專利名稱：殼聚糖-量子點熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米材料用于標(biāo)記生物及生物體系的分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及 一種殼聚糖-量子點熒光探針用于狗腎細(xì)胞標(biāo)記的方法，通過對細(xì)胞組分以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu) 的標(biāo)記，可以用于的細(xì)胞的生理活動研究，也可用于細(xì)胞內(nèi)外各類受體的運輸途徑研究及 外源性污染物與細(xì)胞相互作用的研究。
背景技術(shù)：
殼聚糖是由甲殼素脫去乙?；漠a(chǎn)物，其大分子鏈上分布著許多羥基和氨基。殼 聚糖除具有多功能性、生物相容性、生物降解性，和低細(xì)胞毒性等優(yōu)越性之外，還具有獨特 的跨細(xì)胞膜能力。但是由于殼聚糖只溶于稀酸和某些特定的溶劑，大大限制了它的應(yīng)用。羧 甲基殼聚糖是殼聚糖經(jīng)羧甲基化反應(yīng)后的形成的一類甲殼素衍生物，由于羧甲基殼聚糖上 所含的-C00-降低了 -NH3+的電荷密度，使得羧甲基殼聚糖的細(xì)胞毒性降低，具有比殼聚糖 更好的細(xì)胞相容性；并且由于羧甲基殼聚糖溶于水，擴展了它的應(yīng)用范圍。量子點(Quantum dots, QDs) 又稱半導(dǎo)體納米微晶體(Semiconductor nanocrystals)，是半徑小于或接近于激子玻爾半徑的一類半導(dǎo)體納米粒子。量子點具有一 般納米微粒的基本性質(zhì)如表面效應(yīng)、體積效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)，具有寬的激發(fā)光譜、窄的發(fā) 射光譜、可精確調(diào)諧的發(fā)射波長、可忽略的光漂白等優(yōu)越的熒光特性。正是基于量子點獨特 的光學(xué)性質(zhì)使得它在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因組學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)等研究 中有著極大的應(yīng)用前景。但是作為一種納米材料，由于自身的物理化學(xué)性質(zhì)和環(huán)境因素的 影響，量子點在應(yīng)用的過程中也表現(xiàn)出了一定的生物毒性效應(yīng)，如何提高量子點熒光探針 的穩(wěn)定性和生物相容性是目前迫切需要解決的問題。狗腎細(xì)胞通常用于流感病毒的分離與鑒定，1958年從正常的雄性考克斯班尼犬的 腎臟建立了該細(xì)胞系。該細(xì)胞系是一種小犬腎細(xì)胞，其特點是細(xì)胞匯合后表達(dá)分化的上皮 細(xì)胞特性，易于培養(yǎng)和傳代。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對目前各類量子點熒光探針在應(yīng)用上的缺陷，提供了一種殼 聚糖_量子點熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞的方法，把羧甲基殼聚糖良好的細(xì)胞相容性和量子點 優(yōu)越的熒光性能結(jié)合起來，利用它們在水相通過自組裝形成熒光探針，然后用于細(xì)胞標(biāo)記。 用熒光顯微鏡觀察狗腎細(xì)胞的標(biāo)記情況，用流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)皿中狗腎細(xì)胞的平均熒光 強度。本發(fā)明操作簡便，熒光效率高、生物相容性好、穩(wěn)定時間長，熒光探針無細(xì)胞毒性，可 用于細(xì)胞的長時間的觀測。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施
本發(fā)明的基本構(gòu)思是根據(jù)羧甲基殼聚糖和CdTe量子點自身的特性，在水相通過自組 裝形成殼聚糖_量子點熒光探針，將該熒光探針與狗腎細(xì)胞在DMEM營養(yǎng)液中、于37°C、5% 體積分?jǐn)?shù)的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(下同)中共同孵育，殼聚糖_量子點熒光探針通過狗腎細(xì)胞的
3胞飲、胞吞或吞噬等方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)結(jié)合，達(dá)到對狗腎細(xì)胞進(jìn)行熒光 標(biāo)記的目的?！N殼聚糖_量子點熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞的方法，包括如下步驟
1、配制0.0000025-0. 001mol/L的羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液(羧甲基殼聚 糖-CdTe量子點自制，制備的簡要過程如下=CdCl2溶液和巰基乙酸溶液混合均勻后用NaOH 溶液調(diào)整其PH值為堿性，再向該溶液中加入新制備的KTeH4溶液。將此混合液轉(zhuǎn)入聚四 氟乙烯微波消解罐，放入可控溫的微波加熱系統(tǒng)進(jìn)行加熱，反應(yīng)完成后待溶液冷卻至室溫 20-25°C，即可得到CdTe量子點溶液。根據(jù)微波加熱的溫度不同，CdTe量子點的熒光將 會由綠色逐漸變化為紅色。將不同顏色的CdTe量子點與羧甲基殼聚糖溶液混合反應(yīng)即 可生成相應(yīng)熒光的羧甲基殼聚糖-CdTe量子點熒光探針，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員不付出任 何創(chuàng)造性勞動均能制備)根據(jù)羧甲基殼聚糖-CdTe量子點的濃度，用移液管移取0.廣5ml 的羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液于滅菌的IOml容量瓶中，加入高純水(電阻率大于18 ΜΩ 定容，備用；所選用的殼聚糖-量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點 在水相反應(yīng)形成，具有良好的水溶性和生物相容性；
2、將T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中已長滿且生長狀態(tài)良好的狗腎細(xì)胞(MDCK)用0.05%體積比的 EDTA-胰蛋白酶消化為單細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞計數(shù)后取1 X IO4^l X IO7的狗腎細(xì)胞接種到到細(xì) 胞培養(yǎng)皿中，加入含10%體積比的胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液。在37°C、5%體積比的CO2細(xì)胞 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞正常貼壁生長繁育，得到用于實施標(biāo)記的狗腎細(xì)胞。3、待步驟2狗腎細(xì)胞貼壁生長12 36小時后，向培養(yǎng)皿中加入殼聚糖-量子點熒 光探針，于37°C、5%體積比的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中與細(xì)胞共同孵育6 48小時，即可得到帶有 熒光的狗腎細(xì)胞。棄去營養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖溶液(PH=7. 4)洗滌2次，即可用熒光顯微鏡 觀察標(biāo)記情況。所述的殼聚糖_量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜 電絡(luò)合、共價結(jié)合、螯合方式自組裝形成。所述的標(biāo)記的細(xì)胞為狗腎細(xì)胞。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果
本發(fā)明的殼聚糖-量子點熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞的方法操作簡便，細(xì)胞對熒光探 針的生物相容性好，熒光探針未顯示細(xì)胞毒性，標(biāo)記后細(xì)胞的平均熒光強度及顏色可控，穩(wěn) 定時間長，不影響細(xì)胞的正常生長。細(xì)胞能夠根據(jù)需要標(biāo)記為不同的顏色且細(xì)胞的熒光強 度穩(wěn)定。該方法可用于活細(xì)胞的較長時間(48小時)觀測及細(xì)胞的生理活動研究，也可用于 細(xì)胞內(nèi)外各類受體的運輸途徑研究及外源性污染物與細(xì)胞相互作用的研究。


圖IA為綠色殼聚糖_量子點熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞的熒光顯微鏡照片示意圖。圖IB為紅色殼聚糖_量子點熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞的熒光顯微鏡照片示意圖。圖2A為未標(biāo)記時狗腎細(xì)胞的生長狀況明場照片示意圖。圖2B為標(biāo)記12小時后狗腎細(xì)胞的生長狀況明場照片示意圖。圖2C為標(biāo)記24小時后狗腎細(xì)胞的生長狀況明場照片示意圖。圖2D為標(biāo)記48小時后狗腎細(xì)胞的生長狀況明場照片示意圖。
4
圖2E為殼聚糖_量子點熒光探針進(jìn)入狗腎細(xì)胞的不同階段(從1到4顯示的是熒 光探針剛進(jìn)入細(xì)胞到充滿整個細(xì)胞的過程)熒光照片示意圖。圖2F為殼聚糖_量子點熒光探針進(jìn)入狗腎細(xì)胞的不同階段(從1到4顯示的是熒 光探針剛進(jìn)入細(xì)胞到充滿整個細(xì)胞的過程)明場照片示意圖。圖3A為流式細(xì)胞儀檢測未標(biāo)記時狗腎細(xì)胞的平均熒光強度示意圖(陰性對照)。圖3B為流式細(xì)胞儀檢測用0. 00005mol/L的熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞后細(xì)胞的平均 熒光強度示意圖。圖3C為流式細(xì)胞儀檢測用0. 0001mol/L的熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞后細(xì)胞的平均
熒光強度示意圖。圖3D為流式細(xì)胞儀檢測用0. 00025mol/L的熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞后細(xì)胞的平均
熒光強度示意圖。圖3E為流式細(xì)胞儀檢測用0. 0005mol/L的熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞后細(xì)胞的平均
熒光強度示意圖。圖3F為流式細(xì)胞儀檢測用0. OOlmol/L的熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞后細(xì)胞的平均熒
光強度示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍，以下所述實施實例所用溶劑均為電阻率大于18 ΜΩ · cm的高純水，所用試劑均為分析純試劑。實施例1
一種殼聚糖_量子點熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞的方法，包括如下步驟 1.配制0. 0005mol/L的綠色和紅色羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液 分別用移液管移取2. 5mL0. 002mol/L的綠色和紅色羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液于 滅菌的IOmL容量瓶中，加入高純水(電阻率大于18 ΜΩ · cm)定容，備用。所選用的殼聚 糖_量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜電絡(luò)合、共價結(jié)合、螯 合作用等方式自組裝形成，具有良好的水溶性和生物相容性；(羧甲基殼聚糖-CdTe量子點 自制，制備的簡要過程如下=CdCl2溶液和巰基乙酸溶液混合均勻后用NaOH溶液調(diào)整其pH 值為堿性，再向該溶液中加入新制備的KTeH4溶液。將此混合液轉(zhuǎn)入聚四氟乙烯微波消解 罐，放入可控溫的微波加熱系統(tǒng)進(jìn)行加熱，反應(yīng)完成后待溶液冷卻至室溫20-25°C，即可得 到CdTe量子點溶液。根據(jù)微波加熱的溫度不同，CdTe量子點的熒光將會由綠色逐漸變化 為紅色。將不同顏色的CdTe量子點與羧甲基殼聚糖溶液混合反應(yīng)即可生成相應(yīng)熒光的羧 甲基殼聚糖-CdTe量子點熒光探針，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員不付出任何創(chuàng)造性勞動均能制
2.狗腎細(xì)胞的培養(yǎng)
將T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中已長滿且生長狀態(tài)良好的狗腎細(xì)胞(MDCK)用0. 05%EDTA-胰蛋白 酶消化為單細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞計數(shù)后取1 X IO6的狗腎細(xì)胞分別接種到2個細(xì)胞培養(yǎng)皿中， 加入含10%體積比的胎牛血清的DMEM(美國Gbico公司)營養(yǎng)液。在37°C、5%體積比的CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。得到用于實施熒光標(biāo)記的狗腎細(xì)胞。
3.羧甲基殼聚糖-CdTe量子點熒光探針對狗腎細(xì)胞的標(biāo)記
待步驟2所述的狗腎細(xì)胞貼壁生長18小時后，向培養(yǎng)皿中分別加入步驟1所述的綠色 和紅色殼聚糖_量子點熒光探針，于37°C、5%體積比的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中與細(xì)胞共同孵育， 24小時后棄去營養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液(pH=7. 4)洗滌2次，用熒光顯微鏡觀察標(biāo)記情況，結(jié) 果表明狗腎細(xì)胞已成功標(biāo)記上綠色和紅色熒光(見圖IA和圖1B)。所述的殼聚糖_量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜 電絡(luò)合、共價結(jié)合、螯合方式自組裝形成。所述的標(biāo)記的細(xì)胞為狗腎細(xì)胞。實施例2:
一種殼聚糖_量子點熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞的方法，其步驟如下
1.配制0.0001mol/L的的羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液
用移液管移取0. 5mL0. 002mol/L的黃綠色羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液于滅菌的 IOmL容量瓶中，加入高純水(電阻率大于18 M Ω · cm)定容，備用。所選用的殼聚糖-量子 點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜電絡(luò)合、共價結(jié)合、螯合作用等 方式自組裝形成，具有良好的水溶性和生物相容性；
2.狗腎細(xì)胞的培養(yǎng)
將T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中已長滿且生長狀態(tài)良好的狗腎細(xì)胞(MDCK)用0. 05%EDTA-胰蛋白 酶消化為單細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞計數(shù)后取1 X IO5的狗腎細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入含10% 胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液。在37°C、5%體積比的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到用于實施熒光 標(biāo)記的狗腎細(xì)胞。3.羧甲基殼聚糖-CdTe量子點熒光探針對狗腎細(xì)胞標(biāo)記后形態(tài)學(xué)觀察 待步驟2所述的狗腎細(xì)胞貼壁生長28小時后，向培養(yǎng)皿中加入步驟1所述的殼聚
糖_量子點熒光探針，于37°C、5%體積比的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中與細(xì)胞共同孵育。于0、12、 24,48小時用顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，結(jié)果表明標(biāo)記后的狗腎細(xì)胞在(Γ48小時的時間內(nèi) 均能正常貼壁生長，沒有出現(xiàn)溶脹、脫落及凋亡，說明細(xì)胞對熒光探針的生物相容性良好， 熒光探針未顯示細(xì)胞毒性(見圖2A、2B、2C、2D、2E、2F)。所述的殼聚糖_量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜 電絡(luò)合、共價結(jié)合、螯合方式自組裝形成。所述的標(biāo)記的細(xì)胞為狗腎細(xì)胞。其它步驟與實施例1相同。實施例3
一種殼聚糖_量子點熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞的方法，其步驟如下
1.配制0、0· 00005,0. 0001,0. 00025,0. 0005,0. 001mol/L 的的羧甲基殼聚糖-CdTe 量 子點溶液
用移液管移取0、0. 25,0. 5,1. 25,2. 5、5mL0. 002mol/L的黃綠色羧甲基殼聚糖-CdTe量 子點溶液于滅菌的IOmL容量瓶中，加入高純水(電阻率大于18 ΜΩ 定容，備用。所選 用的殼聚糖-量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜電絡(luò)合、共價 結(jié)合、螯合作用等方式自組裝形成，具有良好的水溶性和生物相容性；
2.狗腎細(xì)胞的培養(yǎng)
6將T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中已長滿且生長狀態(tài)良好的狗腎細(xì)胞(MDCK)用0. 05%EDTA-胰蛋白 酶消化為單細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞計數(shù)后取1 X IO7的狗腎細(xì)胞分別接種到6個細(xì)胞培養(yǎng)皿中， 加入含10%胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液。在37°C、5%體積比的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到用 于實施熒光標(biāo)記的狗腎細(xì)胞。3.羧甲基殼聚糖-CdTe量子點熒光探針對狗腎細(xì)胞標(biāo)記后細(xì)胞顯示不同的平均 熒光強度；
待步驟2所述的狗腎細(xì)胞貼壁生長24小時后，向培養(yǎng)皿中分別加入步驟1所述的殼 聚糖_量子點熒光探針，于37°C、5%體積比的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中與細(xì)胞共同孵育，同時做陰 性對照。24小時后棄去營養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液(pH=7. 4)洗滌2次，用0. 05%EDTA_胰蛋 白酶將培養(yǎng)皿上的細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸浮液，置于載玻片上用熒光顯微鏡觀察標(biāo)記情況， 同時用流式細(xì)胞儀檢測不同培養(yǎng)皿中狗腎細(xì)胞的平均熒光強度。結(jié)果表明狗腎細(xì)胞已成功 標(biāo)記上熒光，并顯示出不同的熒光強度，隨熒光探針濃度的增加，細(xì)胞平均熒光強度由50 a. u.變化到5000 a. u.(見圖3A、3B、3C、3D、3E、3F)，說明可以通過改變熒光探針的濃度來 控制標(biāo)記后細(xì)胞的熒光強度。所述的殼聚糖_量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜 電絡(luò)合、共價結(jié)合、螯合方式自組裝形成。所述的標(biāo)記的細(xì)胞為狗腎細(xì)胞。其它步驟與實施例1相同。
權(quán)利要求
一種殼聚糖 量子點熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞的方法，其步驟是A、配制0.0000025 0.001mol/L的羧甲基殼聚糖 CdTe量子點溶液根據(jù)羧甲基殼聚糖 CdTe量子點的濃度，用移液管移取0.1~5ml的羧甲基殼聚糖 CdTe量子點溶液于滅菌的10ml容量瓶中，加入高純水，電阻率大于 18 MΩ·cm，定容，備用；B、將T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中已長滿的狗腎細(xì)胞用0.05%體積比的EDTA 胰蛋白酶消化為單細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞計數(shù)后取1×104~1×107的狗腎細(xì)胞接種到到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入含10%體積比的胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液，在37℃、5%體積比的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞正常貼壁生長繁育，得到用于實施標(biāo)記的狗腎細(xì)胞；C、待步驟(B)狗腎細(xì)胞貼壁生長12~36小時后，向培養(yǎng)皿中加入殼聚糖 量子點熒光探針，于37℃、5%體積比的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中與細(xì)胞共同孵育6~48小時，得到帶有熒光的狗腎細(xì)胞，棄去營養(yǎng)液，用pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液洗滌2次，用熒光顯微鏡觀察標(biāo)記情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖_量子點熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞的方法，其特征 在于所述的殼聚糖-量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜電絡(luò) 合、共價結(jié)合、螯合方式自組裝形成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖_量子點熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞的方法，其特征 在于所述的標(biāo)記的細(xì)胞為狗腎細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖_量子點熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞的方法，其特征 在于所述的羧甲基殼聚糖-CdTe量子點制備過程如下，CdCl2溶液和巰基乙酸溶液混合 均勻后用NaOH溶液調(diào)整其pH值為堿性，再向該溶液中加入新制備的KTeH4溶液，將此混 合液轉(zhuǎn)入聚四氟乙烯微波消解罐，放入可控溫的微波加熱系統(tǒng)進(jìn)行加熱，反應(yīng)完成后待溶 液冷卻至室溫，得到CdTe量子點溶液，將其與羧甲基殼聚糖溶液混合反應(yīng)生成羧甲基殼聚 糖-CdTe量子點。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種殼聚糖-量子點熒光探針標(biāo)記狗腎細(xì)胞的方法，其步驟是A、配制羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液根據(jù)羧甲基殼聚糖-CdTe量子點的濃度，用移液管移取羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液于滅菌的容量瓶中，加入高純水定容；B、將T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中已長滿的狗腎細(xì)胞用EDTA-胰蛋白酶消化為單細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞計數(shù)后取狗腎細(xì)胞接種到到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入營養(yǎng)液，培養(yǎng)；C、待狗腎細(xì)胞貼壁生長后，向培養(yǎng)皿中加入殼聚糖-量子點熒光探針，與狗腎細(xì)胞共同孵育，得到已標(biāo)記上熒光的狗腎細(xì)胞。本發(fā)明操作簡便，熒光效率高、生物相容性好、穩(wěn)定時間長，熒光探針無細(xì)胞毒性，可用于細(xì)胞的長時間的觀測。
文檔編號G01N21/64GK101980005SQ201010512868
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月20日
發(fā)明者何振宇, 周培疆, 朱洪浩 申請人:武漢市疾病預(yù)防控制中心;武漢大學(xué)