專(zhuān)利名稱(chēng)：一種戊型肝炎病毒的四重?zé)晒舛縫cr鑒別檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人血清、動(dòng)物血清及其產(chǎn)品、食品以及環(huán) 境中通過(guò)多重?zé)晒舛縋CR鑒別戊型肝炎病毒各個(gè)基因型的快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
戊型肝炎(Hepatitis Ε)由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)引起，是一 種經(jīng)糞-口傳播、以黃疸為主的急性傳染病，患病孕婦的病死率更可高達(dá)21%。自1955年 印度發(fā)生第一次大暴發(fā)以來(lái)，戊型肝炎已在亞洲、非洲與拉丁美洲的很多國(guó)家廣泛流行。近 年來(lái)該病亦在日本等發(fā)達(dá)國(guó)家散發(fā)流行。我國(guó)是戊型肝炎高發(fā)的國(guó)家，新疆、遼寧、山東等 省均有大量流行，極大的危害人類(lèi)健康。有證據(jù)顯示，戊型肝炎是一種動(dòng)物源性疾病，被感 染的家養(yǎng)或野生動(dòng)物可直接傳播或通過(guò)污染水源傳播本病。有研究表明，豬源戊型肝炎病 毒可以感染恒河猴和黑猩猩等靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，而人戊型肝炎病毒在實(shí)驗(yàn)條件下也能成功感染 豬等動(dòng)物；血清學(xué)調(diào)查則發(fā)現(xiàn)與豬頻繁接觸的人群(如飼養(yǎng)員、獸醫(yī)、屠工)中戊型肝炎病 毒的抗體水平明顯高于正常人群。日本亦有人因食用了未煮熟的豬肝和鹿肉而引起急性戊 肝的報(bào)道，提示了豬戊型肝炎病毒在公共衛(wèi)生和食品安全方面存在的重大意義。HEV是無(wú)包膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組長(zhǎng)約7. 5kb，有3個(gè)開(kāi)放閱讀框。根 據(jù)HEV各分離株的基因組序列分析，可將其分為4個(gè)主要的基因型。I型主要發(fā)生于亞非多 數(shù)國(guó)家；II型分離于墨西哥；III型發(fā)生于美國(guó)和一些歐洲國(guó)家；IV型發(fā)生于亞洲。其中I 型和II型只能感染人，III型和IV型則為人畜共患，可感染人、豬和其它動(dòng)物。在我國(guó)流 行的HEV主要為由I型和IV型。但有研究表明，上海地區(qū)豬場(chǎng)中已有III型HEV毒株的流 行。迄今為止，對(duì)豬源戊型肝炎尚無(wú)有效的疫苗用于預(yù)防，采取的控制措施主要是及 早發(fā)現(xiàn)，并隨時(shí)監(jiān)測(cè)疫區(qū)的流行情況以阻斷該病的傳播。這就需要建立一種通用的、高度敏 感、特異和快速的檢測(cè)方法用于HEV的診斷。同時(shí)，HEV主要經(jīng)污染的水源和環(huán)境傳播，高 度敏感的病原檢測(cè)技術(shù)也將有助于分子流行病學(xué)調(diào)查和病毒溯源。而目前可同時(shí)快速鑒定 戊型肝炎病毒各個(gè)基因型的方法尚無(wú)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種戊型肝炎病毒各個(gè)基因型的快速檢測(cè)方法，利用TaqMan 探針技術(shù)建立I、II、III和IV型HEV的多重?zé)晒饪焖俜中蜋z測(cè)體系，以期填補(bǔ)技術(shù)空白。為此，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案一種不同基因型戊型肝炎病毒的四重?zé)晒舛?量PCR鑒別檢測(cè)方法，其特征在于針對(duì)HEV 0RF3序列設(shè)計(jì)一對(duì)保守?cái)U(kuò)增引物和4條型特異 性TaqMan探針?biāo)龅臄U(kuò)增引物序列為HEV-F TATTCATCCAACCAACCCCTT,HEV-R GTCDCGCCAAGYGGAGC,
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該引物為針對(duì)不同基因型HEV 0RF3中的高度保守序列設(shè)計(jì)，對(duì)4種基因型HEV基 因組均能擴(kuò)增，引物序列中D代表堿基A、G或T，Y代表堿基T或C。
所述的TaqMan探針序列為I-P CY5-TGTCACCGCTGCGGCCG-BHQ3,II-P R0X-AGACGTTGCCGCTGCGTCC-BHQ2,III-P HEX-TTTCACAAYCCGGGGCTGGA-BHQ1,IV-P FAM-CGCATCTGACATffCCARCCGC-BHQ1,四條探針?lè)謩e針對(duì)各自的0RF3變異區(qū)序列設(shè)計(jì)，為型特異性，能實(shí)現(xiàn)不同基因型 的鑒別檢測(cè)；其中，I型HEV探針為CY5標(biāo)記，II型HEV探針為ROX標(biāo)記，III型HEV探針 為HEX標(biāo)記，IV型HEV探針為FAM標(biāo)記；探針序列種Y代表堿基T或C，W代表堿基A或T， R代表堿基A或G。PCR鑒別檢測(cè)方法的步驟如下1)將待測(cè)樣品、陰性對(duì)照以及不同型HEV陽(yáng)性對(duì)照采用TRIZO試劑提取RNA，最后 加入30 μ L DEPC水溶解。2)在PCR反應(yīng)管中按下表所述配置反應(yīng)體系
權(quán)利要求
一種戊型肝炎病毒的四重?zé)晒舛縋CR鑒別檢測(cè)方法，其特征在于針對(duì)HEV ORF3序列設(shè)計(jì)一對(duì)保守?cái)U(kuò)增引物和4條型特異性TaqMan探針?biāo)龅臄U(kuò)增引物序列為HEV FTATTCATCCAACCAACCCCTT，HEV RGTCDCGCCAAGYGGAGC，該引物為針對(duì)不同基因型HEV ORF3中的高度保守序列設(shè)計(jì)，對(duì)4種基因型HEV基因組均能擴(kuò)增，引物序列中D代表堿基A、G或T，Y代表堿基T或C；所述的TaqMan探針序列為I P CY5 TGTCACCGCTGCGGCCG BHQ3，II PROX AGACGTTGCCGCTGCGTCC BHQ2，III P HEX TTTCACAAYCCGGGGCTGGA BHQ 1，IV PFAM CGCATCTGACATWCCARCCGC BHQ 1，四條探針?lè)謩e針對(duì)各自的ORF3變異區(qū)序列設(shè)計(jì)，為型特異性，能實(shí)現(xiàn)不同基因型的鑒別檢測(cè)；其中，I型HEV探針為CY5標(biāo)記，II型HEV探針為ROX標(biāo)記，III型HEV探針為HEX標(biāo)記，IV型HEV探針為FAM標(biāo)記；探針序列中Y代表堿基T或C，W代表堿基A或T，R代表堿基A或G；PCR鑒別檢測(cè)方法的步驟如下1)將待測(cè)樣品、陰性對(duì)照以及不同型HEV陽(yáng)性對(duì)照采用TRIZO試劑提取RNA，最后加入30μLDEPC水溶解；2)在PCR反應(yīng)管中配置反應(yīng)體系，體系的總體積為25μl，其組成如下10μl熒光定量PCR Mix，1.2μl濃度為10μM的HEV F，1.2μl濃度為10μM的HEV R，0.5μl濃度為10μM的I P，0.5μl濃度為10μM的II P，0.5μl濃度為10μM的III P，0.5μl濃度為10μM的IV P，8μl HEV陽(yáng)性RNA模板，雙蒸水補(bǔ)至25μl；3)將PCR反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀中，反應(yīng)條件如下第一階段42℃，30min；第二階段95℃，3min；第三階段95℃，10s，60℃，45s，45個(gè)循環(huán)，并于第三階段60℃時(shí)同時(shí)采集不通通道的熒光信號(hào)；4)陰性對(duì)照CT值應(yīng)顯示為0或≥40.0，陽(yáng)性對(duì)照的CT值應(yīng)≤30.0，否則視實(shí)驗(yàn)失敗，需重做；檢測(cè)樣品CT值≤35.0，結(jié)果有效，直接報(bào)告樣品陽(yáng)性；檢測(cè)樣品35.0＜CT值＜40.0，需進(jìn)行一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若CT值仍介于35.0和40.0之間，且曲線(xiàn)有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)特性，同時(shí)陰性對(duì)照CT值為零，報(bào)告樣品陽(yáng)性，否則報(bào)告樣品陰性；檢測(cè)樣品CT值為零，報(bào)告樣品陰性。
全文摘要
目前對(duì)豬源戊型肝炎尚無(wú)有效的疫苗用于預(yù)防，采取的控制措施主要是及早發(fā)現(xiàn)，并隨時(shí)監(jiān)測(cè)疫區(qū)的流行情況以阻斷該病的傳播。本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)多重?zé)晒舛縋CR鑒別戊型肝炎病毒各個(gè)基因型的快速檢測(cè)方法，其特征在于針對(duì)HEVORF3序列設(shè)計(jì)一對(duì)保守?cái)U(kuò)增引物和4條型特異性TaqMan探針；四條探針?lè)謩e針對(duì)各自的ORF3變異區(qū)序列設(shè)計(jì)，為型特異性，能實(shí)現(xiàn)不同基因型的鑒別檢測(cè)。本發(fā)明保留了PCR方法的高靈敏度、高準(zhǔn)確度的特點(diǎn)，四重?zé)晒舛縋CR提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本，同時(shí)實(shí)現(xiàn)鑒別診斷的目的，為傳染源調(diào)查、傳播環(huán)境、病毒溯源等工作奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101962689SQ20101052363
公開(kāi)日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2010年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月28日
發(fā)明者何永強(qiáng), 吳姍, 帥江冰, 張曉峰, 陳笑梅 申請(qǐng)人:浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心