專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種用高效液相色譜-熒光法同時(shí)測(cè)定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域。涉及一種色譜檢測(cè)的方法，具體涉及高效液相色譜熒光法同時(shí)測(cè)定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法，即利用在線(xiàn)衍生、可調(diào)波長(zhǎng)的高效液相色譜熒光法同時(shí)測(cè)定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法。
背景技術(shù)：
：色氨酸(tryptophan,Trp)是人體必需的氨基酸之一。攝入體內(nèi)的Trp主要經(jīng)犬尿氨酸(ky皿renine，Kyn)途徑代謝即Trp在色氨酸2，3雙加氧酶(L-tryptophan2，3-dioxygenase，TD0)或噴哚胺2，3雙加氧酶(indoleamine2，3-dioxygenase，ID0)的作用下生成甲酰犬尿氨酸，后者迅速在犬尿氨酸甲酰胺酶的作用下生成Kyn，Kyn在犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的作用下進(jìn)一步生成犬尿喹啉酸(ky皿renicacid，Kyna)。高效液相色譜法(HPLC)技術(shù)作為一種集分離和測(cè)定于一體的分析技術(shù)，具有良好的敏感性和特異性，是測(cè)定色氨酸(Trp)、犬尿氨酸(Kyn)和犬尿喹啉酸(Kyna)最常用的方法，根據(jù)聯(lián)用的檢測(cè)器不同又分為高效液相色譜熒光法(HPLC-FD)、高效液相色譜_電化學(xué)法(HPLC-EC)和高效液相色譜紫外法(HPLC-UV)。色氨酸具有吲哚結(jié)構(gòu)，自身能產(chǎn)生熒光，故可采用熒光法檢測(cè)；犬尿氨酸自身不能產(chǎn)生熒光，但可吸收一定波長(zhǎng)的紫外線(xiàn)，故多采用高效液相色譜紫外法的方法，同時(shí)國(guó)外有學(xué)者采用柱前熒光衍生或柱后光化學(xué)衍生處理的高效液相色譜熒光法檢測(cè)；而Kyna雖具有天然熒光的特性，但在人體液中的含量極低，在國(guó)外建立的高效液相色譜熒光法中采用柱前或柱后熒光衍生的方法。國(guó)外報(bào)道同時(shí)檢測(cè)色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法需聯(lián)合應(yīng)用紫外和熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)。而目前國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)采用高效液相色譜熒光法同時(shí)測(cè)定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用高效液相色譜熒光法同時(shí)測(cè)定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法，醋酸鋅在線(xiàn)衍生增強(qiáng)所測(cè)物質(zhì)熒光，可調(diào)波長(zhǎng)使所測(cè)物質(zhì)均在其最佳波長(zhǎng)下檢測(cè)，從而使測(cè)定真實(shí)準(zhǔn)確，方法操作簡(jiǎn)單，分離快速，無(wú)需柱前柱后衍生，靈敏度高。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為—種用高效液相色譜熒光法同時(shí)測(cè)定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法，包括以下步驟a、采用HypersilC18250mmX4.6mmi.d，7iim色i普柱；b、流動(dòng)相的組成每升流動(dòng)相中含醋酸鋅0.2mol、醋酸8.3mmo1和2.5v/v^的乙腈；(利用醋酸鋅增強(qiáng)三種物質(zhì)的熒光，用醋酸調(diào)整衍生反應(yīng)的最佳pH值，使三種物質(zhì)在線(xiàn)衍生的熒光測(cè)定真實(shí)準(zhǔn)確)；c、流速為1.5ml/min，進(jìn)樣量:20iU，柱溫25。C;d、利用熒光檢測(cè)器掃描確定三種物質(zhì)的最佳吸收波長(zhǎng)，進(jìn)而采用可調(diào)波長(zhǎng)使得三種物質(zhì)均在其最佳波長(zhǎng)下得到檢測(cè)；可調(diào)波長(zhǎng)設(shè)定為0-llmin激發(fā)光波長(zhǎng)365nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為480nm;11-15.5min激發(fā)光波長(zhǎng)344nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為404nm;15.5_20min激發(fā)光波長(zhǎng)254nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為404nm;e、分別配制色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)液；f、混合標(biāo)準(zhǔn)品和血清樣品的檢測(cè)；色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制采用0.312mol/L高氯酸溶液溶解和稀釋?zhuān)⒂贸兯渲瞥苫旌蠘?biāo)準(zhǔn)液。血清樣品的處理過(guò)程為取200iU血清樣品于印pendorf管內(nèi)，加入等量0.624mol/L高氯酸溶液，加蓋后于旋渦混勻器上混勻，室溫下放置10min，以充分沉淀血清中的蛋白質(zhì)，4。C，10000r/min離心10min后取上清液20yl進(jìn)樣分析。g、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、定性定量方法、精密度的評(píng)價(jià)、回收率的考察和干擾試驗(yàn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下1、本發(fā)明首次應(yīng)用在線(xiàn)衍生、可調(diào)波長(zhǎng)的高效液相色譜熒光法，同時(shí)測(cè)定待測(cè)樣品中的色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸。2、本發(fā)明測(cè)定真實(shí)準(zhǔn)確，方法操作簡(jiǎn)單，分離快速，無(wú)需柱前柱后衍生，靈敏度高。3、本發(fā)明經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)，摸索出一套最佳的能同時(shí)測(cè)定待測(cè)樣品中色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的條件，包括流動(dòng)相成分，pH值、流速、進(jìn)樣量、柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)等等。4、線(xiàn)性試驗(yàn)及檢測(cè)限試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，三種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性關(guān)系良好(r2>0.990)，線(xiàn)性范圍寬；在該方法下三種物質(zhì)的檢測(cè)限(L0D，S/N=3)低，靈敏度高。5、本發(fā)明測(cè)定血清樣本中三種物質(zhì)的加標(biāo)回收率的平均值為犬尿氨酸為97.45%，犬尿喹啉酸為100.6%，色氨酸為103.71%，日內(nèi)和日間的精密度均小于5%，苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、5-羥色胺(5-HT)和肌酐(Cr)對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。圖1為混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖；峰序號(hào)Kyn-犬尿氨酸，Kyna-犬尿喹啉酸，Trp-色氨酸；圖2為本發(fā)明測(cè)定的血清樣本的色譜圖；峰序號(hào)Kyn-犬尿氨酸，Kyna-犬尿喹啉酸，Trp-色氨酸；圖3為Kyn的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；圖4為Kyna的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；圖5為T(mén)rp的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施方式和實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而不會(huì)限制本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)的范圍。主要實(shí)驗(yàn)儀器及色譜條件Waters510色譜泵，Waters2475型熒光檢測(cè)器，Rheodyne7725手動(dòng)進(jìn)樣器，色譜分離系統(tǒng)的控制和記錄由HS2000色譜數(shù)據(jù)工作站完成。色譜柱選用的是HypersilC18250mmX4.6mmi.d.，7ym色譜柱，流動(dòng)相每升流動(dòng)相中含醋酸鋅0.2mol、醋酸8.3,1和2.5v/v^的乙腈，流速1.5ml/min;進(jìn)樣量:20iU，柱溫25。C，可調(diào)波長(zhǎng)設(shè)定為0-llmin激發(fā)光波長(zhǎng)365nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為480nm;11-15.5min激發(fā)光波長(zhǎng)344nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為404nm;15.5-20min激發(fā)光波長(zhǎng)254nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為404nm。主要試劑Kyn、Trp、5-羥色胺(5-HT)、犬尿喹啉酸(Kyna)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和肌酐(Cr)均購(gòu)自Sigma公司；乙腈、甲醇均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Tedia公司；醋酸鋅、冰醋酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純，高氯酸為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純。實(shí)施例1—、色譜條件的建立及標(biāo)準(zhǔn)液的配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱(chēng)取TrplOO.Omg、Kynl08.Omg和Kyna99.Omg，用0.312mol/L的高氯酸溶液溶解并稀釋至100ml，混勻，分別制成4900iimol/LTrp、1960iimol/LKyn禾口104.67iimo1/LKyna的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分裝后置于-2(TC冰箱中備用。使用前取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液加超純水配成混合標(biāo)準(zhǔn)液(含Kyn0.98iimol/L，Kyna26.17nmol/L和Trp24.5iimol/L)。二、高效液相色譜條件的選擇1、檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇采用手動(dòng)停流技術(shù)，通過(guò)對(duì)Kyn、Kyna和Trp的激發(fā)光波譜(范圍200-450nm)和發(fā)射光波譜(范圍300-550nm)掃描分別得到最大激發(fā)光波長(zhǎng)AeXftp=269nm，AexKyn=365nm，入exKyna=344nm;最大發(fā)身寸光波長(zhǎng)入emTrp=341nm，入emKyn=480nm，入emKyna=404nm。Kyn的最大激發(fā)光波長(zhǎng)和最大發(fā)射光波長(zhǎng)分別為Aex=365nm、Aem=480nm。Kyna的最大激發(fā)光波長(zhǎng)和最大發(fā)射光波長(zhǎng)分別為Aex=344nm、Aem=404nm。但當(dāng)Trp選用激發(fā)光波長(zhǎng)為269nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為341nm時(shí)，Trp的最高檢測(cè)限約為48iimol/L，不適合常規(guī)檢測(cè)。而采用激發(fā)光波長(zhǎng)為254nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為404nm時(shí)，檢測(cè)限上限較高，線(xiàn)性范圍較寬，干擾少，滿(mǎn)足常規(guī)分析。2、流動(dòng)相中有機(jī)物的比例對(duì)保留時(shí)間的影響配制不同乙腈含量(1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%)的流動(dòng)相，以標(biāo)準(zhǔn)液作為樣品進(jìn)行分析。隨著乙腈含量的增加，Kyn、Kyna、Trp的峰保留時(shí)間相應(yīng)縮短，且kyn、Kyna、Trp峰面積響應(yīng)值也相應(yīng)的增大；但當(dāng)乙腈含量達(dá)到3%時(shí)，Kyn和Kyna峰的半峰寬增大；Trp峰與后面的雜峰相融合，影響定量的準(zhǔn)確性。而且隨著乙腈含量的增加，Kyn和Kyna的越來(lái)越近，互相干擾，綜合考慮以上因素，本實(shí)驗(yàn)采用乙睛含量為2.5%的流動(dòng)相。3、流速對(duì)分離效果的影響分另U選用流速0.9ml/min，lml/min，1.3ml/min，1.5ml/min，1.7ml/min，1.9ml/min，2.lml/min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)表明隨流速加快Kyn、Kyna、Trp的保留時(shí)間明顯縮短，峰面積響應(yīng)值相應(yīng)的減小，色譜系統(tǒng)的后壓加大。綜合考慮分析時(shí)間和響應(yīng)值，本實(shí)驗(yàn)采用流速為1.5ml/min。4、醋酸鋅濃度的影響5醋酸鋅不但可以增加離子強(qiáng)度，還可以增強(qiáng)三種物質(zhì)的熒光強(qiáng)度。配制含有不同濃度醋酸鋅(0mol/ml、0.lmol/ml、0.15mol/L、0.2mol/ml、0.25mol/L、0.30mol/L)的流動(dòng)相，取含Kyn(0.98iimol/L)、Kyna(26.17nmol/L)、Trp(24.5iimol/L)的混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中不含有醋酸鋅時(shí)，Kyna的熒光非常弱，幾乎檢測(cè)不到。隨醋酸鋅濃度的增加，Kyn、Kyna的峰面積隨之增大。而Trp在醋酸鋅濃度達(dá)到0.2mol/L后峰面積基本不變?？紤]到醋酸鋅溶解度較小，當(dāng)醋酸鋅濃度達(dá)到0.3mol/L時(shí)，容易形成微小的結(jié)晶，對(duì)實(shí)驗(yàn)不利；而當(dāng)其濃度為0.25mol/L時(shí)，會(huì)有其它物質(zhì)干擾Trp峰，因此綜合考慮選用含0.2mol/L醋酸鋅的流動(dòng)相。5、柱溫對(duì)分離效果的影響將柱溫恒定于25、30、35、40、45°C進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三種物質(zhì)的保留時(shí)間的變化并不明顯，而當(dāng)溫度升高時(shí)，分子間的碰撞頻率增加，非輻射能量轉(zhuǎn)移過(guò)程增加，三種物質(zhì)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度降低，故柱溫25t:時(shí)三種物質(zhì)的峰面積最大，因此選擇25t:較為理術(shù)巨6、pH值對(duì)分離效果影響流動(dòng)相的pH值能影響物質(zhì)的熒光效應(yīng)和被分析物質(zhì)的分離效果。因此，本實(shí)驗(yàn)用冰醋酸對(duì)流動(dòng)相pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，在pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5時(shí)對(duì)三種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)液及混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行分析，以確定最佳的pH值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著ra值的升高，三種物質(zhì)的峰面積也相應(yīng)的增大；pH4.5、5.0、5.5、6.0時(shí)混合標(biāo)準(zhǔn)液中三者的色譜峰不能完全分離開(kāi)，p朋.5時(shí)，三者分離良好。實(shí)施例2樣品的檢測(cè)1、混合標(biāo)準(zhǔn)液的檢測(cè)取上述配制的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液加超純水配成混合標(biāo)準(zhǔn)液(含Kyn0.98iimol/L，Kyna26.17nmol/L和Trp24.5ymol/L)進(jìn)行分析。高效液相色譜條件色譜柱選用的是HypersilC18250mmX4.6mmi.d.，7ym色譜柱，流動(dòng)相每升流動(dòng)相中含醋酸鋅O.2mol、醋酸8.3,1和2.5v/v^的乙腈，流速1.5ml/min;進(jìn)樣量20iU，柱溫25。C，可調(diào)波長(zhǎng)設(shè)定為0-llmin激發(fā)光波長(zhǎng)365nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為480nm;11-15.5min激發(fā)光波長(zhǎng)344nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為404nm;15.5-20min激發(fā)光波長(zhǎng)254nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為404nm(圖1)。2、血清樣品的檢測(cè)取200iU血清樣品于印pendorf管內(nèi)，加入等量5%高氯酸溶液，加蓋后于旋渦混勻器上混勻，室溫下放置10min以充分沉淀血清中的蛋白質(zhì)，離心10min(10000r/min，4°C)后將上清液轉(zhuǎn)入另一Eppendorf管內(nèi)，相同條件下再離心5min，取上清液20iil進(jìn)樣分析(圖2)。高效液相色譜條件色譜柱選用的是HypersilC18250mmX4.6mmi.d.，7iim色譜柱，流動(dòng)相每升流動(dòng)相中含醋酸鋅O.2mol、醋酸8.3mmo1和2.5v/v^的乙腈，流速1.5ml/min;進(jìn)樣量20iU，柱溫25°C，可調(diào)波長(zhǎng)設(shè)定為0-llmin激發(fā)光波長(zhǎng)365nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為480nm;11-15.5min激發(fā)光波長(zhǎng)344nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為404nm;15.5-20min激發(fā)光波長(zhǎng)254nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為404nm。3、定性定量分析Kyn、Kyna和Trp均采用峰保留值比較法和疊加法進(jìn)行定性分析，即比對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)液和血清樣品在相同條件下的色譜峰和相對(duì)保留時(shí)間；在血清樣品中分別加入適量的各種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，比較相同色譜條件下不加標(biāo)準(zhǔn)品及加標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果表明，在血清樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)品前后，三種物質(zhì)的出峰位置是一致的。用外標(biāo)法測(cè)定峰面積進(jìn)行定量分析。即在相同色譜條件下測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)品和血清樣品，把混合標(biāo)準(zhǔn)品中三種物質(zhì)的色譜峰面積和血清樣品中三種物質(zhì)的色譜峰面積進(jìn)行比較求得血清樣品中三種物質(zhì)的含量。用公式表示為血清Kyn(Kyna或Trp)濃度=;《^2注Au=血清中Kyn(Kyna或Trp)峰面積As=混合標(biāo)準(zhǔn)液中Kyn(Kyna或Trp)峰面積Cs=混合標(biāo)準(zhǔn)液中Kyn(Kyna或Trp)濃度計(jì)算得上述血清樣品Kyn濃度為1.76ymol/L，Kyna的濃度為30.22nmol/L，Trp的濃度為45.26iimol/L。4、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作配制一系列濃度的Kyn、Kyna和Trp的混合液標(biāo)準(zhǔn)液，每個(gè)樣品進(jìn)樣3次，取其平均值用最小二乘法進(jìn)行相關(guān)與回歸分析。得出Kyn的線(xiàn)性范圍是0.049-98yrno1/L，回歸方程為Y=2638+173834X，相關(guān)系數(shù)r2=0.999(圖3);Kyna的線(xiàn)性范圍是1.050-1047nmol/L，回歸方程為:Y=1864+65087X，相關(guān)系數(shù)r2=0.997(圖4);Trp的線(xiàn)性范圍是O.610-196iimol/L，回歸方程為:Y=1890+124215X，相關(guān)系數(shù)r2=0.999(圖5)。當(dāng)信噪比S/N=3時(shí)，測(cè)得Kyn，Kyna和Trp的最低檢測(cè)限分別為0.025iimol/L，0.050翻1/L禾口0.005iimol/L。5、精密度的評(píng)價(jià)取血清樣本進(jìn)行日內(nèi)和日間精密度實(shí)驗(yàn)。日內(nèi)精密度同一個(gè)樣本一天內(nèi)連續(xù)測(cè)定20次；日間精密度同一個(gè)樣本一天測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定20天。三者的日內(nèi)和日間精密度均小于5%，如表l所示。表1Kyn、Kyna和Trp的日間和日內(nèi)精密度<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>6、加標(biāo)回收率試驗(yàn)血清樣品1.6ml分為4組，第1組加入0.lml超純水作為基礎(chǔ)樣品，第2、3、4組分別加入高、中、低三種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液0.lml，每組平行測(cè)定三次，取其平均值計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。表2Kyn、Kyna和Trp的加標(biāo)回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>7、干擾試驗(yàn)用超純水配制610.0iimol/L苯丙氨酸(Phe)、550.0iimol/L酪氨酸(Tyr)、98.5iimol/L5-羥色胺(5-HT)和375.5ymol/L肌酐(Cr)的標(biāo)準(zhǔn)液，先分別進(jìn)樣分析，再配制成混合樣本進(jìn)樣分析。在本發(fā)明的色譜條件下，上述濃度的Phe、Tyr和5_HT對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)表3。表3干擾試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注-代表未檢測(cè)出。權(quán)利要求一種用高效液相色譜熒光法同時(shí)測(cè)定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟a、采用HypersilC18250mm×4.6mmi.d，7μm色譜柱；b、流動(dòng)相的配制每升流動(dòng)相中含醋酸鋅0.2mol、醋酸8.3mmol和2.5v/v％的乙腈；c、流速為1.5ml/min，進(jìn)樣量20μl，柱溫25℃；d、可調(diào)波長(zhǎng)的設(shè)定為0-11min激發(fā)光波長(zhǎng)365nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為480nm；11-15.5min激發(fā)光波長(zhǎng)344nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為404nm；15.5-20min激發(fā)光波長(zhǎng)254nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為404nm2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用高效液相色譜熒光法同時(shí)測(cè)定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法，其特征在于，血清樣品的處理過(guò)程為取200iil血清樣品于印pendorf管內(nèi)，加入等量0.624mol/L高氯酸溶液，加蓋后于旋渦混勻器上混勻，室溫下放置10min，以充分沉淀血清中的蛋白質(zhì)，4t:，10000r/min離心10min后取上清液20yl進(jìn)樣分析。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用高效液相色譜熒光法同時(shí)測(cè)定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法，其特征在于，色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制采用0.312mol/L高氯酸溶液溶解和稀釋?zhuān)⒂贸兯渲瞥苫旌蠘?biāo)準(zhǔn)液。全文摘要本發(fā)明涉及一種用高效液相色譜-熒光法同時(shí)測(cè)定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法。步驟包括a、采用HypersilC18250mm×4.6mmi.d，7μm色譜柱；b、每升流動(dòng)相中含醋酸鋅0.2mol、醋酸8.3mmol和2.5v/v％的乙腈；c、流速為1.5ml/min，進(jìn)樣量20μl，柱溫25℃；d、可調(diào)波長(zhǎng)的設(shè)定為0-11min激發(fā)光波長(zhǎng)365nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為480nm；11-15.5min激發(fā)光波長(zhǎng)344nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為404nm；15.5-20min激發(fā)光波長(zhǎng)254nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為404nm條件下檢測(cè)。方法操作簡(jiǎn)單，分離快速，無(wú)需柱前柱后衍生，靈敏度高，結(jié)果真實(shí)準(zhǔn)確，能同時(shí)測(cè)定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸。文檔編號(hào)G01N30/06GK101776662SQ20101030036公開(kāi)日2010年7月14日申請(qǐng)日期2010年1月15日優(yōu)先權(quán)日2010年1月15日發(fā)明者任亞萍,周前選,唐愛(ài)國(guó),皮蘭敢,羅昔波,肖樂(lè)東,項(xiàng)忠元申請(qǐng)人:中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院