專利名稱：彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤分子病理分型方法及試劑盒和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血液腫瘤學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤分子病理分 型方法及試劑盒和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常見的非 霍奇金淋巴瘤，約占每年初發(fā)非霍奇金淋巴瘤的40%左右。我國目前非霍奇金淋巴瘤的發(fā) 病率約為3-4/10萬，并以每年2-3%的速度增長，其中彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)最為 常見，約占每年所有淋巴瘤的50%，因此，每年全國新發(fā)病例約為2-3萬。DLBCL具有顯著的生物學(xué)異質(zhì)性，病人對治療的反應(yīng)差異顯著，常規(guī)的CHOP聯(lián)合 化療方案(環(huán)磷酰氨、阿霉素、長春新堿和潑泥松)只能使約40%的患者獲得長期緩解。隨 著人-鼠嵌合性抗CD20單克隆抗體(利妥昔單抗，Rituximab)聯(lián)合化療(R-CHOP)的應(yīng)用， 進(jìn)一步提高DLBCL的臨床療效，但仍有30-40%的患者對治療無效或治療后迅速復(fù)發(fā)，疾病 進(jìn)展快，預(yù)后差。因此，加強(qiáng)DLBCL生物學(xué)特性的研究，制定相應(yīng)的治療方案成為目前DLBCL 的研究熱點。當(dāng)前臨床對DLBCL進(jìn)行危險分層，主要是通過國際預(yù)后指數(shù)(International Prognostic Index, IPI)，包括年齡，體力狀態(tài)，臨床Ann Arbor分期，節(jié)外病灶數(shù)目，乳酸 脫氫酶水平。由于這種評價只是臨床參數(shù)的組合，不能反映腫瘤發(fā)生過程中內(nèi)在的分子生 物學(xué)異質(zhì)性，因此對于相當(dāng)一部分病例的預(yù)后不能進(jìn)行準(zhǔn)確評價，一些被分在低危、低中危 組的病人5年生存率仍僅有32%。基因芯片技術(shù)的應(yīng)用為闡明DLBCL潛在的生物學(xué)異質(zhì)性提供了一個高通量平臺， 通過DLBCL基因表達(dá)譜分析，鑒別出了三種DLBCL亞型，提示腫瘤性B細(xì)胞處在不同的分 化階段一種稱為生發(fā)中心 B 細(xì)胞樣 DLBCL(germinal center B cell-like DLBCL, GCB)， 此亞型因與正常生發(fā)中心B細(xì)胞表達(dá)的基因標(biāo)志相同而得名；另一種亞型稱為活化B細(xì) 胞樣DLBCL (activated B cell-like DLBCL，ABC)，此亞型表達(dá)的基因型與促有絲分裂刺 激后外周血B細(xì)胞相似，GCB與ABC之間有數(shù)千基因表達(dá)差異。除以上兩型之外，仍有 17% -40%的DLBCL無法用細(xì)胞起源來分型，被統(tǒng)稱為3型(type3)，ABC和type3統(tǒng)稱為非 GCB(non-GCB)。DLBCL亞型是獨立于IPI的預(yù)后評價指標(biāo)，各亞型對傳統(tǒng)的聯(lián)合化療CHOP 方案的反應(yīng)性和療效各不相同，ABC和GCB的五年生存率分別為31%和59%，GCB的生存率 明顯好于ABC，而3型本身具有異質(zhì)性，無確定的生存率，但其總體預(yù)后情況與ABC亞型相 似。通過20例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤基因芯片表達(dá)譜分析，檢測到一些與彌漫大B細(xì) 胞淋巴瘤分子病理分型及預(yù)后相關(guān)的特定基因，如Bcl-2，Bcl-6, CCND2, MYC, SCYA3，F(xiàn)Nl, FOXP1, PKC-β，HGAL，⑶10，和MUMl等等。從中篩選出三個代表著B細(xì)胞分化不同階段的 基因⑶10，Bcl-6和MUM1，其中⑶10和Bcl_6為生發(fā)中心B細(xì)胞標(biāo)志，而MUMl為后生發(fā)中 心B細(xì)胞標(biāo)志。基因芯片技術(shù)加深了對DLBCL生物學(xué)特性的理解，但因其對標(biāo)本的要求較高(新鮮標(biāo)本、適宜的冷凍保存等)、操作復(fù)雜、且基因芯片檢測代價較高，故制約了 其臨床實用性。申請?zhí)枮?00710173600.8的發(fā)明專利申請是利用普通免疫組織化學(xué) (immunohistochemistry, IHC)的方法，對 DLBCL 標(biāo)本進(jìn)行 CD10、Bcl_6 和 MUMl 蛋白的表達(dá) 情況檢測，并通過結(jié)果分析對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行分子病理分型。但是，這種常規(guī)免疫 組化的方法基本上是通過顯色的手段來進(jìn)行結(jié)果判斷，三種指標(biāo)的檢測就意味著同一個樣 本最少需要三張切片，每張切片進(jìn)行一次免疫組化實驗，然后對三張切片的結(jié)果分別進(jìn)行 判讀。整個過程存在很多重復(fù)步驟，操作繁瑣、效率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決普通免疫組化方法對彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行分子病理分型時 操作繁瑣、效率低的技術(shù)問題，提供一種結(jié)合量子點技術(shù)的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤分子病 理分型方法，顯著提高了實驗的工作效率。此外，還需要提供一種彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤分子病理分型的試劑盒及其應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤分子病理分型方法，包 括以下步驟將三種不同波長的量子點標(biāo)記物作為熒光探針，檢測生物樣品中⑶10、Bcl-6和 MUMl蛋白的表達(dá)；依據(jù)檢測結(jié)果進(jìn)行分子病理分型，若CDlO (+)、或CDlO (_)/Bcl-6 (+)/MUMl (_)， 則表明該彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤為GCB型；若CDlO (-)/Bcl-6 (-)、或CDlO (-)/Bcl-6 (+)/ MUMl (+)，則表明該彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤為非GCB型。所述三種不同波長的量子點標(biāo)記物，用于分別標(biāo)記生物樣品中⑶10、Bcl-6和 MUMl蛋白，使得在同一張切片上能同時檢測該三種蛋白。優(yōu)選的，所述檢測通過免疫組織化學(xué)或組織芯片的方法實現(xiàn)。優(yōu)選的，免疫組織化學(xué)所用的三種單克隆抗體，其至少包括兩種不同種屬來源，即 在選擇該三種單克隆抗體時，至少選用兩種種屬來源的單克隆抗體進(jìn)行組合，例如三種單 克隆抗體兩種鼠源、一種兔源。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用于彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤分子病理分型的 試劑盒，所述試劑盒包含針對CDlO蛋白的特異性抗體及量子點標(biāo)記物；針對Bcl-6蛋白的特異性抗體及量子點標(biāo)記物；針對MUMl蛋白的特異性抗體及量子點標(biāo)記物。優(yōu)選的，所述針對CDlO蛋白、Bcl-6蛋白和MUMl蛋白的量子點具有不同的波長， 適于在同一張切片上同時檢測該三種蛋白。所述試劑盒采用免疫組織化學(xué)或組織芯片的方法對生物樣品進(jìn)行檢測。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述試劑盒的應(yīng)用，用于指導(dǎo)醫(yī)生對彌漫性 大B細(xì)胞淋巴瘤患者選擇適宜的治療方案，當(dāng)試劑盒的檢測結(jié)果是CDlO (+)、或CDlO (_)/Bcl-6 (+)/MUMl (-)時，表明該彌漫 性大B細(xì)胞淋巴瘤為GCB型，宜對彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者采用CHOP方案治療；
當(dāng)試劑盒的檢測結(jié)果是CDlO㈠/Bcl-6㈠、或CDlO㈠/Bcl_6⑴/MUMl (+)時，表 明該彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤為非GCB型，宜對彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者采用R-CHOP方案 治療。采取上述治療方案的選擇，是因為在以往研究中發(fā)現(xiàn)，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患 者采用傳統(tǒng)CHOP方案，GCB型患者預(yù)后明顯優(yōu)于非GCB型患者；采用R-CHOP方案治療，GCB 型患者與非GCB型患者預(yù)后無明顯差異；GCB型患者采用CHOP方案治療與采用R-CHOP方 案治療預(yù)后無明顯差異。因此，采用傳統(tǒng)的CHOP方案，GCB型患者預(yù)后優(yōu)于非GCB型患者； 利妥昔單抗(Rituximab)聯(lián)合化療(R-CH0P方案)可以使非GCB型患者受益，而并不能提 高GCB型患者的療效。利妥昔單抗每個療程治療費用為10-15萬元，對于國內(nèi)大部分患者來說是沉重經(jīng) 濟(jì)負(fù)擔(dān)。利用本發(fā)明試劑盒對彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者進(jìn)行分子病理分型后，選擇合理 的治療方案，有利于節(jié)約GCB型患者的醫(yī)療支出。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述試劑盒的應(yīng)用，用于對彌漫性大B細(xì)胞 淋巴瘤患者作預(yù)后評價。本發(fā)明彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤分子病理分型方法，具有以下有益效果(1)本發(fā)明將三種不同波長發(fā)射光的量子點應(yīng)用到⑶10、BCL6與MUMl的免疫組 化檢測中，在一張切片上進(jìn)行免疫組化實驗，同時完成三種指標(biāo)的檢測，顯著提高了實驗的
工作效率。(2)本發(fā)明解決了基因芯片技術(shù)在進(jìn)行DLBCL分型過程中對標(biāo)本要求高、操 作復(fù)雜、代價高的問題，具有很好的臨床實用性。使用基因芯片的檢測費用為每例患者 7000-9000元，而使用DLBCL分子病理分型診斷試劑盒檢測為每例患者200-300元，費用明 顯降低，且檢測效果相似、重復(fù)性好。(3)利妥昔單抗每個療程治療費用為10-15萬元，對于國內(nèi)大部分患者來說是沉 重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因為利妥昔單抗并不能提高GCB型患者的療效，故鑒定患者的分子病理分型 后，選擇合理的治療方案，有利于節(jié)約GCB型這部分患者的醫(yī)療支出。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1是本發(fā)明DLBCL免疫組化分子分型樹示意圖；圖2是本發(fā)明DLBCL量子點分子分型圖。
具體實施例方式下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物 學(xué)實驗指南》(F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編，馬學(xué)軍，舒躍龍的譯.北京 科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進(jìn)行。本發(fā)明是結(jié)合量子點技術(shù)的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤分子病理分型，提供了一種 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤分子病理分型的量子點免疫組化檢測方法，其原理是不同大小的 量子點能被單一波長的光激發(fā)而發(fā)出不同顏色的光，且光化學(xué)穩(wěn)定性高，適于用作熒光探 針。本發(fā)明采用三種不同粒徑大小的量子點(同一波長的光激發(fā)時能發(fā)出三種不同波長的光)，分別標(biāo)記生物樣品中⑶10、Bcl-6和MUMl蛋白，通常這種標(biāo)記是間接標(biāo)記，如量子點 標(biāo)記物與特異抗體結(jié)合，特異抗體與生物樣品中CD10、Bcl-6或MUMl抗原蛋白結(jié)合。間接 標(biāo)記也可以是量子點標(biāo)記物與二抗結(jié)合，二抗與單克隆抗體(特異一抗)結(jié)合，單克隆抗體 與生物樣品中⑶10、Bcl-6或MUMl抗原蛋白結(jié)合，即形成“抗原-單克隆抗體-二抗-量 子點標(biāo)記物”，在這種情況下，所用的三種單克隆抗體，至少選用兩種種屬來源的單克隆抗 體進(jìn)行組合。在本發(fā)明實施例中，針對需要檢測的三個指標(biāo)，其分別分布在細(xì)胞膜(CDlO)、細(xì) 胞核(BCL6、MUM1)中，因此選擇兩種鼠源的單克隆抗體(CD10、MUM1)與兔源的單克隆抗 體(BCL-6)進(jìn)行組合，將量子點標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物(QDs-SA)作為量子點標(biāo)記物，該 QDs-SA能與生物素化二抗相結(jié)合，當(dāng)特異一抗與相應(yīng)靶抗原結(jié)合后，生物素化二抗與特異 一抗結(jié)合，最后形成“抗原-特異一抗-生物素化二抗-QDs-SA”。本發(fā)明采用量子點標(biāo)記 物作為熒光探針，能在同一切片上同時檢測⑶10、Bcl-6和MUMl三種蛋白的表達(dá)情況，與普 通免疫組化方法相比，效率明顯提高，有利于為彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者及時給出合理 的治療方案。實施例1彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤量子點免疫組化檢測1.標(biāo)本收集DLBCL標(biāo)本均以10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色， 由專門從事淋巴瘤研究的醫(yī)生按新的WHO分類診斷。2.標(biāo)本處理將已在烤箱中干燥過的石蠟切片浸于二甲苯中15分鐘，二次。取出切片置于 100%無水乙醇中10分鐘兩次；依次置入90% -70%各級酒精各10分鐘。取出置于蒸餾水 中。取出蒸餾水中的切片，甩掉并擦干切片上組織周圍的液體，平放于濕盒中，滴加過氧化 物酶阻斷劑-3%甲醇-H2O2于組織上避光孵育20分鐘。蒸餾水沖洗，再將切片置入TBS緩 沖液中，浸泡5分鐘，三次。取出切片，甩掉并擦干組織周圍的液體，平放于濕盒中。醫(yī)用微波爐抗原修復(fù)20分鐘，取出后自然冷卻30分鐘，抗原修復(fù)液選用Tris/ EDTA(50mMTris,2mM EDTA,PH9.0)。1 %牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉20分鐘。3.量子點免疫組織化學(xué)檢測針對需要檢測的三個指標(biāo)，其分別分布在細(xì)胞膜(CDlO)、細(xì)胞核(BCL6、MUM1)中， 因此選擇兩種鼠源的單克隆抗體(⑶10、MUM1)與兔源的單克隆抗體(BCL-6)進(jìn)行組合。滴加用抗體稀釋液稀釋的一抗(⑶10和BCL6混合液)，37°C濕盒孵育2hr轉(zhuǎn)4°C 過夜；TBS-T洗滌(3 X 5min)，滴加封閉緩沖液，37°C濕盒孵育封閉IOmin ；滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化羊抗兔IgG，37°C濕盒孵育30min ；TBS-T洗滌(3 X 5min)，滴加封閉緩沖液，37°C濕盒孵育封閉20min ；滴加用抗體稀釋液稀釋的由量子點(quantum dots, QDs)標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合 物(QDs-SA，545nm)和由量子點(QDs)標(biāo)記的二抗(QDs_G/M IgG，605nm，購自武漢珈源量子 點技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司)37°C孵育Ihr ；TBS-T洗滌(3 X 5min)，滴加封閉緩沖液，37°C濕盒孵育封閉IOmin ；
滴加用試劑C稀釋的MUM1，37°C濕盒孵育2hr ；TBS-T洗滌(3 X 5min)，滴加封閉緩沖液，37°C濕盒孵育封閉IOmin ；滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化馬抗鼠IgG，37°C濕盒孵育30min ；TBS-T洗滌(3 X 5min)，滴加封閉緩沖液，37°C濕盒孵育封閉20min ；滴加用抗體稀釋液稀釋的量子點標(biāo)記鏈霉親和素復(fù)合物(QDs-SA，705nm) 37°C濕 盒孵育30min ；TBS-T洗滌(3X5min)，TBS洗滌(2X5min)；緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下紫外光 激發(fā)觀察成像。4.結(jié)果判定與分析⑶10陽性定位于細(xì)胞膜，Bcl-6、MUM1陽性定位于細(xì)胞核，大于30%的腫瘤細(xì)胞著 色判為陽性。實施例1病理切片量子點檢測結(jié)果是50例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤標(biāo)本中，⑶10、 Bcl-6、MUM1 的陽性率分別為 34%,34%,56%05.彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤分子分型(免疫組化法)及病理切片分子分型結(jié)果CD10、Bcl-6作為生發(fā)中心細(xì)胞來源的標(biāo)志物，CDlO (+)或CDlO (-)/Bcl_6 (+)/ MUMl (-)，為GCB類；CDlO (-) /Bcl-6 (-)，為非GCB類。MUMl作為后生發(fā)中心細(xì)胞來源的標(biāo)志 物，若 CDlO (-) /Bcl-6 (+)，則以 MUMl 來分類MUM1 (+)為非 GCB 類，MUMl (-)為 GCB 類(見 圖 1)，即 CDlO (-)/Bcl-6 (+)/MUMl (+)為非 GCB 類，CDlO (-)/Bcl_6 (+)/MUMl (-)為 GCB 類。簡而言之，當(dāng)⑶10⑴、或⑶10㈠/Bcl-6⑴/MUMl㈠，則表明該彌漫大B細(xì)胞淋 巴瘤為GCB類；當(dāng)CDlO (-) /Bcl-6㈠、或CDlO㈠/Bcl-6 (+) /MUMl (+)，則表明該彌漫大B細(xì) 胞淋巴瘤為非GCB類。DLBCL量子點分子分型圖像如圖2所示。實施例1病理切片分子分型結(jié)果如下總的50例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤標(biāo)本中，GCB18例(36% ),非GCB32例(64% )。在 18 例 GCB 中，17 例(94. 4% )CD10(+)，1 例(5. 6% ) CDlO (-)/Bcl_6 (+)/MUMl (-)。在 32 例 非 GCB 中，12 例(27.5% ) CDlO (-)/Bcl_6 (-)/MUMl (+)，7 例(21.9% ) CDlO (-)/Bcl_6 (+) / MUMl (+)，13 例(40. 6% ) CDlO (-) /Bcl-6 (-) /MUMl (-)。實施例2組織芯片彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤量子點免疫組化檢測1.標(biāo)本處理脫蠟前將組織芯片放在60恒溫箱中烘烤30分鐘；置于二甲苯I中浸泡10分鐘， 在二甲苯II中浸泡10分鐘，在二甲苯III中浸泡10分鐘，在二甲苯IV中浸泡10分鐘；無 水乙醇I中浸泡5分鐘，在無水乙醇II中再浸泡5分鐘；95%乙醇中浸泡5分鐘；85%乙醇 中浸泡5分鐘；70%乙醇中浸泡5分鐘；蒸餾水中浸泡5分鐘?？乖瓱嵝迯?fù)取一定量的0. OlM檸檬酸鹽緩沖液pH6. 0于壓力鍋中大火加熱至沸騰，將脫蠟水 化后的組織芯片置于耐高溫塑料切片架上放入已沸騰的緩沖液中，蓋上鍋蓋扣上壓力閥繼 續(xù)加熱至噴氣，從噴氣開始計時1-2分鐘后將壓力鍋離開熱源冷卻至室溫，取出玻片先用 蒸餾水洗兩次后用PBS洗5分鐘。2.量子點免疫組織化學(xué)檢測
針對需要檢測的三個指標(biāo)，其分別分布在細(xì)胞膜(CDlO)、細(xì)胞核(BCL6、MUM1)中， 因此選擇兩種鼠源的單克隆抗體(⑶10、MUM1)與兔源的單克隆抗體(BCL-6)進(jìn)行組合。滴加用抗體稀釋液稀釋的一抗(⑶10和BCL6混合液)，37°C濕盒孵育2hr轉(zhuǎn)4°C 過夜；TBS-T洗滌(3 X 5min)，滴加封閉緩沖液，37°C濕盒孵育封閉IOmin ；滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化羊抗兔IgG，37°C濕盒孵育30min ；TBS-T洗滌(3 X 5min)，滴加封閉緩沖液，37°C濕盒孵育封閉20min ；滴加用抗體稀釋液稀釋的量子點(QDs)標(biāo)記鏈霉親和素復(fù)合物(QDs-SA，545nm) 和量子點(QDs)標(biāo)記二抗(QDs-G/M IgG，605nm)37°C孵育 Ihr ；TBS-T洗滌(3 X 5min)，滴加封閉緩沖液，37°C濕盒孵育封閉IOmin ；滴加用試劑C稀釋的MUM1，37°C濕盒孵育2hr ；TBS-T洗滌(3 X 5min)，滴加封閉緩沖液，37°C濕盒孵育封閉IOmin ；滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化馬抗鼠IgG，37°C濕盒孵育30min ；TBS-T洗滌(3 X 5min)，滴加封閉緩沖液，37°C濕盒孵育封閉20min ；滴加用抗體稀釋液稀釋的量子點標(biāo)記鏈霉親和素復(fù)合物(QDs-SA，705nm) 37°C濕 盒孵育30min ；TBS-T洗滌(3X5min)，TBS洗滌(2X5min)；緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下紫外光 激發(fā)觀察成像。3.結(jié)果判定與分析⑶10陽性定位于細(xì)胞膜，Bcl-6、MUM1陽性定位于細(xì)胞核，大于30%的腫瘤細(xì)胞著 色判為陽性。實施例2組織芯片量子點檢測結(jié)果是組織芯片上共計30例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤標(biāo)本，其中1例掉片，⑶10(15)、 Bcl-6 (8), MUMl (15)的陽性率分別為 51. 7%,27. 6%,51. 7%04.組織芯片分子分型結(jié)果總的30例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤標(biāo)本中，GCB17例(58. 6% )，非GCB12例(41.4%)。 在 17 例 GCB 中，15 例(88. 2% ) CDlO (+)，2 例(11. 8% ) CDlO (-) /Bcl-6 (+) /MUMl (-)。在 12 例非 GCB 中，8 例(66. 7% ) CDlO (-) /Bcl-6 (-) /MUMl (+)，4 例(33. 3% ) CDlO (-) /Bcl-6 (-) / MUMl(-)。以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能 因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說， 在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一種彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤分子病理分型方法，其特征在于，包括以下步驟將三種不同波長的量子點標(biāo)記物作為熒光探針，檢測生物樣品中CD10、Bcl 6和MUM1蛋白的表達(dá)；依據(jù)檢測結(jié)果進(jìn)行分子病理分型，若CD10(+)、或CD10( )/Bcl 6(+)/MUM1( )，則表明該彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤為GCB型；若CD10( )/Bcl 6( )、或CD10( )/Bcl 6(+)/MUM1(+)，則表明該彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤為非GCB型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測通過免疫組織化學(xué)或組織芯片 的方法實現(xiàn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，免疫組織化學(xué)所用的三種單克隆抗體，其 至少包括兩種不同種屬來源。
4.一種用于彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤分子病理分型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒 包含針對CDlO蛋白的特異性抗體及量子點標(biāo)記物；針對Bcl-6蛋白的特異性抗體及量子點標(biāo)記物；針對MUMl蛋白的特異性抗體及量子點標(biāo)記物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述針對CDlO蛋白、Bcl-6蛋白和MUMl 蛋白的量子點具有不同的波長，適于在同一張切片上同時檢測該三種蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒采用免疫組織化學(xué)或組 織芯片的方法對生物樣品進(jìn)行檢測。
7.權(quán)利要求4所述試劑盒的應(yīng)用，其特征在于，用于指導(dǎo)醫(yī)生對彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤 患者選擇適宜的治療方案，當(dāng)⑶10 (+)、或⑶10 (-) /Bcl-6 (+) /MUMl (-)時，宜對彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者采用 CHOP方案治療；當(dāng) CDlO (-) /Bcl-6 (-)、或 CDlO (-) /Bcl-6 (+) /MUMl (+)時，宜對彌漫性大 B 細(xì)胞淋巴瘤 患者采用R-CHOP方案治療。
8.權(quán)利要求4所述試劑盒的應(yīng)用，其特征在于，用于對彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者作預(yù) 后評價。
全文摘要
本發(fā)明公開一種彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤分子病理分型方法，將三種不同波長的量子點標(biāo)記物作為熒光探針，檢測生物樣品中CD10、Bcl-6和MUM1蛋白的表達(dá)。本發(fā)明還公開了用于彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤分子病理分型的試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤分子病理分型方法，顯著提高了工作效率，且對彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者采取合理的治療方案，有利于節(jié)省醫(yī)療費用。
文檔編號G01N33/68GK101968491SQ20101029647
公開日2011年2月9日 申請日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月29日
發(fā)明者宋凱, 張慶華, 李軍民 申請人:上海生物芯片有限公司;上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院