專利名稱：白細(xì)胞介素6基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程，具體涉及一種可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定且高效表達(dá)的白細(xì)胞介素6 (interleukin-6, IL-6)基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞介素是由多種細(xì)胞產(chǎn)生并作用于多種細(xì)胞的一類細(xì)胞因子。由于最初是由 白細(xì)胞產(chǎn)生又在白細(xì)胞間發(fā)揮作用，所以由此得名。白細(xì)胞介素interleukin縮寫為IL。 白細(xì)胞介素6 (以下縮寫為IL-6)可由多種細(xì)胞合成，包括活化的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì) 胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞等。人類IL-6基因位于 第7號(hào)染色體上；IL-6分子量在21 30kd之間，其差異是由于肽鏈的糖基化和磷酸程度 不同所致。IL-6是以單體形式存在，主要功能為刺激細(xì)胞成長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞分化，對(duì)維持機(jī)體 生理平衡具有重要作用。IL-6作用的靶細(xì)胞很多，包括巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、靜止的T淋巴細(xì)胞、活化的B淋巴 細(xì)胞和漿細(xì)胞等；其生物效應(yīng)是
①促進(jìn)T淋巴細(xì)胞表面IL-2R的表達(dá)，增強(qiáng)IL-I(即白細(xì)胞介素1)和TNF (腫瘤壞 死因子)對(duì)T輔助細(xì)胞的有絲分裂作用；
②作為肝細(xì)胞刺激因子，在感染或外傷引起的急性炎癥反應(yīng)中，誘導(dǎo)急性期反應(yīng)蛋白 的合成，其中以淀粉狀蛋白a和C-反應(yīng)蛋白增加尤為明顯；
③促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖、分化并產(chǎn)生抗體；多發(fā)性骨髓瘤的惡變B淋巴細(xì)胞既能產(chǎn)生 IL-6，又能對(duì)IL-6發(fā)生應(yīng)答，提示IL-6可能作為這些細(xì)胞的自分泌性生長(zhǎng)因子；
④IL-6還能有效地促進(jìn)TNF和IL-I誘導(dǎo)的惡病質(zhì)；促進(jìn)糖皮質(zhì)激素合成；刺激破骨 細(xì)胞活性和角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)；還能促進(jìn)骨髓造血的功能。IL-6不能刺激相應(yīng)細(xì)胞分泌其它細(xì)胞因子，在生理濃度下對(duì)免疫細(xì)胞的自分泌作 用亦比較弱，其主要免疫學(xué)功能是加強(qiáng)其它細(xì)胞因子的效果。逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，它有三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因gag_編碼病毒衣殼、基質(zhì)等結(jié)構(gòu) 蛋白的基因；Pol-編碼逆轉(zhuǎn)錄酶(p66/p51)、蛋白水解酶和整合酶；env-編碼gpl20和gp41 兩種包膜糖蛋白。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下可使RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，整合到宿主細(xì)胞基因組中，并 隨著宿主細(xì)胞中的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等蛋白酶作用下擴(kuò)增。近年來(lái)隨著基因工程的不 斷發(fā)展，已設(shè)計(jì)構(gòu)建成一些缺陷型病毒，使逆轉(zhuǎn)錄病毒成為有用的基因載體，特別是動(dòng)物基 因克隆載體。其最重要的一點(diǎn)是它可以有效的整合入靶細(xì)胞基因組并穩(wěn)定持久地表達(dá)所帶 的外源基因。病毒基因組以轉(zhuǎn)座的方式整合，其基因組不會(huì)發(fā)生重排，因此所攜帶的外源基 因也不會(huì)改變。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的寄主范圍相當(dāng)廣泛，可以感染各種細(xì)胞類型，如淋 巴細(xì)胞或肝細(xì)胞、肌細(xì)胞等，其中有的還能夠在人體細(xì)胞中生長(zhǎng)；而且逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的感 染效率高，所感染的細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生病變導(dǎo)致寄主細(xì)胞的死亡。目前市場(chǎng)上銷售的多為純化 的重組IL-6細(xì)胞因子，價(jià)格非常昂貴，若用于動(dòng)物體內(nèi)，則以每公斤微克量來(lái)計(jì)算，一只成 年大鼠體內(nèi)注射IL-6平均需要花上百元，因此，有必要構(gòu)建重組質(zhì)粒來(lái)滿足科學(xué)研究的不斷需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供白細(xì)胞介素6基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法，該方法 對(duì)設(shè)備要求不高，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的理化性質(zhì)穩(wěn)定，在制備、儲(chǔ)存和應(yīng)用過(guò)程中簡(jiǎn)單易行， 適合推廣應(yīng)用；得到的白細(xì)胞介素6基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠感染多種類型的細(xì)胞， 既可以應(yīng)用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞，也可以用于整體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，應(yīng)用范圍廣，感染效率高；而且 價(jià)格較低。本發(fā)明所述的白細(xì)胞介素6基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法，其步驟如下
(1)白細(xì)胞介素6(IL-6)基因片段的擴(kuò)增；
通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法，以大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞cDNA為模板，分 別在上游引物的5’端和下游引物3’端設(shè)計(jì)HinD III和BamH I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)(斜 體下劃線為酶切位點(diǎn))，即
上游引物 5’ -ATC AAGCTT ACCACCATGGGC ATGAAGTTTCTCTCCGC-3 ’
上游引物 5’ -CGT GGATCC GGTTTGCCGAGTAGACCTCATAGTGAC-3，
touch down PCR擴(kuò)增獲得IL6目的基因片段rIL6，其序列為
atgaagtttctctccgcaagagacttccagccagttgccttcttgggactgatgttgttgacagccactgcc ttccctacttcacaagtccggagaggagacttcacagaggataccacccacaacagaccagtatataccacttcaca agtcggaggcttaattacatatgttctcagggagatcttggaaatgagaaaagagttgtgcaatggcaattctgatt gtatgaacagcgatgatgcactgtcagaaaacaatctgaaacttccagaaatacaaagaaatgatggatgcttccaa actggatataaccaggaaatttgcctattgaaaatctgctctggtcttctggagttccgtttctacctggagtttgt gaagaacaacttacaagataacaagaaagacaaagccagagtcattcagagcaatactgaaaccctagttcatatct tcaaacaagagataaaagactcatataaaatagtccttcctaccccaacttccaatgctctcctaatggagaagtta gagtcacagaaggagtggctaaggaccaagaccatccaactcatcttgaaagcacttgaagaatttctaaaggtcac tatgaggtctactcggcaaacctag
(2)重組pSEB-rIL6逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定；
采用PSEB逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有組蛋白標(biāo)簽、hEFH啟動(dòng)子及開放讀碼框 (ORP) ；hEra啟動(dòng)子可有效啟動(dòng)插入ORP中靶基因的高效表達(dá)，同時(shí)3組6個(gè)連續(xù)組蛋白 可以作為檢測(cè)標(biāo)簽，反映ORP中插入靶基因的表達(dá)水平；將步驟(1)中所獲得的基因片段 rIL6的PCR產(chǎn)物及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSEB_3H分別經(jīng)HinD III和BamH I雙酶切，連接轉(zhuǎn)化進(jìn) 入DH2a感受態(tài)菌中，通過(guò)氨芐青霉素篩選單克隆，獲得具有IL-6重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒 pSm-IL6，并進(jìn)行PCR、雙酶切及序列鑒定；
(3)重組pSEB-rIL6逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒在真核細(xì)胞中表達(dá)功能的測(cè)定；
針對(duì)步驟(2)所獲得正確序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒pSEB-IL6質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)應(yīng)用。 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，將步驟(2)中所獲得的逆轉(zhuǎn)錄病毒pSEB-IL6質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到大鼠嗜 鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞HEK293中，mRNA水平和蛋白水平測(cè)定IL-6的表達(dá)水平。本發(fā)明的有益效果是
(1)本發(fā)明所構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒PSEB-IL6質(zhì)?？勺鳛檎婧吮磉_(dá)載體，能夠感染多種類 型的細(xì)胞，既可以應(yīng)用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞，也可以用于整體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，應(yīng)用范圍廣，感染效率聞；
(2)本發(fā)明所采用的載體_逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種改造后的安全病毒，該載體不僅帶有組 蛋白標(biāo)簽，實(shí)時(shí)檢測(cè)表達(dá)水平；而且可以整合入宿主細(xì)胞中，隨著細(xì)胞的不斷分裂而持續(xù)表 達(dá)；
(3)可以本發(fā)明為工具，為研究IL-6的免疫調(diào)節(jié)功能及其相關(guān)信號(hào)通路提供有用工具。(4)本發(fā)明的構(gòu)建方法所需設(shè)備要求不高，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的理化性質(zhì)穩(wěn)定，在制 備、儲(chǔ)存和應(yīng)用過(guò)程中簡(jiǎn)單易行，適合推廣應(yīng)用。


圖1是白細(xì)胞介素6 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2是pSEB-3H逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒HinD III和BamH I雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3是pSEB-IL6重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒PCR鑒定圖。圖4是pSm-IL6重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒HinD III和BamH I雙酶切鑒定圖。圖5是pSEB-IL6重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒在PC12細(xì)胞中IL-6 mRNA表達(dá)水平變化圖。圖6是pSEB-IL6重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中IL_6 mRNA表達(dá)水平變化 圖。圖7是ELISA檢測(cè)PC12細(xì)胞中IL_6分泌蛋白水平變化圖。圖8是ELISA檢測(cè)HEK293細(xì)胞中IL-6分泌蛋白水平變化圖。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。所述的白細(xì)胞介素6基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法，步驟如下 步驟(1):白細(xì)胞介素6 (IL-6)基因片段的獲得。從原代培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為PCR擴(kuò)增 模板。Primer 5. 0設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增IL-6基因全長(zhǎng)的引物，并在上游5’端添加HinD III限 制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，下游3’端添加BamH I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；
上游引物 5’ -ATC AAGCTT ACCACCATGGGC ATGAAGTTTCTCTCCGC-3 ’ 上游引物 5’ -CGT GGATCC GGTTTGCCGAGTAGACCTCATAGTGAC-3， 利用Pfu高保真DNA聚合酶，通過(guò)touch-down PCR方式擴(kuò)增(94°C 2 min ；93°C 20s， 66 °C -56 °C 20s, 72 °C lmin，每一循環(huán)降低 1 °C，IOcycles ;93 °C 20s, 56 °C 20s, 72 °C lmin,28 cycles ；72°C 2min延伸)，獲得目的基因片段，經(jīng)1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳在600bp 附近有一條特異性電泳條帶(參見圖1)。步驟(2)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒pSEB-IL6質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定。將步驟(1)中獲得IL-6的PCR產(chǎn)物純化，再經(jīng)HinD III和BamHI (Takara公司)雙 酶切(50ul 體系2· 5μ 1 HinD 111,2. 5ul BamHI,5y 1 IOXK buffer, ？ 1 μ g DNA，37°C 過(guò) 夜)，再次純化后定向連接到同樣經(jīng)HinD III和BamHI酶切處理的逆轉(zhuǎn)錄病毒pSEB_3H質(zhì)粒 (參見圖2)，20ul連接體系10μ 1 Τ4 DNA連接酶(Takara公司)，8 μ 1 IL6基因PCR產(chǎn)物， 2μ 1雙酶切pSEB-3H質(zhì)粒，16°C過(guò)夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5 α中，在氨芐
5青霉素抗性平板上篩選，挑取最小陽(yáng)性單克隆，含氨芐青霉素(終濃度100μ g/ml)的LB培 養(yǎng)基中37°C 200rpm過(guò)夜培養(yǎng)，質(zhì)粒小抽試劑盒抽提質(zhì)粒，經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳可見約 7. Okb大小的電泳條帶。以此重組質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增(引物及條件同前)出600bp左右特異 性片斷(參見圖3)，同時(shí)該重組質(zhì)粒經(jīng)HinD III和BamHI雙酶切可見兩條帶，一條約7000bp， 另一條與上述PCR產(chǎn)物大小一致的條帶(參見圖4)，表明重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSEB-IL6質(zhì) 粒構(gòu)建成功，進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果見SEQ No. 1，與Genebank中NM_012589的OTs序列完全相 同。SEQ No. 1
atgaagtttctctccgcaagagacttccagccagttgccttcttgggactgatgttgttgacagccactgcc ttccctacttcacaagtccggagaggagacttcacagaggataccacccacaacagaccagtatataccacttcaca agtcggaggcttaattacatatgttctcagggagatcttggaaatgagaaaagagttgtgcaatggcaattctgatt gtatgaacagcgatgatgcactgtcagaaaacaatctgaaacttccagaaatacaaagaaatgatggatgcttccaa actggatataaccaggaaatttgcctattgaaaatctgctctggtcttctggagttccgtttctacctggagtttgt gaagaacaacttacaagataacaagaaagacaaagccagagtcattcagagcaatactgaaaccctagttcatatct tcaaacaagagataaaagactcatataaaatagtccttcctaccccaacttccaatgctctcctaatggagaagtta gagtcacagaaggagtggctaaggaccaagaccatccaactcatcttgaaagcacttgaagaatttctaaaggtcac tatgaggtctactcggcaaacc
步驟(3):重組逆轉(zhuǎn)錄病毒pSEB-IL6質(zhì)粒在大鼠PC12細(xì)胞及人胚腎HEK293細(xì)胞中的表達(dá)。為了鑒定本發(fā)明的功能，我們將實(shí)施例二中獲得的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒PSEB-IL6質(zhì) 粒分別轉(zhuǎn)染到兩種不同來(lái)源的真核細(xì)胞-大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞HEK293 中，觀察IL-6的表達(dá)狀態(tài)。在此過(guò)程中，為了排除逆轉(zhuǎn)錄病毒載體自身對(duì)IL-6表達(dá)的影 響，我們以轉(zhuǎn)染不含有目的基因的空載體作為IL-6過(guò)表達(dá)對(duì)照，并同時(shí)轉(zhuǎn)染來(lái)自于兩個(gè)不 同克隆的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒PSEB-IL6質(zhì)粒作為IL-6過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)組。當(dāng)PC12細(xì)胞或HEK293細(xì)胞達(dá)到60%融合時(shí)，通過(guò)lipofectamine2000試劑盒 (Invitrogen公司)將實(shí)施例二獲得的序列完全正確的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSEB-IL6質(zhì)粒 4 μ g或不含有目的基因片段的空載體分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和 轉(zhuǎn)染細(xì)胞。提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用特異性擴(kuò)增IL_6片段(158bp)的引物 (上游 5，ACAGCCACTGCCTTCCCTAC3，，
下游5’ TTGCCATTGCACAACTCTTTTC3’ )進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，重組逆 轉(zhuǎn)錄病毒載體PSEB-IL6質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染顯著提高PC12和HEK293細(xì)胞中IL6 mRNA的表達(dá)水平 (參見圖5和圖6)，與對(duì)照組相比，IL-6 mRNA表達(dá)水平增高1000-4000多倍。將收集的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清按照IL-6 ELISA試劑盒(R&D公司)中的操作流程進(jìn) 行IL-6分泌蛋白的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PSEB-IL6質(zhì)粒的細(xì)胞中 IL-6的分泌顯著高于對(duì)照組10-20倍(參見圖7和圖8)。上述結(jié)果提示，本發(fā)明成功構(gòu)建了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PSEB-IL6質(zhì)粒，并可在大 鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞HEK293等真核細(xì)胞中表達(dá)和分泌。
權(quán)利要求
白細(xì)胞介素6基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法，其步驟如下(1)白細(xì)胞介素6(IL 6)基因片段的擴(kuò)增；通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈反應(yīng)(RT PCR)方法，以大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞cDNA為模板，分別在上游引物的5’端和下游引物3’端設(shè)計(jì)HinDⅢ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)(斜體下劃線為酶切位點(diǎn))，即 上游引物5’ ATCAAGCTT ACCACCATGGGC ATGAAGTTTCTCTCCGC 3’上游引物5’ CGT GGATCC GGTTTGCCGAGTAGACCTCATAGTGAC 3’touch down PCR擴(kuò)增獲得IL 6目的基因片段rIL6；(2)重組pSEB rIL6逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定；采用pSEB逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng), 該系統(tǒng)具有組蛋白標(biāo)簽、hEFH啟動(dòng)子及開放讀碼框(ORP)；hEFH啟動(dòng)子可有效啟動(dòng)插入ORP中靶基因的高效表達(dá)，同時(shí)3組6個(gè)連續(xù)組蛋白可以作為檢測(cè)標(biāo)簽，反映ORP中插入靶基因的表達(dá)水平；將步驟(1)中所獲得的基因片段rIL6的PCR產(chǎn)物及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSEB 3H分別經(jīng)HinDⅢ和BamHⅠ雙酶切，連接轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH2a感受態(tài)菌中，通過(guò)氨芐青霉素篩選單克隆，獲得具有IL 6重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pSEB IL6，并進(jìn)行PCR、雙酶切及序列鑒定；(3)重組pSEB rIL6逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒在真核細(xì)胞中表達(dá)功能的測(cè)定；針對(duì)步驟(2)所獲得正確序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒pSEB IL6質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)應(yīng)用,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，將步驟(2)中所獲得的逆轉(zhuǎn)錄病毒pSEB IL6質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞HEK293中，mRNA水平和蛋白水平測(cè)定IL 6的表達(dá)水平。
全文摘要
本發(fā)明公開一種白細(xì)胞介素6基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法，其步驟如下(1)白細(xì)胞介素6(IL-6)基因片段的擴(kuò)增；(2)重組pSEB-rIL6逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定；(3)重組pSEB-rIL6逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒在真核細(xì)胞中表達(dá)功能的測(cè)定。本發(fā)明所構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒pSEB-IL6質(zhì)?？勺鳛檎婧吮磉_(dá)載體，能夠感染多種類型的細(xì)胞，既可以應(yīng)用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞，也可以用于整體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，應(yīng)用范圍廣，感染效率高；所采用的載體-逆轉(zhuǎn)錄病毒是改造后的一種安全的病毒，該載體不僅帶有組蛋白標(biāo)簽，實(shí)時(shí)檢測(cè)表達(dá)水平；而且可以整合入宿主細(xì)胞中，隨著細(xì)胞的不斷分裂而持續(xù)表達(dá)；構(gòu)建過(guò)程中所需設(shè)備要求不高，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的理化性質(zhì)穩(wěn)定，在制備、儲(chǔ)存和應(yīng)用過(guò)程中簡(jiǎn)單易行，適合推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101948863SQ20101028942
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月24日
發(fā)明者孫五慶, 張贇, 李廷玉, 畢楊, 陳潔, 魏小平, 龔敏 申請(qǐng)人:重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院