專利名稱：基于單分子力譜的抗癌藥物鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于單分子力譜的抗癌藥物鑒定方法。
背景技術(shù)：
癌癥一直是人類健康的最大殺手。細(xì)胞的過(guò)度增殖是癌癥發(fā)生和發(fā)展的原因，而 且細(xì)胞的過(guò)度增殖一般都與配體誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)通路尤其是生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的過(guò)度激活 有關(guān)。因此抑制這種細(xì)胞信號(hào)通路的過(guò)度激活，成為治療癌癥的重要途徑。生長(zhǎng)因子細(xì)胞 信號(hào)通路的激活首先是通過(guò)配體與其膜蛋白受體在細(xì)胞膜上結(jié)合，使受體產(chǎn)生自聚或異聚 而被激活。然后通過(guò)激活的受體再磷酸化下游通路的蛋白，使其下游蛋白被激活，從而激活 整個(gè)信號(hào)通路。因此，鑒定出能截?cái)嗉せ钚盘?hào)通路的任一環(huán)節(jié)的化合物就能發(fā)展治療癌癥 的藥物。目前抗癌藥物分子的主要鑒定方法之一是首先通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬從化合物庫(kù)中找 出一些能與信號(hào)通路相關(guān)蛋白結(jié)合的候選物，然后對(duì)這些候選物分子進(jìn)行細(xì)胞水平的實(shí) 驗(yàn)，檢測(cè)其是否能夠抑制其配體誘導(dǎo)的下游蛋白的磷酸化水平，通過(guò)重復(fù)這些生化實(shí)驗(yàn)來(lái) 達(dá)到抗癌藥物鑒定的目的，再進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。但是在鑒定過(guò)程中普遍存在周期長(zhǎng)，操 作復(fù)雜，花費(fèi)高的問(wèn)題，難以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便快捷的藥物鑒定。因此，有必要發(fā)展一種簡(jiǎn)單快捷的 藥物鑒定方法。單分子力譜方法是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)技術(shù)。該方法不僅有極高的靈 敏度，而且還能展現(xiàn)出大量分子檢測(cè)時(shí)所掩蓋下單個(gè)分子力的變化，已日益廣泛地應(yīng)用于 細(xì)胞水平對(duì)生物分子結(jié)構(gòu)和功能的動(dòng)態(tài)變化、分子間相互作用和生化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程的 研究。但目前還未見(jiàn)有利用該方法鑒定抗癌藥物的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于單分子力譜檢測(cè)膜蛋白受體-配體相互作用的抗 癌藥物鑒定方法。本發(fā)明提供的抗癌藥物的鑒定方法，包括如下步驟1)將靶標(biāo)膜蛋白受體的配體修飾在原子力顯微鏡的針尖上，得到修飾后的針尖；2)將離體的癌癥細(xì)胞進(jìn)行孵育，孵育完畢后將步驟1)所得修飾后的針尖和孵育 后的所述離體的癌癥細(xì)胞均置于原子力顯微鏡的樣品池中，測(cè)定所述離體的癌癥細(xì)胞中所 述靶標(biāo)膜蛋白受體與所述靶標(biāo)膜蛋白受體的配體之間的結(jié)合力，得到所述離體的癌癥細(xì)胞 中所述靶標(biāo)膜蛋白受體與所述靶標(biāo)膜蛋白受體的配體之間的結(jié)合幾率A ；所述離體的癌癥 細(xì)胞為含有所述靶標(biāo)膜蛋白受體的癌癥細(xì)胞；3)將所述離體的癌癥細(xì)胞和待鑒定物質(zhì)進(jìn)行孵育，孵育完畢后將其與所述步驟 1)所得修飾后的針尖均置于原子力顯微鏡的樣品池中，測(cè)定孵育后的所述離體的癌癥細(xì)胞 中所述靶標(biāo)膜蛋白受體與所述靶標(biāo)膜蛋白受體的配體之間的結(jié)合力，得到所述孵育后的所 述離體的癌癥細(xì)胞中所述靶標(biāo)膜蛋白受體與所述靶標(biāo)膜蛋白受體的配體之間的結(jié)合幾率B ；所述離體的癌癥細(xì)胞為含有所述靶標(biāo)膜蛋白受體的癌癥細(xì)胞；4)如果所述結(jié)合幾率B小于所述結(jié)合幾率A，則所述待鑒定物質(zhì)為候選的抗癌藥 物。上述方法的步驟1)中，常用的各種氮化硅原子力顯微鏡針尖均適用于該方法。所 述靶標(biāo)膜蛋白受體的配體優(yōu)選為TGFii 1，所述離體的癌癥細(xì)胞優(yōu)選為Hela細(xì)胞。所述修 飾步驟是將原子力顯微鏡針尖與配體通過(guò)化學(xué)交聯(lián)的方式進(jìn)行修飾，具體包括如下步驟 a)將所述原子力顯微鏡的針尖置于MPTMS的甲苯溶液中反應(yīng)，反應(yīng)完畢后得到硅烷化的針 尖；b)將所述步驟a)所得硅烷化的針尖置于ω-氮羥基琥珀酰亞胺酯多聚乙二醇α-馬 來(lái)酉先亞胺((ω -N-hydroxy-succinimide-ester-poly (ethylene glycol) - α -maleimide， 簡(jiǎn)稱NHS-PEG-MAL)的二甲基亞砜溶液中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完畢得到活化后的針尖；c)將所述 步驟b)得到的活化后的針尖與所述細(xì)胞配體于溶劑中進(jìn)行反應(yīng)，得到修飾后的針尖。上述修飾步驟的步驟a)反應(yīng)步驟中，溫度為18_25°C，優(yōu)選20°C，時(shí)間為1. 5-2小 時(shí)，優(yōu)選2小時(shí)；所述MPTMS的甲苯溶液的體積百分濃度為；在所述步驟a)之后，所述 步驟b)之前，還對(duì)所述硅烷化的針尖進(jìn)行如下處理將所述硅烷化的針尖依次用甲苯、丙 酮和乙醇洗滌，氮?dú)獯蹈?；所述步驟b)反應(yīng)步驟中，溫度為18_25°C，優(yōu)選20°C，時(shí)間為2. 5-3小時(shí)，優(yōu)選3 小時(shí)；所述NHS-PEG-MAL的二甲基亞砜溶液的濃度為lmg/ml ；在所述步驟b)之后，所述步 驟c)之前，還對(duì)所述活化后的針尖進(jìn)行如下處理將所述活化后的針尖用二甲基亞砜進(jìn)行 洗滌，再氮?dú)獯蹈?；所述步驟c)中，溫度為18-25°C，優(yōu)選20°C，時(shí)間為0.5-1小時(shí)，優(yōu)選0.5小時(shí)； 所述溶劑選自PBS緩沖液和Tris-HCl緩沖液中的至少一種，其中，PBS緩沖液的pH值為 7. 2-7. 6，優(yōu)選7. 4，摩爾濃度為0. 01M, Tris-HCl緩沖液的pH值為7. 2-7. 6，優(yōu)選7. 4，濃度 為0. 05M。在所述步驟c)之后所述步驟2)之前，還對(duì)所述修飾后的針尖進(jìn)行如下處理用 緩沖液洗滌所述修飾后的針尖；所述緩沖液選自PBS緩沖液和Tris-HCl緩沖液中的至少 一種，優(yōu)選PBS緩沖液；其中，PBS緩沖液的pH值為7. 2-7. 6，優(yōu)選7. 4，摩爾濃度為0. 01M, Tris-HCl緩沖液的pH值為7. 2-7. 6，優(yōu)選7. 4，濃度為0. 05M。所述步驟2)和步驟3)孵育所述離體的癌癥細(xì)胞步驟中，溫度均為37°C，時(shí)間均 為18-30小時(shí)，優(yōu)選均為24小時(shí)；所述孵育步驟是在培養(yǎng)基中進(jìn)行的。各種能夠孵育該癌 癥細(xì)胞的培養(yǎng)基均適用，如可為胎牛血清體積百分比為10%的DMEM培養(yǎng)基。所述步驟3)孵育待鑒定物質(zhì)步驟中，溫度為37°C，時(shí)間為0.5-2小時(shí)，優(yōu)選為1小 時(shí)。上述步驟2)和3)中，結(jié)合力是按照如下方法得到使原子力顯微鏡的針尖壓到細(xì) 胞表面，然后再提拉使針尖離開(kāi)細(xì)胞。由結(jié)合力得到結(jié)合幾率的具體方法為計(jì)算有結(jié)合力 的力曲線的個(gè)數(shù)占所有力曲線個(gè)數(shù)的比例，得到結(jié)合幾率。所述步驟2)和3)測(cè)定步驟中，加載速率為1. 0X105pN/s，針尖與基底接觸的時(shí)間 為500ms。在測(cè)定步驟中，所用原子力顯微鏡的針尖，在使用之前，可清洗干凈并用氮?dú)獯蹈?。所述步驟4)中，所述候選的抗癌藥物為能夠抑制所述離體的癌癥細(xì)胞與所述配 體結(jié)合的抗癌藥物；所述結(jié)合幾率A與所述結(jié)合幾率B之差不小于5 %，如可為8. 6 %。
為了獲得更準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果，上述方法步驟2)和步驟3)可重復(fù)若干次，如可重復(fù) 3-5 次。所述待鑒定物質(zhì)為式I所示柚皮素或式II所示白藜蘆醇。
(式 II)本發(fā)明利用單分子力譜的方法提供了一種基于膜蛋白受體-配體相互作用力的 細(xì)胞水平鑒定抗癌藥物的方法。該方法通過(guò)檢測(cè)藥物分子是否可以抑制膜蛋白受體與配體 的結(jié)合，從而得到有望抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物候選物。其基本原理(如圖1所示)是首 先是將配體通過(guò)化學(xué)交聯(lián)的方法修飾到AFM針尖上，然后在待測(cè)化合物存在下，通過(guò)單分 子力譜觀察細(xì)胞膜上受體與配體結(jié)合幾率的變化。例如如果是在加入待測(cè)化合物后受體與 配體的結(jié)合幾率變小，說(shuō)明該藥物具有抑制配受體結(jié)合的作用。因此在待測(cè)化合物存在下， 通過(guò)檢測(cè)膜蛋白受體與配體的結(jié)合幾率是否減小，從而實(shí)現(xiàn)抑制膜蛋白受體與配體的結(jié)合 的抗癌藥物的鑒定。該方法屬于藥物鑒定新方法，與其它藥物鑒定方法相比，具有操作簡(jiǎn) 便，周期短，節(jié)省開(kāi)支等優(yōu)勢(shì)，可以快速鑒定得到抑制配受體結(jié)合的抗癌藥物。


圖1為用原子力顯微鏡檢測(cè)配受體結(jié)合示意圖。圖2為對(duì)照和柚皮素與白藜蘆醇濃度都為50 μ M時(shí)，配受體結(jié)合幾率的變化。圖3為分別在陽(yáng)性對(duì)照，柚皮素和白藜蘆醇，觀察小鼠肺臟上的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，所述方法均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用3-巰 丙基三乙氧基硅烷(MPTMS)和所用NHS-PEG-MAL均購(gòu)自sigma公司；所用柚皮素購(gòu)自陜西 惠科植物開(kāi)發(fā)有限公司；孵育步驟所用培養(yǎng)皿均為購(gòu)自北京科友佳生物技術(shù)有限公司的 35mm的玻璃底培養(yǎng)皿。本發(fā)明中所述結(jié)合幾率、加載速率均定義如下結(jié)合幾率是有結(jié)合力的力曲線占 所有測(cè)得的力曲線的個(gè)數(shù)的百分比；加載速率是指單分子力譜測(cè)定中針尖在退針時(shí)的提升 速率，其大小為AFM針尖微懸臂的力彈性常數(shù)與斷鍵過(guò)程中針尖回退的速率的乘積，單位 為 pN/s。
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下述實(shí)施例中所用原子力顯微鏡均購(gòu)自安捷倫公司，所用針尖均為氮化硅 針尖。該原子力顯微鏡均包括如下的配件激光器(Laser)、AFM針尖(Tip)、微懸 臂(Cantilever)、樣品池(Sample Substrate)、光柵掃描和Z軸定位的壓電掃描器 (Piezo-scanner)、壓電掃描控制器(XYZ Scanner Controller)、顯示器(Displayer)、接受 光反饋信號(hào)的控制器(Feedback Controller)和檢測(cè)器(Detector)。利用原子力顯微鏡測(cè)定結(jié)合力的原理如下當(dāng)針尖與被檢測(cè)樣品之間有微弱的相 互作用力時(shí)，引起微懸臂彎曲，使從微懸臂反射到檢測(cè)器上的激光發(fā)生偏移，由于光杠桿作 用原理，即使小于0. Olnm的微懸臂形變也可在光電檢測(cè)器上產(chǎn)生IOnm左右的激光點(diǎn)偏移， 由此產(chǎn)生的電壓變化對(duì)應(yīng)著微懸臂的形變量，通過(guò)一定的函數(shù)變化便可得到微懸臂形變量 的測(cè)量值。反饋系統(tǒng)根據(jù)產(chǎn)生的電壓信號(hào)變化來(lái)調(diào)整針尖或者樣品的Z向位置，控制針尖 與樣品位置的相對(duì)移動(dòng)，即可進(jìn)行形貌和力的測(cè)量。實(shí)施例1、1)取清洗干凈的AFM針尖轉(zhuǎn)移到含有體積百分濃度為1. 0%的MPTMS的甲苯溶液 中，于20°C反應(yīng)2小時(shí)后，用甲苯反復(fù)清洗除去未反應(yīng)的硅烷化試劑，再依次用丙酮和乙醇 清洗3次，氮?dú)獯蹈?，得到硅烷化后的針尖。將硅烷化后的針尖浸入lmg/mlNHS-PEG-MAL的 DMSO溶液中，于20 V反應(yīng)3小時(shí)后，用DMSO清洗3次以除去未反應(yīng)的NHS-PEG-MAL，氮?dú)?吹干后得到活化后的針尖。將活化的針尖于PH值為7. 4、濃度為0. OlM的PBS緩沖液中與 TGF β 1配體(該配體在PBS緩沖液中的濃度為5 μ Μ)室溫反應(yīng)0. 5h后，用ρΗ值為7. 4、濃 度為0. OlM的PBS緩沖液清洗3次后，得到修飾后的AFM針尖備用。2)將HeLa細(xì)胞傳到35mm培養(yǎng)皿37°C中孵育24小時(shí)(細(xì)胞覆蓋度為80% )后， 將步驟1)所得修飾后的AFM針尖和孵育后的HeLa細(xì)胞均置于原子力顯微鏡的樣品池中， 測(cè)定HeLa細(xì)胞中T β RII受體與TGF β 1配體之間的結(jié)合力，同一針尖和癌癥細(xì)胞重復(fù)平行 實(shí)驗(yàn)3次，得到HeLa細(xì)胞中T β RII受體與TGF β 1配體之間的結(jié)合幾率A1 ；該測(cè)定步驟中， 加載速率為1. 0X105pN/s，針尖與基底接觸的時(shí)間為500ms ；3)將步驟2)所用HeLa細(xì)胞傳到35mm培養(yǎng)皿37°C中孵育24小時(shí)(細(xì)胞覆蓋度 為80%)后，再加入柚皮素37°C孵育lh(細(xì)胞覆蓋度為80%)；孵育完畢后將步驟1)所 得修飾后的AFM針尖和孵育后的HeLa細(xì)胞均置于原子力顯微鏡的樣品池中，測(cè)定HeLa細(xì) 胞中T β RII受體與TGFi3 1配體之間的結(jié)合力，同一針尖和癌癥細(xì)胞重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)3次，得 到HeLa細(xì)胞中T β RII受體與TGF β 1配體之間的結(jié)合幾率B1 ；該測(cè)定步驟中，加載速率為 1. 0X105pN/s，針尖與基底接觸的時(shí)間為500ms ；同時(shí)設(shè)置以下阻斷對(duì)照將hela細(xì)胞傳到35mm培養(yǎng)皿37°C中孵育24小時(shí)使其細(xì) 胞覆蓋度為80%后，將阻斷劑T β RII胞外段濃度為5ug/ml的PBS緩沖液(ρΗ值為7. 4、濃 度為0. 01M)加入該hela細(xì)胞中，使該阻斷劑T β RII胞外段的終濃度為5ug/ml，再將修飾 后的針尖浸入液面以下30min后，開(kāi)始測(cè)定結(jié)合力，該測(cè)定步驟的測(cè)定條件與前述步驟2) 和3)完全相同，得到該結(jié)合幾率為3. 5士0.8%。其中，所用阻斷劑T β RII胞外段的制備方法如下將pET-2Ib-T β RII胞外段 (ECD)(Crescenzo G. D. ,Pham P. L. ；Durocher Y. ,0' Connor-McCourt M. D.Transforming growthfactor-beta(TGF-beta)binding to the extracellular domain of the type TGF II-betareceptor :receptor capture on a biosensor surface using a new coiled—coilcapture systemdemonstrates that avidity contributes significantly to high affinity binding. J. Mol. Biol.，2003，328，1173-1183)的轉(zhuǎn)化至菌株 E. coli DH-5 α。N 末端組氨酸標(biāo)記的T β RII E⑶蛋白用ImM IPTG的誘導(dǎo)，用Ni-NTA瓊脂膠在蛋白變性條 件下純化(agarose, Qiagen, USA)。再用參考文獻(xiàn) Wang Q.，Bai Ζ. , Li Χ.，Hou L.，Zhang B. The evidences of human orphan receptor COUP-TF inhibiting telomerase activity throughdecreasing hTERT II transcription. Cancer Lett.，2004，214，81—90 中提供的方 法使蛋白重新折疊。樣品首先用含IOOmM NaCl和0. 5-2. OM尿素的Tris-HCl (20mM，pH8. 0) 溶液稀釋，然后依次在緩沖溶液 1(0. 5M urea, 20mM Tris-HCl, ImM EDTA，IOOmM NaCl,25% NP-40,0. 2mM PMSF)和緩沖溶液 II (20mM Tris-HCl, ImM EDTA, 50mM NaCl,0. 25% NP-40, 0. 2mM PMSF)中透析 24h。該pET-21b_Ti3RII胞外段可從中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所獲得。上述檢測(cè)結(jié)果均列于圖2中。由圖可知，TGFi3 1配體與T β RII受體的結(jié)合幾率A1 為25. 1 士2.8%。在加入50 μ M柚皮素孵育Ih后，TGF β 1配體與T β RII受體的結(jié)合幾率 明顯減小，結(jié)合幾率B1降低到16. 5 士 1. 6 %，該結(jié)合幾率A1與結(jié)合幾率B1的差值為8.6%， 大于5%，說(shuō)明柚皮素可以抑制TGFi3 1配體與T β RII受體的結(jié)合。按照與上完全相同的步驟，僅將步驟3)中待鑒定藥物替換為白藜蘆醇，所得結(jié)合 幾率A2與B2沒(méi)有顯著變化，結(jié)合幾率A2為25. 1 士 2. 8 %，結(jié)合幾率B2為24. 6 % 士 2. 7 %， 該差值為0. 5%，小于5%，說(shuō)明白藜蘆醇不能抑制TGFi3 1配體與T β RII受體的結(jié)合。生化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為了驗(yàn)證單分子力譜鑒定方法的有效性，按照如下步驟進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)如圖3所示，將4Τ1細(xì)胞接種于Balb/c小鼠第四脂肪墊下，15萬(wàn)/只。接種3天 分組，每組十只，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃溶液(0. 2% CMC-Na水溶液)，給藥組分別灌胃給藥柚皮 素、白藜蘆醇各100mg/kg，共給藥21天，處死動(dòng)物，觀察肺臟上轉(zhuǎn)移的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)。將陽(yáng)性對(duì)照組溶液直接讓小鼠喝下去。所得結(jié)果如圖3所示。由圖可知，經(jīng)過(guò)柚皮素處理后肺臟上腫瘤的結(jié)節(jié)數(shù)明顯地 減少而白藜蘆醇卻不能。這與本發(fā)明提供的鑒定方法所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果幾乎相同。因此本發(fā)明 提供的利用單分子力譜檢測(cè)膜蛋白受體_配體相互作用的方法可用來(lái)鑒定抗癌藥物。
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權(quán)利要求
一種抗癌藥物的鑒定方法，包括如下步驟1)將靶標(biāo)膜蛋白受體的配體修飾在原子力顯微鏡的針尖上，得到修飾后的針尖；2)將離體的癌癥細(xì)胞進(jìn)行孵育，孵育完畢后將步驟1)所得修飾后的針尖和孵育后的所述離體的癌癥細(xì)胞均置于原子力顯微鏡的樣品池中，測(cè)定所述離體的癌癥細(xì)胞中所述靶標(biāo)膜蛋白受體與所述靶標(biāo)膜蛋白受體的配體之間的結(jié)合力，得到所述離體的癌癥細(xì)胞中所述靶標(biāo)膜蛋白受體與所述靶標(biāo)膜蛋白受體的配體之間的結(jié)合幾率A；所述離體的癌癥細(xì)胞為含有所述靶標(biāo)膜蛋白受體的癌癥細(xì)胞；3)將所述離體的癌癥細(xì)胞和待鑒定物質(zhì)進(jìn)行孵育，孵育完畢后將其與所述步驟1)所得修飾后的針尖均置于原子力顯微鏡的樣品池中，測(cè)定孵育后的所述離體的癌癥細(xì)胞中所述靶標(biāo)膜蛋白受體與所述靶標(biāo)膜蛋白受體的配體之間的結(jié)合力，得到所述孵育后的所述離體的癌癥細(xì)胞中所述靶標(biāo)膜蛋白受體與所述靶標(biāo)膜蛋白受體的配體之間的結(jié)合幾率B；所述離體的癌癥細(xì)胞為含有所述靶標(biāo)膜蛋白受體的癌癥細(xì)胞；4)如果所述結(jié)合幾率B小于所述結(jié)合幾率A，則所述待鑒定物質(zhì)為候選的抗癌藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)修飾步驟包括如下步驟a)將所述原子力顯微鏡的針尖置于3-巰丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液中反應(yīng)，反應(yīng) 完畢后得到硅烷化的針尖；b)將所述步驟a)所得硅烷化的針尖置于氮羥基琥珀酰亞胺酯多聚乙二醇a-馬 來(lái)酰亞胺的二甲基亞砜溶液中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完畢得到活化后的針尖；c)將所述步驟b)得到的活化后的針尖與所述靶標(biāo)膜蛋白受體的配體于溶劑中進(jìn)行反 應(yīng)，得到所述修飾后的針尖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟a)反應(yīng)步驟中，溫度為 18-25°C，優(yōu)選20°C，時(shí)間為1. 5-2小時(shí)，優(yōu)選2小時(shí)；所述3-巰丙基三乙氧基硅烷的甲苯 溶液的體積百分濃度為；所述步驟b)反應(yīng)步驟中，溫度為18-25°C，優(yōu)選20°C，時(shí)間為2. 5_3小時(shí)，優(yōu)選3小時(shí)； 所述氮羥基琥珀酰亞胺酯多聚乙二醇a _馬來(lái)酰亞胺的二甲基亞砜溶液的濃度為lmg/ ml ；所述步驟c)反應(yīng)步驟中，溫度為18-25°C，優(yōu)選20°C，時(shí)間為0. 5-1小時(shí)，優(yōu)選0.5小 時(shí)；所述溶劑選自PBS緩沖液和Tris-HCl緩沖液中的至少一種；其中，所述PBS緩沖液的 pH值為7. 2-7. 6，優(yōu)選7. 4，摩爾濃度為0. 01M，所述Tris-HCl緩沖液的pH值為7. 2-7. 6，優(yōu) 選7. 4，濃度為0. 05M。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于在所述步驟a)之后，所述步驟b)之 前，所述抗癌藥物的鑒定方法還包括如下步驟將所述硅烷化的針尖依次用甲苯、丙酮和乙 醇洗滌，氮?dú)獯蹈?；在所述步驟b)之后，所述步驟c)之前，所述抗癌藥物的鑒定方法還包括如下步驟將 所述活化后的針尖用二甲基亞砜進(jìn)行洗滌，再氮?dú)獯蹈?；在所述步驟c)之后，所述步驟2)之前，所述抗癌藥物的鑒定方法還包括如下步驟用 緩沖溶液洗滌所述修飾后的針尖；所述緩沖溶液選自PBS緩沖液和Tris-HCl緩沖液中的至 少一種，優(yōu)選PBS緩沖液；所述緩沖溶液的pH值為7. 2-7. 4，優(yōu)選7. 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)和步驟3)孵育所述離體的癌癥細(xì)胞步驟中，溫度均為37°C，時(shí)間均為18-30小時(shí)，優(yōu)選均為24小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述步驟3)孵育待鑒定物質(zhì)步驟 中，溫度為37°C，時(shí)間為0. 5-2小時(shí)，優(yōu)選為1小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于所述靶標(biāo)膜蛋白受體的配體為 TGF3 1，所述離體的癌癥細(xì)胞為Hela細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的方法，其特征在于所述步驟4)中，所述候選的抗癌 藥物為能夠抑制所述癌癥細(xì)胞中所述靶標(biāo)膜蛋白受體與所述配體結(jié)合的抗癌藥物；所述結(jié) 合幾率A與所述結(jié)合幾率B之差不小于5 %。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，構(gòu)成所述原子力 顯微鏡的針尖的材料為氮化硅。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種提供一種基于單分子力譜檢測(cè)膜蛋白受體-配體相互作用的抗癌藥物鑒定方法。該方法包括如下步驟將靶標(biāo)膜蛋白受體的配體修飾在原子力顯微鏡的針尖上，得到修飾后的針尖；將離體的癌癥細(xì)胞進(jìn)行孵育或再加入待鑒定物質(zhì)進(jìn)行孵育，孵育完畢后將步驟1)所得修飾后的針尖和孵育后的所述離體的癌癥細(xì)胞均置于原子力顯微鏡的樣品池中，測(cè)定所述離體的癌癥細(xì)胞中所述靶標(biāo)膜蛋白受體與所述靶標(biāo)膜蛋白受體的配體之間的結(jié)合力，得到結(jié)合幾率A或B，如果所述結(jié)合幾率B小于所述結(jié)合幾率A，則所述待鑒定物質(zhì)為候選的抗癌藥物。該方法具有操作簡(jiǎn)便，周期性短，花費(fèi)低等優(yōu)勢(shì)，可以鑒定各種抑制配受體相互作用的藥物。
文檔編號(hào)G01L5/00GK101975854SQ201010521638
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月21日
發(fā)明者師曉麗, 徐永春, 方曉紅, 楊勇, 梁偉 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所