專利名稱：一種單細(xì)胞或組織微粒懸液的制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種使用方便、檢測(cè)方法準(zhǔn)確性高的單 細(xì)胞或組織微粒懸液的制備方法及用途。
背景技術(shù)：
免疫組織化學(xué)、原位雜交及熒光原位雜交在病理工作中應(yīng)用越來越普遍，對(duì)部分 病變的良惡性和組織細(xì)胞性質(zhì)的確定、以及為放療、化療、抗激素治療、新近發(fā)展起來的靶 向治療、新輔助化療提供指標(biāo)等都有重要作用。然而其質(zhì)量影響因素較多以及原有陽性對(duì) 照方法麻煩對(duì)很多缺乏有自身陽性對(duì)照的病變，結(jié)果的判斷缺乏保障，導(dǎo)致診斷、治療的 不恰當(dāng)，由此帶來的醫(yī)療糾紛也不斷上升。國外有人試用過蛋白質(zhì)多肽作為陽性對(duì)照，但因 其沒有特定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)也就難以發(fā)揮作用。國內(nèi)有人介紹因闌尾含有多種組織和細(xì)胞，可 作為多種抗原的對(duì)照，但極為局限。還有根據(jù)需要收集各種各樣的組織切成細(xì)絲包埋在一 起，然后連續(xù)切片備用；或類似于多組織切片用芯片儀將各種各樣的組織排列在一起進(jìn)行 連續(xù)切片備用。但這些介紹的方法操作繁瑣；備用片相互摩擦影響難以運(yùn)輸、保存，再用于 切片沒有保障；工作量增加較大，對(duì)照物體積大，試劑耗費(fèi)要增加一倍。由于存在以上多種 缺陷，病理技師難以接受這些做法，使得這些方法在實(shí)際工作中無法推廣應(yīng)用。建立對(duì)照的 傳統(tǒng)做法是一組檢測(cè)片只能通過切片方法設(shè)立一張陽性對(duì)照片作為對(duì)照，但是無論是機(jī)器 操作還是手工操作均不能保證每張玻片的檢測(cè)條件一致，如每一步驟的時(shí)間、試劑的用量、 效價(jià)程度或其它人為因素等均存在差異，都會(huì)造成部分結(jié)果的準(zhǔn)確性很難判斷。目前在我 國不設(shè)立陽性對(duì)照是普遍存在的現(xiàn)象，也是不符合質(zhì)量控制要求的。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)操作過程簡(jiǎn) 單，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高的單細(xì)胞或組織微粒懸液的制備方法及用途。所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液，其特征在于其制備方法如下步驟
1)切取并收集對(duì)照目標(biāo)物豐富的組織，用10%中性福爾馬林固定液固定，或直接收集 留存已經(jīng)確定有某些特定抗原、抗體標(biāo)記陽性的用福爾馬林固定液及時(shí)固定后的組織備 用；
2)將步驟1)得到的組織切成為2mm-10mm的小塊，放入打碎器中，加入緩沖液進(jìn)行打 碎l-2min，所述的組織與緩沖液的體積比為1 :1_100，棄去組織殘?jiān)?，得到含單?xì)胞或組織 微粒的緩沖液；
3)將步驟2)中得到的含單細(xì)胞或組織微粒的緩沖液過濾，100-400目篩網(wǎng)過篩去除過 大細(xì)胞，再放入離心機(jī)中以2000-3000r/min的速度離心5-15min，棄去上層清液，向下層單 細(xì)胞或組織微粒中加入與其體積比為1 :1_5的緩沖液，充分震蕩后浸泡l_3h，離心棄去上 層清液，重復(fù)操作3-5次，直至無福爾馬林氣味溢出為止，得到洗凈的單細(xì)胞或組織微粒；
4)將步驟3)得到的單細(xì)胞或組織微粒放入保存液中保存，得到單細(xì)胞或組織微粒懸液，并進(jìn)行涂片按常規(guī)免疫組織化學(xué)方法確定陽性細(xì)胞所占比例，所述的單細(xì)胞或組織微 粒與保存液的體積比為ι :1-3，所述的保存液的制備取0. 05-0. lmol/L、PH為7. 4的三羥 甲基氨基甲烷100ml，加溫到60-70°C，加入優(yōu)質(zhì)明膠50_100mg，攪拌溶解后，冷卻至室溫， 加入0. 1-0. 8g牛血清白蛋白，加入NaN3200mg溶解后過濾制成。所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液，其特征在于所述的緩沖液為含0. 02%NaN3的 磷酸緩沖液、生理鹽水或Tris緩沖液。所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液，其特征在于步驟2)所述的打碎器可為組織細(xì) 胞分離器，也可為豆?jié){機(jī)，用組織細(xì)胞分離器打碎時(shí)，組織切成2mm-3mm的小塊，用豆?jié){機(jī) 打碎時(shí)，組織切成3mm-10mm的小塊。所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液，其特征在于步驟2)所述的緩沖液加入體積為 組織體積的3-50倍，打碎時(shí)間Imin。所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液，其特征在于步驟3)所述的離心時(shí)間為 8-10min，優(yōu)選時(shí)間為10 min。所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液，其特征在于步驟3)所述的浸泡時(shí)間為2h。所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液，其特征在于步驟4)所述的單細(xì)胞或組織微粒 可以將處理后的不同微生物、不同腫瘤細(xì)胞、不同體細(xì)胞按使用方便和商品化的需要進(jìn)行 組合為通用型的單細(xì)胞和組織微粒懸液。所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液的用途，其特征在于在免疫組織化學(xué)等待檢樣 本進(jìn)行組織切片后，在烤片過程中使用點(diǎn)涂器將對(duì)照用的單細(xì)胞或組織微粒懸液點(diǎn)涂在組 織附近，點(diǎn)涂面的最大徑為廣20mm，再在6(T8(TC烤片、抗原熱修復(fù)，或酶消化、DNA變性等 處理，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色或原位雜交、熒光原位雜交，當(dāng)對(duì)照物中著色的陽性細(xì)胞定位 清楚和陰性細(xì)胞背景干凈，說明抗體和免疫組織化學(xué)方法可靠，待檢切片中的陽性或陰性 結(jié)果也可靠；應(yīng)該陽性的抗體在對(duì)照物中為陰性，說明切片的陰性結(jié)果為假陰性；對(duì)應(yīng)該 細(xì)胞核陽性的抗體在對(duì)照物中為細(xì)胞漿或細(xì)胞膜著色，說明抗體滴加或免疫組織化學(xué)方法 有問題；對(duì)照物中沒有很好的陰性細(xì)胞，說明切片的陽性結(jié)果為假陽性。所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液的用途，其特征在于還可以根據(jù)顯色陽性細(xì)胞 數(shù)占理論陽性細(xì)胞數(shù)的比例判斷待測(cè)樣本中的實(shí)際陽性細(xì)胞數(shù)。所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液的用途，其特征在于所述的對(duì)照方法為內(nèi)組合 式對(duì)照或外組合式對(duì)照。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明存在如下有益效果
1)本發(fā)明通過將多種具有陽性對(duì)照意義或一種細(xì)胞具有多種陽性對(duì)照意義的單細(xì)胞 或組織微粒懸液進(jìn)行組合達(dá)到有效的濃度，只要點(diǎn)一點(diǎn)于玻片上便可以成為“斑點(diǎn)式”對(duì)照 物，不需要對(duì)對(duì)照物進(jìn)行切片，簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟；
2)本發(fā)明制備的單細(xì)胞或組織微粒懸液通過等同原理還可以用于原位雜交、FISH技術(shù) 及一些病原體的染色，運(yùn)用范圍廣；
3)本發(fā)明制備的單細(xì)胞或組織微粒懸液保存方便、易于長(zhǎng)期保存、可反復(fù)使用；
4)本發(fā)明制備的單細(xì)胞或組織微粒懸液使用時(shí)操作方便，步驟少，節(jié)省時(shí)間，而且可以 避免假陽性、假 陰性結(jié)果，確保了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，便于推廣、普及，有望全面輕松解決免 疫組織化學(xué)等原位檢測(cè)方法質(zhì)量控制對(duì)照問題。
具體實(shí)施例方式以下 結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述
一種單細(xì)胞或組織微粒懸液，由以下步驟制備而成1)先切取并收集對(duì)照目標(biāo)物豐富 的組織，用10%中性福爾馬林固定液固定，或直接收集留存已經(jīng)確定有某些特定抗原、抗 體標(biāo)記陽性的用福爾馬林固定液及時(shí)固定后的組織；2)把組織切成為2mm-10mm的小塊， 放入打碎器中，加入體積為組織體積1-100倍的含0. 02%NaN3的磷酸緩沖液、生理鹽水或 Tris緩沖液，進(jìn)行打碎l-2min，棄去組織殘?jiān)玫胶瑔渭?xì)胞或組織微粒的緩沖液，組織與 緩沖液優(yōu)選體積比為1 :3-50，優(yōu)選打碎時(shí)間lmin，所述的打碎器可為Medimachine組織細(xì) 胞分離器、豆?jié){機(jī)或多功能攪拌機(jī)等，用Medimachine組織細(xì)胞分離器打碎時(shí)，組織切成為 2mm-3mm的小塊，優(yōu)選為2mm小塊，用豆?jié){機(jī)或多功能攪拌機(jī)打碎時(shí)，組織切成為3mm-10mm 的小塊，打碎方式最好選用點(diǎn)動(dòng)法，即間歇式打碎；3)將上述緩沖液過濾，100-400目篩網(wǎng) 過濾除去過大的組織塊和細(xì)胞碎屑，如果沒有大細(xì)胞也可以不經(jīng)過濾這一步，再放入離心 機(jī)中以2000-3000r/min的速度離心5-15min，棄去上層清液，向下層單細(xì)胞或組織微粒 中加入與其體積比為1 :1_5的緩沖液，充分震蕩后浸泡l_3h，離心棄去上層清液，重復(fù)操 作3-5次，直至無福爾馬林氣味溢出為止，得到洗凈的單細(xì)胞或組織微粒，優(yōu)選離心時(shí)間 為8-lOmin，最優(yōu)為10 min，優(yōu)選浸泡時(shí)間為2h，所述的磷酸緩沖液也可不含NaN3成分；4) 將上述的單細(xì)胞或組織微粒放入保存液中保存，得到單細(xì)胞或組織微粒懸液，并進(jìn)行涂片 按常規(guī)免疫組織化學(xué)方法確定陽性細(xì)胞所占比例，所述的單細(xì)胞或組織微粒與保存液的體 積比為1 :1_3，所述的保存液的制備取0.05-0. lmol/L、PH為7. 4的三羥甲基氨基甲烷 100ml，加溫到60-70°C，加入優(yōu)質(zhì)明膠50-100mg，攪拌溶解后，冷卻至室溫，加入0. 1-0. 8g 牛血清白蛋白，加入NaN3200mg溶解后過濾制成。所述的單細(xì)胞或組織微?？梢詫⑻幚砗?的不同微生物、不同腫瘤細(xì)胞、不同體細(xì)胞按使用方便和商品化的需要進(jìn)行組合為通用型 的單細(xì)胞和組織微粒懸液。本發(fā)明的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液的用途，在免疫組織化學(xué)等待檢樣本進(jìn)行組 織切片后，在烤片過程中使用點(diǎn)涂器將對(duì)照用的單細(xì)胞或組織微粒懸液點(diǎn)涂在組織附近， 點(diǎn)涂面的最大徑為廣20mm，再在6(T80°C烤片、抗原熱修復(fù)，或酶消化、DNA變性等處理，進(jìn) 行免疫組織化學(xué)染色或原位雜交、熒光原位雜交，將染色結(jié)果進(jìn)行對(duì)照當(dāng)對(duì)照物中著色的 陽性細(xì)胞定位清楚和陰性細(xì)胞背景干凈，說明抗體滴加和免疫組織化學(xué)方法可靠，待檢切 片中的陽性或陰性結(jié)果也可靠；應(yīng)該陽性的抗體在對(duì)照物中為陰性，說明切片的陰性結(jié)果 為假陰性；應(yīng)該細(xì)胞核陽性的抗體在對(duì)照物中為細(xì)胞漿或細(xì)胞膜著色，說明抗體滴加或免 疫組織化學(xué)方法有問題；對(duì)照物中沒有很好的陰性細(xì)胞，說明切片的陽性結(jié)果為假陽性。本 發(fā)明還可以根據(jù)顯色陽性細(xì)胞數(shù)占理論陽性細(xì)胞數(shù)的比例判斷待測(cè)樣本中的實(shí)際陽性細(xì) 胞數(shù)，看是否存在偏差。上述的對(duì)照方法為內(nèi)組合式對(duì)照或外組合式對(duì)照，所述的內(nèi)組合式對(duì)照，是指按 需要將不同的細(xì)胞或組織微粒組合后構(gòu)成單細(xì)胞或組織微粒懸液再點(diǎn)涂式對(duì)照，即單細(xì)胞 或組織微粒中含有多種不同類型的細(xì)胞，點(diǎn)一點(diǎn)就可以對(duì)照多種待測(cè)樣品，所述的外組合 式對(duì)照，將含有需要的不同的單細(xì)胞懸液分別點(diǎn)涂，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行對(duì)照。本發(fā)明通過將不 同的單細(xì)胞或組織微粒混合構(gòu)成組合式、通用型的單細(xì)胞或組織微粒懸液，可以發(fā)揮多用途的適用于多種對(duì)照對(duì)象，減少陽性對(duì)照試劑的種類，建立對(duì)照時(shí)不需要從紛繁的試劑中 去選擇，以免給使用者帶來新的麻煩，或出錯(cuò)。本發(fā)明在選取組織時(shí)，采用已固定的組織制作單細(xì)胞或組織微粒，這樣不僅細(xì)胞 或組織微粒的形態(tài)在制作過程中變形小，而且也不需要進(jìn)行酶的消化處理，本發(fā)明還可選 擇脫落細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞制作單細(xì)胞或組織微粒。選用腫瘤組織時(shí)，可以選擇上皮性、間葉 性，也可以是淋巴造血組織腫瘤，最好是惡性腫瘤，因?yàn)槠鋵?shí)質(zhì)細(xì)胞黏附性差，容易成為單 細(xì)胞或組織微粒，也可以利用相關(guān)細(xì)胞系的培養(yǎng)物。有利用價(jià)值的病原體的樣本可以為結(jié) 核、人乳頭瘤病毒(HPV)、EB病毒、幽門螺桿菌(HP)等感染的組織或培養(yǎng) 物。如針對(duì)乳腺可 選擇ER + ,PR +、AR +、GCDFP-15 +或c-erbB_2 +的乳腺癌組織(它們也可作為CK、CK5/6、 CK7、CK8、CK18、CK34 β Ε12、E-cadherin、Ki_67、P53、Topo II、PCAN、SMA, Calponin、P63、 CD34、CD31、CycIinDl等抗體的陽性對(duì)照組織)，還可選用Her2蛋白(c-erbB_2)表達(dá)+、++、 +++組織或細(xì)胞樣本。在組織打碎時(shí)選用的打碎器，當(dāng)組織樣本量較少時(shí)可選用Medimachine組織細(xì)胞 分離器，組織塊要切成約2mm的小塊，一次切割時(shí)間不超過2分鐘為宜；樣本量多時(shí)最好 選用有200 μ m孔徑濾網(wǎng)的豆?jié){機(jī)或多功能攪拌機(jī)，最好采用點(diǎn)動(dòng)，此時(shí)組織塊可以大一些 3mm-10mm，但明顯的脂肪和纖維組織要盡量去除，豆?jié){機(jī)或多功能攪拌機(jī)的刀刃不要過于 鋒利，要有切刮的作用就行，打碎之后緩沖液渾濁時(shí)及時(shí)收集，大的殘?jiān)蛩槠跒V網(wǎng)內(nèi)， 富含單細(xì)胞或組織微粒的緩沖液，在單細(xì)胞或組織微粒收集孔和篩網(wǎng)外，反復(fù)重新添加緩 沖液和新組織如前操作，在將組織放入機(jī)器中，加入足夠的緩沖液，以保證單細(xì)胞或組織微 粒是在液體中從組織上分離下來，并隨即進(jìn)入液體中以減少擠壓變形的影響。因?yàn)榍腥〕鰜淼慕M織經(jīng)福爾馬林浸泡過，在制成懸液之前要先用大量的緩沖液進(jìn) 行多次充分洗滌，除去夾雜在組織里面的福爾馬林，此過程中單細(xì)胞或組織微粒需過夜或 來不及及時(shí)進(jìn)行下一次清洗可在足量的緩沖液中于4°C冰箱中臨時(shí)存放。制成單細(xì)胞或組 織微粒懸液時(shí)，要對(duì)單細(xì)胞或組織微粒進(jìn)行普通涂片觀察其形態(tài)，注意有無過大細(xì)胞團(tuán)、過 多細(xì)胞碎屑，并進(jìn)行相關(guān)免疫組織化學(xué)，與來源組織切片進(jìn)行比較，確定效果是否滿意，即 判斷單細(xì)胞或組織微粒的陽性部位或陽性強(qiáng)度與來源組織切片是否相互應(yīng)證，陽性部位相 同、陽性強(qiáng)度一致說明該單細(xì)胞或組織微粒懸液制作成功，所述的陽性部位是指細(xì)胞膜、細(xì) 胞核、細(xì)胞漿或特定細(xì)胞器所在部位。本發(fā)明的單細(xì)胞或組織微粒懸液在4°C冰箱內(nèi)可長(zhǎng)期存放，不變質(zhì)，但如果用作 ER、ra對(duì)照，必須用半年內(nèi)制作的單細(xì)胞或組織微粒；其余均可一年以上，用作抗酸染色對(duì) 照的可五年以上。所述的單細(xì)胞和組織微粒的濃度加離心后下沉細(xì)胞體積的1-3倍的緩沖 液稀釋混勻即可，也可用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞的濃度等待組合，最好在組合后確定陽性細(xì) 胞所占的比例范圍，保證用于對(duì)照的陽性細(xì)胞要每中倍視野(20倍視野)有50個(gè)以上，可含 有一定量的組織微粒。本發(fā)明在組合時(shí)可將不同組織具有不同抗原性的細(xì)胞進(jìn)行搭配，可按基本大類來 分，如CK系列、CD系列、激素受體及靶向治療系列等；也可按組織、器官，或腫瘤大類來分。 根據(jù)點(diǎn)涂對(duì)照物的面積中各細(xì)胞的有效數(shù)量，組合成可直接使用的通用式的組合式單細(xì)胞 懸液對(duì)照物。還可按膜、漿、核陽性設(shè)立點(diǎn)外獨(dú)立陽性、陰性組合式對(duì)照，也可將微生物與細(xì) 胞進(jìn)行組合。
本發(fā)明所用的點(diǎn)涂器具，可以用專用盛放對(duì)照用細(xì)胞試劑組合器具，配以排式點(diǎn) 涂器具，如吸水的棉簽、竹簽、吸管、液體張力環(huán)、瓶口可形成張力膜的瓶、轉(zhuǎn)移液體膜式滴 瓶、排槍、排筆等。
對(duì)照物中總會(huì)有陰性的細(xì)胞存在。細(xì)胞的形態(tài)完全可以滿足對(duì)照觀察的要求。對(duì) 照物中著色的陽性細(xì)胞定位清楚和陰性細(xì)胞背景干凈，說明抗體和免疫組織化學(xué)方法可 靠，待檢切片中的陽性或陰性結(jié)果也可靠；如果應(yīng)該陽性的抗體在對(duì)照物中為陰性，說明切 片的陰性結(jié)果為假陰性；對(duì)應(yīng)該細(xì)胞核陽性的抗體在對(duì)照物中為細(xì)胞漿著色，說明抗體或 免疫組織化學(xué)方法有問題；對(duì)照物中沒有很好的陰性細(xì)胞，說明切片的陽性結(jié)果為假陽性。 還可以根據(jù)顯色陽性細(xì)胞數(shù)占理論陽性細(xì)胞數(shù)的比例判斷是否存在偏差，可大概估算待測(cè) 樣本中的實(shí)際陽性細(xì)胞數(shù)，如對(duì)照樣中理論陽性細(xì)胞數(shù)30個(gè)，而試驗(yàn)檢測(cè)出為20個(gè)，說明 有存在偏差，試驗(yàn)的陽性細(xì)胞數(shù)占總陽性細(xì)胞數(shù)的2/3，而根據(jù)試驗(yàn)中待測(cè)樣本的陽細(xì)胞數(shù) 乘以1.5倍即為實(shí)際待測(cè)樣品的陽細(xì)胞數(shù)，有定量檢測(cè)的作用。該方法針對(duì)最迫切需要解決的免疫組織化學(xué)、原位雜交等組織、細(xì)胞等原位檢測(cè) 對(duì)照問題，將多種具有陽性對(duì)照意義及一種細(xì)胞具有多種陽性對(duì)照意義的單細(xì)胞懸液進(jìn)行 組合達(dá)到有效的濃度，只要點(diǎn)一點(diǎn)于玻片上便可以成為“斑點(diǎn)式”對(duì)照物，與切片一起進(jìn)行 免疫組織化學(xué)染色，不需要對(duì)對(duì)照物進(jìn)行切片，完全改變了傳統(tǒng)的做法，易于長(zhǎng)期保存、反 復(fù)使用，便于推廣、普及，有望全面輕松解決免疫組織化學(xué)等原位檢測(cè)等質(zhì)量控制對(duì)照問 題。組合式單細(xì)胞懸液作為對(duì)照的方法還可以用于原位雜交、FISH技術(shù)及一些病原體的染 色。
權(quán)利要求
一種單細(xì)胞或組織微粒懸液，其特征在于其制備方法如下步驟1)切取并收集對(duì)照目標(biāo)物豐富的組織，用10%中性福爾馬林固定液固定，或直接收集留存已經(jīng)確定有某些特定抗原、抗體標(biāo)記陽性的用福爾馬林固定液及時(shí)固定后的組織備用；2)將步驟1)得到的組織切成為2mm 10mm的小塊，放入打碎器中，加入緩沖液進(jìn)行打碎1 2min，所述的組織與緩沖液的體積比為11 100，棄去組織殘?jiān)?，得到含單?xì)胞或組織微粒的緩沖液；3)將步驟2)中得到的含單細(xì)胞或組織微粒的緩沖液過濾，100 400目篩網(wǎng)過篩去除過大細(xì)胞，再放入離心機(jī)中以2000 3000r/min的速度離心5 15min，棄去上層清液，向下層單細(xì)胞或組織微粒中加入與其體積比為11 5的緩沖液，充分震蕩后浸泡1 3h，離心棄去上層清液，重復(fù)操作3 5次，直至無福爾馬林氣味溢出為止，得到洗凈的單細(xì)胞或組織微粒；4)將步驟3)得到的單細(xì)胞或組織微粒放入保存液中保存，得到單細(xì)胞或組織微粒懸液，并進(jìn)行涂片按常規(guī)免疫組織化學(xué)方法確定陽性細(xì)胞所占比例，所述的單細(xì)胞或組織微粒與保存液的體積比為11 3，所述的保存液的制備取0.05 0.1mol/L 、PH為7.4的三羥甲基氨基甲烷100ml，加溫到60 70℃，加入優(yōu)質(zhì)明膠50 100mg，攪拌溶解后，冷卻至室溫，加入0.1 0.8g牛血清白蛋白，加入NaN3200mg溶解后過濾制成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液，其特征在于所述的緩沖液為含 0. 02%NaN3的磷酸緩沖液、生理鹽水或Tris緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液，其特征在于步驟2)所述的打碎 器可為組織細(xì)胞分離器，也可為豆?jié){機(jī)，用組織細(xì)胞分離器打碎時(shí)，組織切成2mm-3mm的小 塊，用豆?jié){機(jī)打碎時(shí)，組織切成3mm-10mm的小塊。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液，其特征在于步驟2)所述的緩沖 液加入體積為組織體積的3-50倍，打碎時(shí)間lmin。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液，其特征在于步驟3)所述的離心 時(shí)間為8-10min，優(yōu)選為10 min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液，其特征在于步驟3)所述的浸泡 時(shí)間為2h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液，其特征在于步驟4)所述的單細(xì) 胞或組織微?？梢詫⑻幚砗蟮牟煌⑸铩⒉煌[瘤細(xì)胞、不同體細(xì)胞按使用方便和商品 化的需要進(jìn)行組合為通用型的單細(xì)胞和組織微粒懸液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液的用途，其特征在于在免疫組織 化學(xué)等待檢樣本進(jìn)行組織切片后，在烤片過程中使用點(diǎn)涂器將對(duì)照用的單細(xì)胞或組織微粒 懸液點(diǎn)涂在組織附近，點(diǎn)涂面的最大徑為廣20mm，再在6(T8(TC烤片、抗原熱修復(fù)，或酶消 化、DNA變性等處理，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色或原位雜交、熒光原位雜交，當(dāng)對(duì)照物中著色的 陽性細(xì)胞定位清楚和陰性細(xì)胞背景干凈，說明抗體和免疫組織化學(xué)方法可靠，待檢切片中 的陽性或陰性結(jié)果也可靠；應(yīng)該陽性的抗體在對(duì)照物中為陰性，說明切片的陰性結(jié)果為假 陰性；對(duì)應(yīng)該細(xì)胞核陽性的抗體在對(duì)照物中為細(xì)胞漿或細(xì)胞膜著色，說明抗體滴加或免疫 組織化學(xué)方法有問題；對(duì)照物中沒有很好的陰性細(xì)胞，說明切片的陽性結(jié)果為假陽性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液的用途，其特征在于還可以根據(jù)2顯色陽性細(xì)胞數(shù)占理論陽性細(xì)胞數(shù)的比例判斷待測(cè)樣本中的實(shí)際陽性細(xì)胞數(shù)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種單細(xì)胞或組織微粒懸液的用途，其特征在于所述的對(duì) 照方法為內(nèi)組合式對(duì)照或外組合式對(duì)照。
全文摘要
一種單細(xì)胞或組織微粒懸液，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。它由下列步驟制備而成1)組織樣品的收集；2)單細(xì)胞或組織微粒的緩沖液制作；3)單細(xì)胞或組織微粒的緩沖液洗滌；4)單細(xì)胞或組織微粒懸液的制備。本發(fā)明通過將多種具有陽性對(duì)照意義的單細(xì)胞或組織微?；蛞环N具有多種陽性對(duì)照意義的單細(xì)胞或組織微粒進(jìn)行組合，只要點(diǎn)一點(diǎn)該懸液即可作為對(duì)照物，不需要進(jìn)行切片，簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟；還可以用于原位雜交、FISH技術(shù)及一些病原體的染色，運(yùn)用范圍廣；單細(xì)胞或組織微粒懸液保存方便、易于長(zhǎng)期保存、可反復(fù)使用；確保了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，便于推廣、普及，有望全面輕松解決免疫組織化學(xué)等原位檢測(cè)方法質(zhì)量控制對(duì)照問題。
文檔編號(hào)G01N1/30GK101957282SQ20101051272
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月20日
發(fā)明者任興昌, 劉衛(wèi)艷 申請(qǐng)人:杭州市中醫(yī)院