專利名稱：：一種高效液相色譜－熒光法同時(shí)測(cè)定血清色氨酸和酪氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種高效液相色譜-熒光法同時(shí)測(cè)定血清色氨酸和酪氨酸的方法。
背景技術(shù)：
：目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的檢測(cè)Tyr和Trp的方法較多，包括高效液相色譜法(HPLC)、高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)、質(zhì)譜法(MS)等。HPCE分析時(shí)間較短，分離能力較強(qiáng)，但檢測(cè)限(紫外吸收檢測(cè)器)不及HPLC，且重復(fù)性較差；質(zhì)譜技術(shù)亦有操作復(fù)雜、重復(fù)性較差的不足之處；相對(duì)來(lái)說(shuō)，HPLC應(yīng)用較廣泛。色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)具有吲哚結(jié)構(gòu)，自身能產(chǎn)生熒光，故可采用熒光法檢測(cè)。國(guó)內(nèi)外已有采用HPLC-熒光法(HPLC-FD)或HPLC-紫外法(HPLC-UV)分別單獨(dú)檢測(cè)血清中Tyr和Trp的報(bào)道，有采用HPLC-UV同時(shí)測(cè)定Tyr和Trp的報(bào)道，也有采用高效液相色譜法測(cè)定腦脊液中Tyr和Trp含量的報(bào)道，但目前尚未有采用HPLC-FD同時(shí)測(cè)定血清中的Tyr和Trp的報(bào)道。近來(lái)，Sanchez-Machado等用HPLC-FD同時(shí)測(cè)定蝦廢料中的Tyr和Trp含量，但是線性范圍窄，雖能滿足蝦廢料中氨基酸的檢測(cè)需要，但不能滿足臨床血清樣本的檢測(cè)要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種高效液相色譜_熒光法同時(shí)測(cè)定血清色氨酸和酪氨酸的方法，本發(fā)明分析時(shí)間短，試劑消耗少，靈敏度高，特異性好，能滿足臨床血清樣本的檢測(cè)要求。本發(fā)明可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明采用的檢測(cè)儀器是510色譜泵、2475型熒光檢測(cè)器(Waters公司)、HS2000色譜數(shù)據(jù)工作站(杭州英譜科技開(kāi)發(fā)有限公司)、Rheodyne7725手動(dòng)進(jìn)樣器(帶20iiL進(jìn)樣環(huán))。0.22iim濾膜及其抽濾器(Millipore公司);Milli-Q純水器(Millipore公司)；TGLL218臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)廠)；SB2200型超聲去氣儀(上海必信能有限公司)。本發(fā)明的主要試劑有Tyr、Trp、5_羥色胺(5_HT)、犬尿喹啉酸(Kyna)、苯丙氨酸(Phe)、犬尿氨酸(Kyn)和肌酐(Cr)均購(gòu)自Sigma公司；乙腈、甲醇均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Tedia公司；醋酸鋅、冰醋酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純，高氯酸為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純。本發(fā)明采用的檢測(cè)條件是其中色譜柱MegresC18柱(250mmX4.6mmi.d.，5ym，江蘇漢邦科技有限公司);流動(dòng)相10%(v/v)乙腈；流速1.2mL/min;熒光檢測(cè)波長(zhǎng)0-5min激發(fā)光波長(zhǎng)228nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為306nm;5min后激發(fā)光波長(zhǎng)285nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為353nm;進(jìn)樣量20y1;室溫下測(cè)定。本發(fā)明的檢測(cè)原理色氨酸和酪氨酸可以產(chǎn)生自然熒光，利用熒光檢測(cè)器可調(diào)波長(zhǎng)的性質(zhì)選擇色氨酸和酪酸的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，在最佳色譜條件下使色氨酸和酪氨酸分離，色譜分離后的兩種氨基酸經(jīng)過(guò)熒光檢測(cè)器和色譜數(shù)據(jù)工作站的檢測(cè)和處理，作出色譜圖，然后根據(jù)色譜圖完成氨基酸的含量分析和測(cè)定。本發(fā)明包括以下步驟a、采用MegresC18柱250mmX4.6mmi.d.，5um色譜柱；b、流動(dòng)相的組成:10%(V/V)乙腈;c、流速為1.2ml/min，進(jìn)樣量20iU，室溫下測(cè)定;d、利用熒光檢測(cè)器掃描確定色氨酸和酪氨酸的最大激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)，進(jìn)而使得兩種物質(zhì)均在其最佳波長(zhǎng)下得到檢測(cè)。可調(diào)波長(zhǎng)設(shè)定為0-5min激發(fā)光波長(zhǎng)228nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為306nm;5min后激發(fā)光波長(zhǎng)285nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為353nm;e、對(duì)建立方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)混合標(biāo)準(zhǔn)品和血清樣品的檢測(cè)、標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限、精密度的評(píng)價(jià)、回收率的考察和干擾試驗(yàn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下1、本發(fā)明首次成功建立了一種HPLC-FD同時(shí)測(cè)定人血清中Tyr和Trp的方法。Tyr和Trp具有自然熒光，本發(fā)明利用熒光檢測(cè)器自動(dòng)轉(zhuǎn)換激發(fā)光與發(fā)射光波長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，選擇Trp和Tyr的最佳波長(zhǎng)，使Trp和Tyr的色譜峰峰面積最大，檢測(cè)靈敏度增加；與已報(bào)道方法比較，本發(fā)明分析時(shí)間短，試劑消耗少，靈敏度高，特異性好，能滿足臨床血清樣本的檢測(cè)要求。2、本發(fā)明原理簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、快速(9min可完成檢測(cè))、可行性高。3、本發(fā)明靈敏度高、特異性好、能滿足血清標(biāo)本酪氨酸和色氨酸含量測(cè)定要求，適合于臨床和科研應(yīng)用。方法學(xué)評(píng)價(jià)顯示，在一定范圍內(nèi)，兩種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好(rX).990)，線性范圍寬；在該方法下兩種物質(zhì)的檢測(cè)限低。色氨酸為回收率為88.8%-97.2%，酪氨酸回收率為90.5%-108.8%，色氨酸和酪氨酸的日內(nèi)和日間精密度均小于5%，苯丙氨酸(Phe)、犬尿氨酸(Kyn)、犬尿喹啉酸(Kyna)、5_羥色胺(5-HT)和肌酐(Cr)對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。圖1為混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖；峰序號(hào)Trp-色氨酸，Tyr-酪氨酸；圖2為本發(fā)明測(cè)定的血清樣本的色譜圖；峰序號(hào)Trp-色氨酸，Tyr-酪氨酸。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實(shí)施例l，試劑的配制和血清樣本的收集處理1.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取TrplO.Omg、TyrlO.Omg用2.5%(v/v)的高氯酸溶液溶解并稀釋至10.OmL，混勻，分別制成4900ymol/LTrp標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和5500ymol/LTyr標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分裝后置于-3(TC冰箱中備用。使用前分別取2種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液加2.5%的高氯酸配成標(biāo)準(zhǔn)工作液(含Trp24.5umol/L，Tyr55umol/L)。2.蛋白質(zhì)沉淀劑用超純水配制5%(v/v)的高氯酸溶液作血清蛋白質(zhì)沉淀劑。3.流動(dòng)相的配制用超純水配制10%(v/v)的乙腈溶液，再用0.22m微孔濾膜過(guò)濾，使用前超聲脫氣20min。4.干擾試驗(yàn)用樣本溶液用2.5%(v/v)的高氯酸溶液分別配制一定濃度Phe(610ymol/L)、5-HT(114iimol/L)、Kyn(1.96iimol/L)、Kyna(26.17nmol/L)禾PCr(88.14iimol/L)的標(biāo)準(zhǔn)液。5.血清樣本的收集處理將受試者空腹靜脈血2mL置于潔凈促凝管內(nèi)，3000g離心分離血清，取100y1血清于Eppendorf管內(nèi)，加入等體積5%(v/v)高氯酸溶液，加蓋后于旋渦混勻器上混勻，室溫下放置10min以充分沉淀血清中的蛋白質(zhì)，10000g離心10min(4°C)后將上清液轉(zhuǎn)入另一Enpendorf管內(nèi)，相同條件下再離心lOmin，取上清液20yL進(jìn)樣分析。實(shí)施例2，色譜條件的優(yōu)化1.檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇用流動(dòng)相稀釋一定濃度的Tyr和Trp標(biāo)準(zhǔn)溶液，以流動(dòng)相空白調(diào)零，在2475型熒光檢測(cè)器上，通過(guò)對(duì)Tyr和Trp的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜掃描，分別得到最大激發(fā)光波長(zhǎng)入exTyr=228nm、入exTrp=285nm;最大發(fā)身寸光波長(zhǎng)入emTyr=306nm、入emTrp=353nm。2.流動(dòng)相中有機(jī)物的比例對(duì)保留時(shí)間的影響配制不同乙腈含量(5%、8%、10%、12%)的流動(dòng)相，以標(biāo)準(zhǔn)液作為樣本進(jìn)行分析。隨著乙腈含量的增加，Tyr和Trp的峰保留時(shí)間相應(yīng)縮短，且Tyr和Trp峰面積響應(yīng)值也相應(yīng)的增大；當(dāng)乙腈含量為5%、8%時(shí)，單個(gè)樣本的分析時(shí)間太長(zhǎng)；但當(dāng)乙腈含量為12%時(shí)，血清樣本Tyr峰與前面的雜峰相融合，影響定量的準(zhǔn)確性。綜合考慮以上因素，本研究采用乙睛含量為10%的流動(dòng)相。3.流速對(duì)分離效果的影響分別選用流速O.8、1.0、1.2、1.5mL/min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)流速為1.5mL/min時(shí)，Tyr和Trp的保留時(shí)間雖縮短，但峰面積響應(yīng)值相應(yīng)的減小，色譜系統(tǒng)的后壓加大；流速為0.8、1.OmL/min時(shí)，分析時(shí)間太長(zhǎng)，色譜峰變寬。為了使柱效達(dá)到最高，使Tyr和Trp兩峰達(dá)到完全分離，本研究采用流速為1.2mL/min。實(shí)施例3，標(biāo)準(zhǔn)品及血清樣本的檢測(cè)1.標(biāo)準(zhǔn)品和血清樣本的色譜分離圖混合標(biāo)準(zhǔn)品(含Trp24.5iimol/L，Tyr55iimol/L)、混合血清樣本去蛋白上清液20iiL進(jìn)樣測(cè)定。檢測(cè)條件是其中色譜柱MegresC18柱(250mmX4.6mmi.d.，5ym);流動(dòng)相10%(v/v)乙腈；流速1.2mL/min;熒光檢測(cè)波長(zhǎng)0-5min激發(fā)光波長(zhǎng)228nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為306nm;5min后激發(fā)光波長(zhǎng)285nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為353nm;進(jìn)樣量20y1;室溫下測(cè)定。圖1、圖2分別是混合標(biāo)準(zhǔn)品和正常人血清樣本的色譜分離圖。Tyr和Trp保留時(shí)間分別為3.4min、7.6min左右，峰型穩(wěn)定，基線平穩(wěn)，無(wú)雜質(zhì)干擾峰，二者分離效果良好，9min內(nèi)即可完成測(cè)定。2.Tyr、Trp定性定量分析Tyr和Trp均采用峰保留值比較法和疊加法進(jìn)行定性分析，即比對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)液和血清樣品在相同條件下的色譜峰和相對(duì)保留時(shí)間；在血清樣品中分別加入適量的各種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，比較相同色譜條件下不加標(biāo)準(zhǔn)品及加標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果表明，在血清樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)品前后，Tyr和Trp的出峰位置是一致的。用外標(biāo)法測(cè)定峰面積進(jìn)行定量分析。即在相同色譜條件下測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)品和血清樣品，把混合標(biāo)準(zhǔn)品中Tyr和Trp的色譜峰面積和血清樣品中Tyr和Trp色譜峰面積進(jìn)行比較求得血清樣品中三種物質(zhì)的含量。用公式表示為丁xC"2血清Tyr(Trp)濃度=^;注Au=血清中Tyr(Trp)峰面積；As=混合標(biāo)準(zhǔn)液中Tyr(Trp)峰面積；Cs=混合標(biāo)準(zhǔn)液中Tyr(Trp)濃度。3.標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限取Tyr和Trp標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液，用2.5%的高氯酸溶液配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合液，每個(gè)樣本進(jìn)樣3次，取其平均值用最小二乘法進(jìn)行相關(guān)與回歸分析。二者回歸分析結(jié)果見(jiàn)表l。其中，Y代表峰面積(yVXs)，X代表被分析物的進(jìn)樣濃度(ymol/L)。以流動(dòng)相為空白，按信噪比為3求出檢測(cè)限。二者的峰面積與進(jìn)樣濃度線性關(guān)系良好，線性范圍寬，最低檢測(cè)限低，靈敏度高。表1Tyr和Trp的回歸分析結(jié)果及最低檢測(cè)限項(xiàng)目HI線性范圍(|imol/L")謂艮Y=121937X+4619S0.99920.275-275O細(xì)T。Y=130731X+45149O養(yǎng)，0.0054.精密度的考察上述的色譜條件下，取混合血清進(jìn)行日間和日內(nèi)測(cè)定精密度的試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。Tyr和Trp日內(nèi)(20次)和日間(20d)測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均低于5%，可以滿足常規(guī)血清樣本分析要求。表2Tyr和Trp的日間和日內(nèi)測(cè)定的精密度測(cè)娜質(zhì)日內(nèi)測(cè)定值(jimol/L)日間測(cè)定值5S.0S±0.991.7157.91±1.S33.16Tip44.93±1.513.3743.95±2.074.705.回收率的考察取混合血清樣品1.6mL平均分為4組，第1組加入0.lmL超純水作為基礎(chǔ)樣品，第2、3、4組分別加入高、中、低3種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液0.lmL;按照上述方法對(duì)樣品進(jìn)行處理和分析測(cè)定，每組平行測(cè)定3次，取其平均值計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。表3Tyr和Trp的回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>6.干擾實(shí)驗(yàn)為探討人體內(nèi)一些物質(zhì)是否干擾Tyr、Trp的測(cè)定，取Phe、Kyna、Kyn、5_HT、Cr干擾試驗(yàn)用樣本溶液，先分別進(jìn)樣分析，再混合制成混合樣本進(jìn)樣分析。結(jié)果表明以上幾種物質(zhì)均對(duì)本法無(wú)干擾。表4干擾試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注-代表未檢測(cè)出。權(quán)利要求一種高效液相色譜-熒光法同時(shí)測(cè)定血清色氨酸和酪氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟a、采用MegresC18柱250mm×4.6mmi.d.，5μm色譜柱；b、流動(dòng)相10％(v/v)乙腈；c、流速為1.2ml/min，進(jìn)樣量20μl，室溫下測(cè)定；d、熒光檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為0-5min激發(fā)光波長(zhǎng)228nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為306nm，5min后激發(fā)光波長(zhǎng)285nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為353nm。全文摘要本發(fā)明涉及一種高效液相色譜-熒光法同時(shí)測(cè)定血清色氨酸和酪氨酸的方法，本方法包括以下步驟采用MegresC18柱250mm×4.6mmi.d.，5μm色譜柱；10％(v/v)乙腈作為色譜流動(dòng)相；流速為1.2ml/min；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)0-5min激發(fā)光波長(zhǎng)228nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為306nm；5min后激發(fā)光波長(zhǎng)285nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為353nm；進(jìn)樣量20μl；室溫下測(cè)定。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、可行性高，能滿足臨床血清樣本的檢測(cè)要求。文檔編號(hào)G01N21/64GK101750459SQ20101030044公開(kāi)日2010年6月23日申請(qǐng)日期2010年1月19日優(yōu)先權(quán)日2010年1月19日發(fā)明者任亞萍,周前選,唐愛(ài)國(guó),項(xiàng)忠元申請(qǐng)人:中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院