCR正向引物和反向引物、Taq聚合酶、聚合酶緩沖液、dNTP和MgCl2；LDR試劑包括相關(guān)位點的探針、Taq連接酶和連接酶緩沖液，相關(guān)位點為rtL180M，YMDD/YIDD，YVDD，rtA181V/T，rtN236T，rtT184G，rtS202I和rtM250V；標(biāo)準(zhǔn)品為野生型HBV DNA。
文檔編號G01N21/64GK102409108SQ20101028865
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者陸炯 申請人:上海松茸生物科技有限公司