專利名稱：利用離體葉片失綠進(jìn)程快速鑒定黃瓜耐鹽潛力的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)的植物檢測(cè)，是一種利用離體葉片失綠進(jìn)程快速鑒定黃瓜耐 鹽潛力的新方法。
背景技術(shù)：
黃瓜別名王瓜、胡瓜，葫蘆科甜瓜屬一年生攀援性草本植物。黃瓜是我國(guó)種植范圍 最廣，設(shè)施栽培面積最大的蔬菜作物之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著設(shè)施栽 培土壤鹽漬化的日益加重，給黃瓜的周年生產(chǎn)帶來巨大損失。因此，尋找簡(jiǎn)單易行的方法， 尤其是早期能進(jìn)行植物耐鹽性篩選的方法，以期加速黃瓜的耐鹽育種進(jìn)程。鹽脅迫影響了植物不同水平組織結(jié)構(gòu)的生理過程，包括植物器官、組織、細(xì)胞等。 植物對(duì)鹽脅迫的耐受是許多機(jī)制共同作用的結(jié)果，而且由于植物耐鹽的生理和組織結(jié)構(gòu)不 同，因此利用何種方法鑒定耐鹽植物十分困難。目前，植物耐鹽性的鑒定方法眾說不一，歸 納起來可分為直接鑒定法和間接鑒定法。直接鑒定是對(duì)植物在鹽漬條件下所受的直接傷害 程度進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)，主要有發(fā)芽率、死亡率、田間存活指數(shù)、產(chǎn)量和鹽害指標(biāo)等。間接鑒定 是是用生理生化分析手段研究作物在鹽漬條件下生理代謝過程中的物質(zhì)變化而進(jìn)行的耐 鹽性評(píng)價(jià)。主要的生理生化指標(biāo)有脯氨酸、細(xì)胞質(zhì)膜透性、葉綠素、酶活性、植物體內(nèi)K+/ Na+等等。在高鹽溶液環(huán)境中，鹽脅迫破壞了葉片葉綠體結(jié)構(gòu)，使葉綠素含量下降，同時(shí)高鹽 脅迫對(duì)葉片細(xì)胞造成嚴(yán)重的損害，甚至死亡，從而出現(xiàn)葉片失綠，逐漸變黃的現(xiàn)象。對(duì)黃瓜 而言，鹽脅迫對(duì)葉片細(xì)胞造成傷害，破壞葉片葉綠體結(jié)構(gòu)，從理論上講也會(huì)出現(xiàn)葉片失綠， 葉綠素含量降低。在相同的鹽脅迫環(huán)境中，耐鹽基因型的葉片失綠情況和不耐鹽的基因型 應(yīng)該有明顯的區(qū)別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用離體葉片失綠進(jìn)程快速鑒定黃瓜耐鹽 潛力的新方法。快速準(zhǔn)確地判斷基因型的耐鹽潛力，所需材料少，測(cè)定周期短，工作效率高。本發(fā)明的技術(shù)方案是—種用離體葉片失綠進(jìn)程快速鑒定黃瓜耐鹽潛力的新方法，其特征在于利用耐鹽能力不同的黃瓜基因型，其離體葉片在鹽溶液中的失綠進(jìn)程的差異；在 高鹽溶液中處理一定的時(shí)間，葉片的失綠情況，快速準(zhǔn)確地反映基因型的耐鹽能力；葉片失 綠程度大的，葉片細(xì)胞受損害嚴(yán)重，葉綠素含量低，耐鹽能力差；葉片失綠程度小的，葉片細(xì) 胞受損害較輕，葉綠素喪失速率慢，耐鹽能力強(qiáng)。所述的用離體葉片失綠進(jìn)程快速鑒定黃瓜耐鹽潛力的新方法選擇MS液體培養(yǎng) 基，添加化學(xué)純的NaCl，溶液濃度一般以200 400mM，處理時(shí)間3天；黃瓜葉片對(duì)鹽脅迫的 靈敏度在基因型之間有明顯差異。所述用離體葉片失綠進(jìn)程快速鑒定黃瓜耐鹽潛力的新方法
1)黃瓜葉片在高濃度氯化鈉環(huán)境中，葉片逐漸失綠變黃變褐，葉片細(xì)胞受害，葉綠 素含量逐漸降低，不同耐鹽能力的葉片失綠速率不同。2)將葉片剪成長(zhǎng)2cm，寬2cm的葉盤，置于含有200mM、300mM、400mM NaCl的MS培 養(yǎng)液中，3d后觀測(cè)葉盤失綠情況及葉綠素含量的變化，從而判斷耐鹽能力不同的黃瓜基因 型。在高鹽溶液中處理一定的時(shí)間，葉片失綠進(jìn)程能夠快速準(zhǔn)確地反映基因型的耐鹽能力。本發(fā)明效果是利用葉片失綠進(jìn)程鑒定技術(shù)，能夠準(zhǔn)確判斷基因型的耐鹽潛力，所需材料少，檢測(cè) 時(shí)間短，工作效率高，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。對(duì)其他植物耐鹽潛力的快速鑒定具有重要 參考價(jià)值。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)1.該技術(shù)體系以植物葉片的失綠進(jìn)程和葉綠素含 量的降低為依據(jù)，只需要少量的黃瓜葉片，通過較短的時(shí)間，迅速準(zhǔn)確地堅(jiān)定出植株的耐鹽 能力，具有效率高、重復(fù)性好、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)。2.根據(jù)葉片失綠進(jìn)程鑒定技術(shù)淘汰大量不 耐鹽的基因型，可以有效地壓縮田間試驗(yàn)的規(guī)模，節(jié)約人力、物力和時(shí)間，大幅度提高優(yōu)良 耐鹽基因型的篩選效率，加速耐鹽植物育種的步伐。


圖1. 1黃瓜津春5、津優(yōu)1葉盤在不同濃度NaCl處理下的葉綠素含量變化葉片失綠進(jìn)程快速鑒定黃瓜耐鹽潛力的試驗(yàn)結(jié)果表明，在含有200mM、300mM、 400mM NaCl的MS培養(yǎng)液中放置3天，耐鹽品種津春5的葉盤葉綠素喪失速率比普通品種津 優(yōu)1低很多，津優(yōu)1葉片失綠程度嚴(yán)重，葉片變黃，葉綠素含量顯著降低。說明黃瓜植株的 耐鹽能力和葉片的耐鹽能力高度相關(guān)，用200mM、300mM、400mM NaCl溶液進(jìn)行處理，通過觀 察葉片失綠程度及測(cè)定葉片葉綠素的含量，能快速、準(zhǔn)確地篩選出耐鹽黃瓜植株。
具體實(shí)施例方式針對(duì)傳統(tǒng)技術(shù)鑒定植物耐鹽潛力所需時(shí)間長(zhǎng)、所需材料多、工作效率低的問題，發(fā) 明人進(jìn)行了大量的研究工作，最終建立了利用離體葉片失綠進(jìn)程快速鑒定黃瓜耐鹽潛力的 新方法。以葉片失綠程度及葉綠素含量為依據(jù)，可以快速、準(zhǔn)確地確定不同基因型的耐鹽潛 力，從而篩選耐鹽潛力高的優(yōu)良基因型，在短時(shí)間內(nèi)淘汰大量的無(wú)用材料，進(jìn)而選育出耐鹽 的優(yōu)良黃瓜新品種。本發(fā)明旨在提供一種科學(xué)高效的耐鹽快速鑒定方法，通過該方法淘汰大量不耐鹽 的基因型，實(shí)現(xiàn)耐鹽基因和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)基因的結(jié)合，加速耐鹽黃瓜新品種的選育。本發(fā)明的目的通過如下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)黃瓜葉片失綠程度臨界鹽濃度的確定將黃瓜葉片用剪刀剪成長(zhǎng)2cm，寬2cm的葉盤，分別置于含有100mM、200mM、300mM、 400mM、500mM、600mM NaCl的MS培養(yǎng)液中，3d后觀測(cè)其葉盤失綠情況及葉綠素含量的變化。 IOOmM NaCl處理的葉片失綠程度較輕，葉綠素含量變化不明顯；濃度越高，相同處理時(shí)間內(nèi) 的葉片失綠情況及葉綠素含量降低的程度越嚴(yán)重；600mM時(shí)由于濃度過高，葉片細(xì)胞死亡， 葉片呈棕褐色。200mM、300mM、400mM NaCl處理，津優(yōu)1葉片出現(xiàn)嚴(yán)重失綠，葉綠素含量急 劇降低，而且對(duì)時(shí)間長(zhǎng)短的靈敏性較低，可重復(fù)性較好；耐鹽品種津春5的葉片失綠程度較 輕。因此，我們把200 400mM作為NaCl脅迫的適宜鹽濃度范圍。
黃瓜葉片失綠程度臨界鹽脅迫時(shí)間的確定將黃瓜葉片用剪刀剪成長(zhǎng)2cm，寬2cm的葉盤，置于含有200mM、300mM、400mMNaCl 的MS培養(yǎng)液中，1、3、5天后觀測(cè)其葉盤失綠情況及葉綠素含量的變化。200mM、300mM、400mM NaCl脅迫1天后，葉片失綠程度較輕，葉綠素含量變化不明顯；脅迫時(shí)間越長(zhǎng)相同濃度處理 內(nèi)的葉片失綠情況及葉綠素含量降低的程度越嚴(yán)重，脅迫5天后津春5和津優(yōu)1葉片失綠 情況趨于相同，葉綠素含量差異不大。200mM、300mM、400mMNaCl處理3天，津優(yōu)1葉片出現(xiàn) 嚴(yán)重失綠，葉綠素含量急劇降低，而且對(duì)時(shí)間長(zhǎng)短的靈敏性較低，可重復(fù)性較好；耐鹽品種 的葉片失綠程度較輕。因此，我們把200mM、300mM、400mM處理3天作為NaCl脅迫的臨界時(shí) 間。葉片失綠與耐鹽性的相關(guān)性研究葉片失綠進(jìn)程快速鑒定黃瓜耐鹽潛力的試驗(yàn)結(jié)果表明，在含有200mM、300mM、 400mM NaCl的MS培養(yǎng)液中放置3天，耐鹽品種津春5的葉盤失綠程度不明顯，葉綠素喪失 速率比津優(yōu)1慢很多，津優(yōu)1葉片失綠程度嚴(yán)重，葉片變黃變褐，葉綠素含量顯著降低。說 明黃瓜植株的耐鹽能力和葉片的耐鹽能力高度相關(guān)，用200mM、300mM、400mMNaCl溶液進(jìn)行 處理，通過觀察葉片失綠程度及測(cè)定葉片葉綠素的含量，能快速、準(zhǔn)確地篩選出耐鹽黃瓜植 株。施例1津春5和津優(yōu)1是天津科潤(rùn)黃瓜所育成的品種，津春5耐鹽能力強(qiáng)，津優(yōu)1 是鹽敏感品種。通過水培實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步鑒定津春5和津優(yōu)1的耐鹽性。當(dāng)?shù)?片真葉展開后， 分別挑選津春5和津優(yōu)1生長(zhǎng)一致的幼苗的第一片真葉，用去離子水沖洗兩次，用剪刀剪成 長(zhǎng)2cm，寬2cm的葉盤，置于含有200mM、300mM、400mM NaCl的MS培養(yǎng)液中，3d后觀測(cè)其葉 盤失綠情況及葉綠素含量的變化。在含有200mM、300mM、400mM NaCl的MS培養(yǎng)液中放置3 天，耐鹽品種津春5的葉盤失綠程度不明顯，葉綠素喪失速率比津優(yōu)1低很多，津優(yōu)1葉片 失綠程度嚴(yán)重，葉片變黃，葉綠素含量顯著降低。說明200 400mM的NaCl溶液能夠把耐 鹽基因型鑒別出來。
權(quán)利要求
1.一種用離體葉片失綠進(jìn)程快速鑒定黃瓜耐鹽潛力的新方法，其特征在于利用耐鹽能力不同的黃瓜基因型，其離體葉片在鹽溶液中的失綠進(jìn)程的差異；在高鹽 溶液中處理一定的時(shí)間，葉片的失綠情況，快速準(zhǔn)確地反映基因型的耐鹽能力；葉片失綠程 度大的，葉片細(xì)胞受損害嚴(yán)重，葉綠素含量低，耐鹽能力差；葉片失綠程度小的，葉片細(xì)胞受 損害較輕，葉綠素喪失速率慢，耐鹽能力強(qiáng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用離體葉片失綠進(jìn)程快速鑒定黃瓜耐鹽潛力的新方法，其特 征在于選擇MS液體培養(yǎng)基，添加化學(xué)純的NaCl，溶液濃度一般以200 400mM，處理時(shí)間 3天；黃瓜葉片對(duì)鹽脅迫的靈敏度在基因型之間有明顯差異。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用離體葉片失綠進(jìn)程快速鑒定黃瓜耐鹽潛力的新方法，其特 征在于將葉片剪成長(zhǎng)2cm，寬2cm的葉盤，置于含有200mM、300mM、400mM NaCl的MS培養(yǎng) 液中，3d后觀測(cè)葉盤失綠情況及葉綠素含量的變化。
全文摘要
一種利用離體葉片失綠進(jìn)程快速鑒定黃瓜耐鹽潛力的新方法。黃瓜離體葉片在高鹽環(huán)境中，葉片逐漸失綠變黃，葉片細(xì)胞受害，葉綠素含量逐漸降低，不同耐鹽能力的葉片失綠速率不同；葉片失綠程度大的，細(xì)胞受害嚴(yán)重，葉綠素含量顯著降低；通過觀測(cè)高濃度鹽處理對(duì)葉片失綠進(jìn)程及葉綠素含量的影響，從而判斷耐鹽能力不同的黃瓜基因型。在高鹽溶液中處理一定的時(shí)間，葉片的失綠程度及葉綠素含量，能快速準(zhǔn)確地反映基因型的耐鹽能力。利用離體葉片失綠進(jìn)程的鑒定技術(shù)，能夠快速準(zhǔn)確地判斷基因型的耐鹽潛力，所需實(shí)驗(yàn)材料少，測(cè)定周期短，工作效率高，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N21/78GK102072902SQ20101051582
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日
發(fā)明者劉仲齊, 張?jiān)? 聶莉莉 申請(qǐng)人:天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心