專利名稱：熒光納米顯微方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及科研設(shè)備，尤其涉及透鏡熒光顯微鏡。這種顯微鏡被用于獲取固定 在玻璃上的熒光物體的圖像。更具體地，本發(fā)明是一種以達到幾納米(nm)的分辨率重建 物體圖像的計算機化熒光顯微方法。
背景技術(shù)：
已知的光學(xué)顯微鏡可以利用物鏡形成放大的物體圖像，所述物鏡僅在物體上的 兩個點之間的距離大于通常所稱的衍射極限時才可以分別顯示它們。該極限可以采用以 下公式進行計算Γ = 0.61λ/Α(1)，式中入-通過孔徑為八=11*8111((^)的物鏡聚集的 光的波長，η-物體點周圍的物質(zhì)的折射率，Φ-在物鏡軸線與落入物鏡內(nèi)并在檢測器中 發(fā)現(xiàn)的極端射線之間的角度?，F(xiàn)在采用不同類型的設(shè)備通過物鏡進行熒光顯微。大功率 弧光燈、白熾燈、激光或日光可以作為顯微鏡的光源。熒光產(chǎn)生于光照區(qū)域中存在的所 有染料分子。采用分光分色鏡通過物鏡使所述區(qū)域得到光照。所述分色鏡使射出的光落 在物體上并將熒光反射到檢測器。第二種類型的光照通過從側(cè)面發(fā)送激光來產(chǎn)生。這樣 以總的內(nèi)部反射角向下或穿過物鏡一直到照射物體。在這種情況下，光僅達到距玻璃與 折射率低于玻璃的物體之間的邊界0.3倍波長的深度。物體熒光由物鏡聚集。其發(fā)送可 以目測并通過光電倍增器、攝影帶或數(shù)字攝像機記錄的物體圖像。所有現(xiàn)有的透鏡顯微 鏡的主要缺陷是它們具有對于相鄰兩點的分辨率的極限。這一極限可以根據(jù)公式(1)進 行計算。近年來已經(jīng)研發(fā)了采用由銀鹽膠片(silverfilm)制成的超透鏡進行顯微。膠 片厚度小于50納米；可以確保兩個點的分辨率距離相互大致為50納米。(N.Fang and X.Zhang, Imaging properties of ametamaterial superlens (元物質(zhì)超透鏡的成像特性)， 2003, App physLet v.82, 2, 161-163; Nicholas Fang, Zhaowei Liu, Ta-Jen Yen, andXiang Zhang Regenerating evanescent waves from a silver superlens (來自銀鹽超透鏡的再 生損耗波)，2003，OPTICS EXPRESS, Vol.11, No.7，682-687)。然而在生物體上采用 這些顯微鏡還不是很清楚。當(dāng)前顯微鏡模組的分辨率比我們在此提出的設(shè)備的分辨率低 幾倍。存在著最大分辨率大于例如1納米的設(shè)備，電子、隧道和原子力顯微鏡。應(yīng)該 注意到它們不僅具有真實的優(yōu)點，而且具有嚴重的缺陷，例如它們的設(shè)計和對物體的 操作復(fù)雜而且昂貴；缺乏接收彩色圖像以區(qū)別不同類型分子的能力；物體通常必須得到 干燥并利用改變物體不同部分相互排列的物質(zhì)進行處理。原子力和隧道顯微鏡還不能檢 測物體內(nèi)的結(jié)構(gòu)；一次只能檢測一個點并且掃描速度不超過每分鐘1平方微米；針的末 端很容易變臟并且此后不能達到物體表面。還有一種設(shè)備，其中通過激光穿過玻璃纖維末端上的針孔發(fā)射物體熒光。通過 驅(qū)動裝置使纖維在三個方向移動以使纖維末端定位在光反射、光漫射或涂有熒光的分子 表面附近。這種類型的顯微鏡不采用透鏡并且可以獲得分辨率比普通光學(xué)顯微鏡大十倍的圖像。僅當(dāng)玻璃纖維末端上的針孔直徑小于光的波長時才能實現(xiàn)這樣的結(jié)果。光在物 體上達到的深度比光的波長小得多。實際上，所有的光回到玻璃纖維內(nèi)，除了物體從孔 的外部收集的那部分。通過光電倍增器測定物體在孔附近收集的熒光、光漫射和反射光 強度。通過計算機采集有關(guān)測定光的強度的信息以及有關(guān)玻璃纖維末端坐標的數(shù)據(jù)來重 建物體表面的圖像。這一系統(tǒng)的主要缺陷是需要采用昂貴的高精度和快速作用的機械 單元，其負責(zé)相對物體移動玻璃纖維；制造端孔直徑小于50納米的玻璃纖維非常昂貴、 復(fù)雜和難以復(fù)制；孔很容易變臟并在此后不能達到物體表面；僅有很少一部分光可以穿 過直徑小于光波長的孔離開纖維；增加光強會導(dǎo)致纖維末端過熱和損壞；不能對玻璃纖 維接觸不到的物體區(qū)域上的熒光進行檢測；一次只能檢測一個點，表面掃描速度不超過 每分鐘1平方微米。介紹一種更新類型的顯微鏡。其利用幾個光束同時掃描物體表面。 National Institute of Standards and Technology(NIST)公布了關(guān)于形成這種顯微鏡的 5 年的研究工作成果(http://www.betterhumans.com/News/news.aspx ？ articleID = 2005-02-11-4， “ Optical Microscopes Enter the Nano (光學(xué)顯微鏡進入納米時代)。研
發(fā)混合系統(tǒng)對小于可見光波長的特征進行成像和測定)。在文章中指出，采用這種方法可 以區(qū)分40納米的納米級顆粒。作者沒有暗示可以成功地區(qū)分相互距離小于40納米的兩 個單獨的顆粒。從所提出的附圖和說明書中不能清楚地了解到該方法怎樣區(qū)分之間距離 小于r< 0.61 λ/A的兩個顆粒。據(jù)我們看來，所提出的設(shè)備不能達到距離比光波長小的 多的物體細部的分辨率。采用普通熒光顯微鏡的方法(Erwen，ASharonov, JHFerris, RM Hochstrasser Direct visualization of nanopatterns bysingle-molecule im a ging (通過單個分子成像實現(xiàn)納米
方式的直接可視化).App Phys Let 2005，86 043102)被認為是與本發(fā)明最接近的。該 方法的主要思想是利用非常低濃度的熒光肽對樣本-由具有1微米直徑自由開口的球形細 胞的聚合物制成的光膠片_進行染色。所述濃度可以對在布朗(Brownian)運動中移動到 中空球內(nèi)的單個肽分子進行觀測。通過激光束穿過物鏡照射樣本。照射角等于總的內(nèi) 部反射角。激光束激發(fā)玻璃附近150-200微米樣本層中的熒光。通過高靈敏的攝像機 (RoperScie π tific, Cascade 512F with electrons multiplier builtin CCD (具有在 CCD 中構(gòu)建 的電子倍增器的級聯(lián)512F))以500順序幀檢測各自通過同時向分子發(fā)熒光而得到染色的 熒光肽幾十個分子的位置。每個幀被記錄到計算機存儲器內(nèi)。每個圖像包含許多直徑大 致0.5微米的點，這些點以系統(tǒng)放大值得到倍增。所有的這些圖像相互疊加。最終圖像 的分辨率不超過普通熒光顯微鏡的分辨率。該系統(tǒng)的主要缺陷是文章中沒有關(guān)于能夠 計算檢測點中心位置以根據(jù)這些點產(chǎn)生分辨率高于衍射極限的圖像(參見公式1)；文章 中沒有描述選擇性地對物體結(jié)構(gòu)進行染色的方法；對解決以下問題沒有任何描述染色 后在檢測觀測區(qū)域中非熒光肽分子的過程中物質(zhì)將釋放顏色。這樣將使溶液更厚并且不 能用新的熒光分子替換所述熒光分子。這樣不能獲得大于500幀的更大數(shù)量。接收分辨 率比衍射極限(參見公式1)所允許的更大的圖像就需要大數(shù)量的幀。生物體例如肌肉的研究特征在于存在許多不同類型的分子，它們的定位比通過 物鏡在記錄器_眼睛、照片或攝像機平面上形成物體放大圖像的普通光學(xué)顯微鏡的分辨 率更靠近。顯微鏡分辨率(公式1)的衍射極限通過同時觀測在觀測區(qū)域中的所有點限制顯微鏡的分辨率，并且通過聚焦在一個點上的光線順序觀測物體的所有點(共焦和其它 類型的掃描透鏡顯微鏡)限制顯微鏡的分辨率。這就是如果將光學(xué)顯微鏡和所采用的對 可視區(qū)域中不同類型的分子進行選擇性染色的方法的所有優(yōu)點與所述改進的分辨率組合 將是最好的原因，這樣可以單獨觀測相互位置小于10-20納米的分子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出對物體進行染色、制備研究所用物體、對結(jié)果進行計算機 分析的方法。這種處理可以接收分辨率高于20納米的物體圖像。這樣使熒光顯微鏡變 為“納米顯微鏡”。通過制造低染色物體的多個畫面(物體中的所有熒光分子被分別看 作直徑為2r= 1.22 λ/A的點，具有在上萬順序幀上的不同位置)實現(xiàn)所述目的。此外， 所有的這些幀被用于計算所有檢測點的中心位置(這些位置與熒光分子的實際坐標相對 應(yīng))。而后完成所有染料分子位置的3-D重建。分辨率可以與染料分子的尺寸相比。 物體的不同結(jié)構(gòu)以不同顏色得到染色。熒光納米顯微鏡可以基于在熒光顯微中采用的標 準模塊。本發(fā)明包括多種模塊用于可視化觀測和向數(shù)字攝像機傳遞物體圖像的光學(xué)系 統(tǒng)。數(shù)字攝像機應(yīng)該能夠檢測并對具有低背景噪聲級的單個熒光分子和納米顆粒進行數(shù) 字化成像。系統(tǒng)的第二模塊是用于記錄和分析圖像的計算機。第三部件是與物鏡相對定 位的樣本保持器。第四部件是用于吸取來自樣本熒光的光的可變抑制濾色器組件。納米 顯微鏡應(yīng)該裝有安裝在樣本保持器旁邊的兩個光源。安裝角度應(yīng)該確保樣本的整個切片 在整個深度，或在玻璃附近小于150納米的層中受到光照。在該層中的熒光分子可以吸 收以總的內(nèi)部反射角照射時流過邊界的光波的能量。觀測物體應(yīng)該在具有裝入染料飽和 濃度的溶液中得到初步染色，所述染料僅在UV光脈沖使阻礙熒光基團與染料分子分離時 開始發(fā)熒光。剩余染料應(yīng)該仔細洗掉。確保分子結(jié)構(gòu)從覆蓋玻璃和保持物體的棱鏡玻璃 起長期穩(wěn)定是非常困難的。對于以新的沖洗溶液準確觀測的物體是的確存在這一問題。 這就是納米顯微鏡最高分辨率僅可以接收到物體位于距棱鏡玻璃不大于150納米距離的 那些層的原因。這是光以中的內(nèi)部反射角落在邊界表面時所達到的深度。對于觀測保持 靜止的物體來說，通常可以在長時間內(nèi)觀測物體。定位在基準玻璃附近的不同結(jié)構(gòu)幾乎 完全不可移動。由于多個穩(wěn)定的相互連接以及與基準玻璃的連接，它們可以保持它們的 位置。盡管容積的大約80%填充有不同鹽分的水溶液，但它們不可移動。玻璃邊緣上的 間隙應(yīng)該得到密封(例如用石蠟)以避免溶液被烘干。在本發(fā)明提供的一種對染色物體進行納米顯微的方法中，所述物體被放置在溶 液中或作為保存樣本的切片被放置在聚合物上，所述方法采用熒光顯微鏡，其裝有具有 抑制濾色器的數(shù)字攝像機，用于吸取物體的熒光，所述攝像機能夠以低噪聲級檢測由激 光激發(fā)的各個熒光分子的圖像，顯微鏡還裝有用于記錄從攝像機接收到的圖像的計算 機；其特征在于，1-2千不發(fā)熒光的染料分子通過UV閃光周期性地被轉(zhuǎn)化成發(fā)熒光的 染料分子，這些分子覆蓋物體結(jié)構(gòu)，所述分子被轉(zhuǎn)化成發(fā)熒光的分子是因為阻礙熒光的 化學(xué)基團與它們分離，所形成的熒光分子的圖像在攝像機幀上作為單個點得到檢測，所 述分子在檢測的過程中釋放顏色并且具有剩余熒光的幀被從包含熒光顆粒和剩余熒光混 合物的幀中減去，被減去的幀保存在計算機存儲器內(nèi)以發(fā)現(xiàn)代表染料分子坐標的點的中 心，這一過程被重復(fù)多次以計算在物體光照區(qū)域中所有染料分子的坐標并以大于20-50納米的分辨率重建物體的2-D或3-D圖像。在本發(fā)明的納米顯微方法中，可以利用單個觀測的熒光納米顆粒代替熒光分子 對規(guī)則形成并脫色的物體進行染色，這些納米顆粒各自包含多個耐熒光分子，由于布朗 力這些分子可以在物體結(jié)構(gòu)之間移動并且在由2-D電泳驅(qū)動時，激光持續(xù)激發(fā)這些顆粒 的熒光，攝像機和計算機檢測上萬個幀，每幀上具有1-2千單獨檢測的點，這些點反射 顆粒位置，根據(jù)計算的所有幀上點中心的坐標檢測區(qū)域的液體部分并且顆?？梢栽谶@些 區(qū)域中移動。在本發(fā)明的納米顯微方法中，可以采用第二攝像機，第二攝像機與第一攝像機 相同，但其定位成使得其傳感器檢測深度與由第一攝像機檢測的平面不同的物體平面的 圖像，這一差值可以從50納米到2000納米，通過兩個攝像機接收的光強度分布的差異被 用于計算物體中染料分子位置的第三坐標，其被用于形成物體的3-D圖像，液體樣本中 的物體在與總的內(nèi)部反射角相等的角度下通過物鏡得到照射，厚度為不足一微米到幾微 米的固體切片中的物體可以在固體切片的全部深度上通過物鏡或者在總的內(nèi)部反射角下 通過物鏡得到照射。在本發(fā)明的納米顯微方法中，可以利用不同染料、不同波長的熒光、一組分色 鏡對物體的不同結(jié)構(gòu)同時染色，并且濾色器被用于選擇性地將不同結(jié)構(gòu)的圖像投射在兩 個或多個攝像機上，這樣使同時得到檢測的分子的數(shù)量倍增。在本發(fā)明的納米顯微方法中，可以不同的裝入分子可以周期性地引入物體，這 些分子可以因不同的化學(xué)反應(yīng)或者由于不同的物理過程而由不發(fā)熒光變?yōu)榘l(fā)熒光，這些 因素使阻礙熒光的化學(xué)基團分離，以所有產(chǎn)生的熒光分子在攝像機幀上作為單個點得到 檢測的速度使基團分離，在記錄過程中分子釋放顏色，具有剩余熒光的幀被從包含剩余 熒光圖像和熒光分子圖像的混合物的幀中減去，減去的幀保存在計算機存儲器內(nèi)以進一 步發(fā)現(xiàn)點的中心，這些中心代表染料分子的坐標，通過在光照區(qū)域形成新的熒光分子以 計算物體中所有染料分子的坐標并完成這些“特殊”分子在早期接收到的物體2-D或 3-D圖形上的計算機位置重建，多次重復(fù)上述循環(huán)。3-D納米顯微鏡需要物體及其部件相對于透鏡具有總體固定性。這就是物體應(yīng) 該在利用裝入的染料染色并沖洗后利用脫水溶液進行處理并放入聚合物非熒光物質(zhì)(例 如環(huán)氧樹脂)內(nèi)的原因。物體幾微米厚的微小段可以被用于在所有三個維度上利用10-20 納米對物體進行3-D重建。包含在固體物質(zhì)中的所述物體如同其在普通熒光顯微鏡中一 樣得到照射。僅有的改進是應(yīng)該采用另外的閃光燈以將幾百個不發(fā)熒光的分子轉(zhuǎn)變?yōu)樵?每幀中發(fā)熒光。對于在液體中的物體和在聚合物膠片中的物體，具有λ < 360納米的 UV閃光燈周期性照射由不發(fā)熒光的染料染色的物體，并且每次通過阻礙熒光的特殊化學(xué) 基團將幾百(甚至幾千)個不發(fā)熒光的分子轉(zhuǎn)變成發(fā)熒光的分子。激光持續(xù)照射物體并以 這種強度激發(fā)新形成的熒光分子中的熒光，所述分子中的每個將在不到一秒內(nèi)發(fā)送幾萬 光量子。分子將在其在具有低背景噪聲級的數(shù)字化幀上得到熒光記錄之后釋放顏色。熒 光分子再生、它們的射出、記錄和釋放顏色的循環(huán)可以充分幾萬次。每次新的熒光分子 將產(chǎn)生、得到檢測以及釋放顏色。由于不會吸收激光，因此沒有得到轉(zhuǎn)化的非熒光分子 不會釋放顏色?？梢圆捎眠@一方法檢測幾萬個幀?？梢栽诿繋蠙z測成百甚至成千的熒 光分子?？梢杂嬎愀采w所有結(jié)構(gòu)表面、位于可視區(qū)域內(nèi)的所有數(shù)百萬熒光分子的位置。具有不同活性基的染料可以被用于對不同顏色不同屬性的結(jié)構(gòu)進行染色?；钚曰梢耘c 任意蛋白質(zhì)、任意核酸、任意脂肪等鏈接。(所提出方法的命名-有色納米顯微術(shù))。納米顯微方法的第二個改進是基于可以在具有穿透薄膜、充有鹽溶液的生物樣 本的大部分容積內(nèi)實現(xiàn)發(fā)出非常亮的熒光并耐熒光脫色的納米顆粒的布朗運動。通過藻 膽蛋白質(zhì)或直徑10-40納米發(fā)熒光的微球代表納米顆粒。所述運動可以通過由幾對交叉 電極提供的電流所進行的電泳來得到調(diào)節(jié)。電流引導(dǎo)顆粒在不同方向的運動。所以它們 掃描所有可接觸的容積。如果幾百個相同(或者用超出光照區(qū)域的那些替換)的熒光顆 粒在比每幀中檢測的相互距離1-2微米更大的距離上移動，則可以以幾納米的精度計算 它們的位置(作為相應(yīng)點的中心的坐標)。來自所有幀中的坐標可以被用于發(fā)現(xiàn)顆粒長期 出現(xiàn)的所有位置。其表示由液體填充的所有容積。顆粒不能存在的部分容積可以被認為 是填充有不同原始肽的致密結(jié)構(gòu)、染色體、部分未受破壞的薄膜等。顆粒位置可能的波 動會使點的尺寸放大少許，但點的中心位置可以被認為是顆粒在物體中的平均坐標。應(yīng) 該注意到，具有正電荷、負電荷的顆粒以及中性顆?？梢缘竭_物體的不同區(qū)域。其發(fā)生 的原因是它們與生物結(jié)構(gòu)的局部電荷相互作用，這就是該方法可以用于研究物體結(jié)構(gòu)表 面電荷的原因。(所提出的方法命名-單色納米顯微術(shù))兩種所提出的方法都可以確保納米顯微鏡分辨率達到幾微米，不取決于分辨力 (公式1)，而是取決于物體長期得到觀測的部分中的結(jié)構(gòu)的內(nèi)在流動性。第二個因素是 視頻數(shù)據(jù)中噪聲與信號之間的比例。通過對所提出的方法的多種改進可以調(diào)節(jié)這兩個因 素。例如，可以在物體內(nèi)引入一些明亮發(fā)光的關(guān)鍵的熒光顆粒。則可以考慮與物體剛性 相連的關(guān)鍵顆粒在可視區(qū)域中的移動來計算替換的顆粒的坐標。這種方法可以對物體定 位在幾納米距離上的部分實現(xiàn)2-D分辨。應(yīng)該注意到熒光顆粒成像的一些參數(shù)(點的直徑以及沿每個點剖面的光強度分 布)可以隨著顆粒距顯微鏡物鏡焦面的距離而改變。則就是提出完成這些產(chǎn)生的計算以 計算發(fā)光顆粒第三坐標的原因。提出在兩個攝像機上投射物體的圖像。這樣可以改進第 三坐標確定的精度。光線在通過物鏡之后被分成兩條線。攝像機被定位成使得物體的兩 個相鄰焦面通過一個透鏡被投射在所述攝像機上。每個顆粒的光強度分布可以在通過不 同攝像機檢測時不同。其可以根據(jù)第三坐標成比例并被用于形成物體的3-D圖像。圖3 表示3-D納米顯微基礎(chǔ)的視圖。來自投射在CCD上的熒光顆粒的點的直徑和強度取決于 顆粒與物鏡之間的距離。聚焦在不同焦面上的兩個攝像機顯示具有不同直徑和沿直徑不 同強度分布的一個顆粒。圖中右上角的示意圖表示直徑與沿直徑強度分布之間的差異取 決于攝像機和熒光顆粒位置。除此之外，在一些情況下納米顯微術(shù)可以有助于發(fā)現(xiàn)通過熒光顆粒以2-3個不 同波長和同一激發(fā)狀態(tài)形成的點的中心。這一點可以通過使光分色鏡分離來實現(xiàn)。所述 分色鏡將具有一個波長的光傳到一個攝像機并將具有另一波長的光反射到另一攝像機。 據(jù)此，所提出的發(fā)明允許當(dāng)這些分子通過具有不同發(fā)射波長的染料進行染色時以納米 級分辨率位置重建幾個不同類型的物體分子，這樣可以使同時從熒光顆粒中單獨看到和 檢測的點的數(shù)量擴大，因為即使看到不同顏色的相應(yīng)點存在干涉也可以單獨看到不同波 長的這些點。如果所描述的納米顯微方法與在熒光分子中裝入不發(fā)熒光的分子的其它變化相組合，則其變得非常有用。這一點可以通過使阻礙熒光的基團分離的化學(xué)反應(yīng)或不同的 物理影響來實現(xiàn)。所述反應(yīng)的實例是ATP反應(yīng)、酯酶影響、過氧化反應(yīng)、放射性轉(zhuǎn)化 等等。這種改進最終形成的熒光分子可以通過激光射出并利用用于根據(jù)上述方法即使物 體結(jié)構(gòu)表面坐標的攝像機進行檢測。它們的坐標可以被計算作為適當(dāng)點在圖像幀上的中 心。而后它們的圖像可以“重疊”在物體的早期重建的圖像上。它們將顯示物體反應(yīng) 活性基團的位置。這種圖像的分辨率大于20納米。對專業(yè)人員顯而易見的是在附加權(quán)利要求中描述的本發(fā)明可以通過不同方法得 到修改，這些方法不脫離本發(fā)明的主要思想?？梢栽诔Ｒ?guī)狀態(tài)下通過采用熒光顯微鏡來改變納米顯微狀態(tài)下的設(shè)備的操作。 所述狀態(tài)提供了以普通分辨率(公式1)原地直接可視觀測物體的可能性。其還提供了以 非常高靈敏度的攝像機檢測圖像并將其傳送到計算機存儲器內(nèi)的可能性。而后，這些幀 得到分析以測定幀的不同區(qū)域的幾何參數(shù)和光強度。這一點可以用于例如生物發(fā)光和化 學(xué)發(fā)光研究。所提出的附圖表示如何改進熒光顯微鏡以實施根據(jù)本發(fā)明的納米顯微方法。
具體實施例方式如

圖1和2所示的熒光顯微鏡_納米顯微鏡裝有一個(圖1)和兩個(圖2)單 色攝像機1，其具有與它們的傳感器(CCD)相對定位的數(shù)字輸出和抑制濾色器。這些濾 色器僅將熒光傳到攝像機。顯微鏡還裝有可拆除的分光棱鏡2 ；變焦達IOOx以及孔徑達 A = 1.4的物鏡3。物體4被向下壓向玻璃物體保持器5，其具有截頂棱鏡邊緣的形式。 設(shè)備還裝有用于透鏡系統(tǒng)的激光6，以穿過棱鏡平面激發(fā)熒光；裝有用于透鏡系統(tǒng)的脈 沖UV源(7)以對在染料分子上存在的阻礙熒光基團進行光分解。另一重要部件是計算 機8，其具有用于記錄以及加工數(shù)字化圖像的軟件。該軟件還被用于控制電源，提供UV 脈沖和電泳設(shè)備所需的能量。目鏡10 (圖1)被用于可視化觀測(9)。單元應(yīng)該被放置在 置于防震桌上的隔音柜內(nèi)。將單獨描述向電泳電極提供動力的設(shè)備，所述電極引導(dǎo)可移 動熒光納米顆粒在充有鹽溶液的物體內(nèi)移動。以通過采用由Photometries生產(chǎn)的高靈敏攝像機CascadelK或由Theta系統(tǒng)生 產(chǎn)的攝像機SISI_t285EM的納米顯微鏡接收圖像作為實例。SISI_t285EM攝像機裝有由 Texas Instruments生產(chǎn)的CCD TC285SPD,其具有包含在CCD晶體中的電子倍增器。其
具有達63%的量子效能、1004活性水平正方形像素，在大致8X8毫米的感光正方形上有 8微米的邊在1002線上。如果物體圖像通過IOOx物鏡直接投射在攝像機的CCD上，則 由激光及其透鏡系統(tǒng)照射的物體上的正方形應(yīng)該比80X80微米更大一點。每個CCD像 素與80X80納米的物體正方形相對應(yīng)。每個發(fā)光顆粒或分子在物體上被看作直徑為2r =1.22 λ /Α、大約560納米的點。其以大約7像素的直徑投射在CCD正方形上。在每 幀上無序分布的顆粒之間的平均距離應(yīng)該大于2000納米。在這種情況下，實際上它們中 所有的都可以單獨被看到。在這種情況下，至少40X40 = 1600個點可以同時以它們將 單獨被觀測到的方式被投射到每幀的CCD上?？梢圆捎貌煌姆椒ㄟ_到同時使顆粒發(fā)熒 光的所述濃度。首先，可以利用低濃度的明亮熒光顆粒對物體染色。這樣可以使它們在 觀測區(qū)域內(nèi)移動作布朗運動并且它們可以另外通過電泳電流進行移動?？梢酝ㄟ^幾對電極以它們引導(dǎo)顆粒在不同方向上移動的方式提供電流。其次，可以通過類似由Molecular Probes, USA制造的5-羧基熒光素-二(5-CarboXymetoXy-2-硝基聯(lián)苯酰)酯、β -丙 氨酸-羧基lamid、suxynimidil酯(CMNB-裝入羧基熒光素，SE)的特殊染料進行染色。 在利用波長310-365納米的UV閃光對觀測區(qū)域中不發(fā)熒光的染料中的大約1000-1600個 分子進行照射將釋放阻礙熒光的特殊基團。這些分子能夠在被藍光照射時產(chǎn)生幾千量子 的綠光。此后它們將釋放顏色。當(dāng)物鏡孔徑為A= 1.1-1.3時，每個熒光顆粒中超過 10%的光被傳遞到攝像機并參與形成覆蓋在CCD40像素附近的點。點中心的光強度達到 100量子。這一數(shù)量足以接收信號和噪聲比例相當(dāng)符合要求的視頻信號(當(dāng)采用上述攝像 機時)。這一比例可以通過高于20納米的分辨率計算點中心的坐標。這種染料在阻礙 熒光的基團鏈接在其上時不吸收激光和釋放顏色。這樣可以重復(fù)以下過程上萬次開始 CCD檢測具有剩余熒光的物體的圖像。而后圖像在攝像機中得到數(shù)字化并被傳送到計算 機。此后UV閃光在可視區(qū)域形成1000-1600個熒光分子，激光激發(fā)這些分子中的熒光。 CCD檢測熒光分子和重疊在剩余熒光上的顆粒的圖像。圖像在攝像機中得到數(shù)字化并被 傳送到計算機，在那里具有剩余熒光的之前德幀被從中減去。所接收的被減去的幀存儲 在計算機存儲器中以為了計算點中心坐標、其平均直徑以及強度而作進一步的分析。此 后，在不檢測圖像的情況下對物體照射一段時間。執(zhí)行這一操作是為了使已經(jīng)檢測的分 子的釋放顏色最大化。而后重復(fù)整個循環(huán)。新的熒光分子將在每個循環(huán)中得到形成、檢 測和釋放顏色，直至所有染料分子的坐標都得到檢測。Molecular Probes不僅生產(chǎn)上述染 料。公司還可以按照要求生產(chǎn)這種染料。它還可以生產(chǎn)用于單個形成所述染料的成套試 劑-“灌裝件”(D-2516)。 在實例中指出的攝像機可以以每秒10幀的頻率記錄單個熒光分子的圖像。以符 合要求的信號和噪聲比例記錄圖像?？梢栽趲仔r內(nèi)檢測例如40000幀。每幀將包含高 達1600個分子圖像。這樣的話，總的檢測熒光分子坐標的量可以達到64000000，觀測 的各個分子之間的平均距離可以僅有10納米。這比任何其它的透鏡顯微鏡都好十幾倍。 具有分子圖像的幀應(yīng)該在不壓縮或不損失質(zhì)量壓縮的情況下得到保存。這一點應(yīng)該實現(xiàn) 以更精確地計算分子坐標。在一次實驗中有關(guān)所有不壓縮幀的信息總量可以達到幾萬兆 字節(jié)。考慮到新型硬盤驅(qū)動容量這一點不成問題。文獻源提供了有關(guān)計算點的中心的多 種算法的信息。我們已經(jīng)編制了計算機軟件完成所述計算并基于點的中心的計算坐標平 臺重建完整的圖像。
權(quán)利要求
1.一種對染色物體進行納米顯微的方法，包括通過將非熒光染料分子轉(zhuǎn)化成熒光染料分子產(chǎn)生熒光分子；激發(fā)染色物體的熒光分子，其中每個得到激發(fā)的熒光分子具有一顏色；將每個得到激發(fā)的熒光分子記錄為單個點；使熒光分子脫色；多次重復(fù)激發(fā)和記錄步驟的循環(huán)；采用所述點計算熒光分子的坐標；以及由在重復(fù)循環(huán)中記錄為點的熒光分子坐標形成圖像。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括采用裝有一個或多個攝像機和濾色器的熒光顯微鏡檢測得到激發(fā)的熒光分子，所述 濾色器用于采集得到激發(fā)的染色物體的熒光，所述一個或多個攝像機能夠檢測具有由激 光激發(fā)的單獨的發(fā)光的熒光分子圖像的低噪聲級幀，所述顯微鏡還裝有用于記錄從攝像 機接收的圖像的可記錄介質(zhì)；通過利用化學(xué)反應(yīng)或物理效應(yīng)將一個或多個攝像機投影區(qū)域中的非熒光染色分子轉(zhuǎn) 化成熒光染色分子而產(chǎn)生熒光分子；采用一個或多個攝像機將每個得到激發(fā)的焚光分子作為單個點記錄在圖像幀上； 將具有新形成的熒光分子的序列幀保存在可記錄介質(zhì)上； 多次重復(fù)這一循環(huán)；以及采用保存的幀由接收的多個單獨的熒光分子圖像計算分子距點中心的位置和強度分 布，位置或分布在序列幀上具有不同位置，這些位置與熒光分子的坐標相對應(yīng)，其中熒 光分子的位置計算提供比得上發(fā)熒光分子的尺寸的分辨率，達到幾納米；這一過程向位于距玻璃不超過150納米距離的物體層提供了分子結(jié)構(gòu)的分辨率并根 據(jù)物體結(jié)構(gòu)的靈活性為更大距離提供分辨率。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，熒光分子在它們的熒光作為具有強度的點 得到記錄以允許計算熒光分子的位置或在每個幀上得到記錄之后脫色。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括利用染料的飽和濃度對處于溶液中的物體進行染色以提供染色物體； 洗掉多余的染料；以及密封用于保持染色物體的玻璃的邊緣上的間隙，以避免染料溶液變干。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，染色物體作為保存樣本的切片布置在聚合 物中。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括將具有殘留熒光的幀和包含重疊在殘留熒光上的發(fā)熒光分子圖像的幀保存到可記錄 介質(zhì)上；從包含重疊在殘留熒光上的發(fā)熒光分子圖像的幀中減去具有殘留熒光的幀；以及 根據(jù)接收到的每個熒光分子圖像的點中心坐標和強度分布的計算利用減去的幀計算 發(fā)熒光分子的位置。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括采用不同染料將物體的不同結(jié)構(gòu)染成不同顏色，其中不同染料包括在不同波長下發(fā)熒光或具有不同活性基團的染料，其中不同活性基團是適于與蛋白質(zhì)鏈接的活性基團、 適于與核酸鏈接的活性基團或適于鏈接脂肪的活性基團；采用分色鏡檢測在不同波長下發(fā)熒光的分子；采用分色鏡和兩個或多個攝像機檢測在不同波長下發(fā)熒光的分子，從而可以重新構(gòu) 建幾種不同類型的物體分子的位置；或測定同時看到和檢測到的單獨的發(fā)熒光分子的數(shù)量。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括通過閃光燈、UV閃光燈、UV脈沖燈源、ATP反應(yīng)、酯酶作用、過氧化反應(yīng)或放射 性轉(zhuǎn)化周期性將非熒光染料分子轉(zhuǎn)化成發(fā)熒光染料分子。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括采用常規(guī)熒光顯微術(shù)或采用具有殘留熒光的幀檢測染色物體中的關(guān)鍵顆粒，其中關(guān) 鍵顆粒是明亮發(fā)光的熒光顆粒、與物體剛性相連的顆粒、被引入染色物體內(nèi)的顆粒；以 及采用物體內(nèi)的至少一些關(guān)鍵顆粒計算熒光分子的坐標，考慮關(guān)鍵顆粒在可視區(qū)域的 運動得到達幾納米的分辨率，即使對于具有一定靈活性的物體結(jié)構(gòu)的物體。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括采用分光鏡和兩個攝像機，它們定位成使得物體的兩個相鄰聚焦平面通過一個物鏡 得到投影，每個熒光分子的光強度分布在通過不同攝像機檢測時是不同的，利用所述不 同強度計算第三坐標以形成物體的3D圖像。
11.一種用于物體納米顯微的方法，包括記錄充滿溶液的樣本的一部分內(nèi)耐熒光脫色的發(fā)熒光納米顆粒的運動，該運動允許 掃描樣本的可接觸的容積并顯示充滿液體的容積和填充有致密結(jié)構(gòu)的容積；由所有幀的相應(yīng)點計算納米顆粒的位置。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，該方法被用于置于溶液中的物體的2D納米顯微或3D納米顯微，利用熒光顯微鏡、 激光器、分光鏡和濾色器、用于檢測物體熒光并且能夠測定在物體結(jié)構(gòu)之間可移動并由 激光激發(fā)的單獨的發(fā)熒光納米顆粒的圖像的一個或多個攝像機、以及用于記錄從攝像機 接收的圖像的計算機，該方法包括激發(fā)熒光納米顆粒的熒光；利用攝像機和計算機檢測單獨的觀察點的成千的幀，每個點反映發(fā)熒光納米顆粒的 一個位置；通過一個物鏡和分光鏡將物體圖像投影在攝像機上；采用保存的幀計算接收到的每個熒光納米顆粒的圖像在保存的幀上的強度分布中心 的位置，其中在序列幀上具有不同位置，這些位置與發(fā)熒光納米顆粒的坐標相對應(yīng)；以 及利用不同攝像機檢測到的每個熒光納米顆粒的光強度分布的不同以高達幾納米的精 度執(zhí)行每個熒光納米顆粒的第三坐標的計算，由此重建物體的3D圖像，包括重建發(fā)熒光 納米顆粒在一定時間內(nèi)出現(xiàn)的所有位置，其顯示充滿液體的容積，不能存在顆粒的容積 被認為是充滿致密結(jié)構(gòu)或具有像納米顆粒一樣局部電荷的結(jié)構(gòu)；該過程具有的特點有物體各層的分子結(jié)構(gòu)距離玻璃不超過150納米距離的分辨率的 穩(wěn)定性，并根據(jù)物體結(jié)構(gòu)的靈活性提供更大距離的分辨率。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，還包括通過兩個或多個電極以一定電流 的電泳在不同方向調(diào)節(jié)熒光納米顆粒的運動。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，還包括通過同時采用具有正電荷的熒光納米顆粒、具有負電荷的納米顆粒和與結(jié)構(gòu)的局部 電荷作用并在物體的不同區(qū)域之間移動的中性納米顆?？疾煳矬w結(jié)構(gòu)的表面電荷。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，納米顆粒包括藻膽蛋白或熒光微球。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，還包括利用常規(guī)熒光顯微術(shù)或利用具有殘留熒光的幀檢測關(guān)鍵顆粒，其中關(guān)鍵顆粒是明亮 發(fā)光的熒光顆粒、與物體剛性相連的顆粒、被引入染色物體內(nèi)的顆粒；以及采用物體內(nèi)的至少一些關(guān)鍵顆粒計算熒光分子的坐標，考慮關(guān)鍵顆粒在可視區(qū)域的 運動得到達幾納米的分辨率，即使對于具有一定靈活性的物體結(jié)構(gòu)的物體。
17.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，還包括采用分色鏡和兩個或多個攝像機檢測超過一個波長下發(fā)熒光的納米顆粒；以及 重建在物體中幾個不同類型的發(fā)熒光顆粒的位置；或 檢測同時看到和檢測到的單獨的發(fā)熒光顆粒的擴大數(shù)量；或 重建物體結(jié)構(gòu)的局部電荷。
18.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，還包括采用分光鏡和兩個攝像機，它們定位成使得物體的兩個相鄰聚焦平面通過一個物鏡 得到投影；獲得每個熒光顆粒的兩個不同的光強度分布，它們各自由一個攝像機檢測；以及 利用兩個強度分布之間的差異計算第三坐標以形成物體的3D圖像。
19.一種熒光顯微鏡-納米顯示器裝置，包括裝有一個或多個攝像機和濾色器用于采集染色物體熒光的熒光顯微鏡，所述攝像 機能夠以較低的噪聲級檢測單獨的激發(fā)的熒光納米顆粒的圖像的幀、物體結(jié)構(gòu)之間的移 動、和/或與物體結(jié)構(gòu)剛性相連的發(fā)熒光分子；激發(fā)部件，其用于進一步激勵新產(chǎn)生的熒光分子和/或發(fā)熒光納米顆粒；以及 具有軟件的計算機，其被用于利用幀采集時間同步不同類型的照明，用于計算熒光 分子和納米顆粒的坐標以及用于形成物體的2D或3D圖像。
20.如權(quán)利要求19所述的裝置，其特征在于，還包括通過化學(xué)反應(yīng)或物理效應(yīng)將觀察 區(qū)域中的至少幾百個非熒光染色分子周期性轉(zhuǎn)化成熒光染色分子的發(fā)生部件。
21.如權(quán)利要求20所述的裝置，其特征在于，發(fā)生部件包括用于在物體中產(chǎn)生新熒光 分子的閃光燈或UV閃光燈。
22.如權(quán)利要求19所述的裝置，其特征在于，還包括用于利用電流在不同方向?qū)Πl(fā)熒光納米顆粒進行電泳的電泳裝置，其包括兩個或多 個電極，所述顯微鏡還包括用于記錄從攝像機接收的圖像的可記錄介質(zhì)。
23.如權(quán)利要求19所述的裝置，其特征在于，還包括分光鏡和兩個攝像機，它們定位成使得物體的兩個相鄰聚焦平面通過一個物鏡被投影在兩個攝像機上，其中兩個攝像機中的每個檢測每個熒光顆粒和/或分子的不同光強 度分布；以及用于利用兩個攝像機檢測到的強度分布之間的差異計算第三坐標以及用于形成物體 的3D圖像的軟件。
24.如權(quán)利要求19所述的裝置，其特征在于，還包括用于在不同攝像機上檢測不同波 長下發(fā)熒光的分子的分色鏡和兩個或多個攝像機。
25.如權(quán)利要求19所述的裝置，其特征在于，還包括用于通過物鏡、通過對物透鏡在 最大深度上或在總的內(nèi)部反射角下激發(fā)物體中的熒光的激光器。
全文摘要
本發(fā)明涉及借助熒光顯微鏡對由熒光著色劑染色的物體實施分析。顯微鏡包括用于使樣本圖像可視化并將其投射到攝像機上的光學(xué)系統(tǒng)、用于記錄和處理圖像的計算機、布置在樣本透鏡前面的樣本保持器以及熒光放射源。單獨熒光可視的分子和納米顆粒在物體不同的部分周期性的形成。激光產(chǎn)生的振蕩足以記錄所述分子和納米顆粒的非重疊圖形并使已經(jīng)得到記錄的熒光分子脫色。所記錄的單個分子和納米顆粒圖像的畫面通過計算機進行處理，以研究應(yīng)變中心的坐標并根據(jù)與各個熒光分子和納米顆粒的坐標相對應(yīng)的應(yīng)變中心的計算坐標建立物體圖像。所述本發(fā)明可以獲得分辨率大于20納米的二維和三維圖像并通過用不同的著色劑使蛋白質(zhì)、核酸和脂類染色來記錄彩色圖像。
文檔編號G01N21/64GK102023148SQ20101050833
公開日2011年4月20日 申請日期2006年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月18日
發(fā)明者葉夫根尼·安德烈耶維奇·克利莫夫, 塔蒂阿娜·維塔利耶夫娜·克利莫夫, 安德烈·阿萊克謝耶維奇·克利莫夫, 德米特里·安德烈耶維奇·克利莫夫 申請人:安德烈·阿萊克謝耶維奇·克利莫夫