專利名稱：檢測獸藥殘留物的標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸藥殘留物檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說是一種檢測獸藥殘留物的標(biāo)記 型電化學(xué)免疫傳感器的制備，本發(fā)明還涉及采用所述的電化學(xué)免疫傳感器檢測食品中獸藥 殘留的方法。
背景技術(shù)：
獸藥殘留(residues ofveterinary drug)是指對食品動物用藥后，在動物體內(nèi)經(jīng) 過生物轉(zhuǎn)運(即吸收、分布、排出)和生物轉(zhuǎn)化，蓄積或存留于畜禽機體或產(chǎn)品(如雞蛋、奶 品、肉品等)中原型藥物或其代謝產(chǎn)物，包括與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)的殘留。目前，獸藥殘留可分為7類抗生素類、驅(qū)腸蟲藥類、生長促進劑類、抗原蟲藥類、 滅錐蟲藥類、鎮(zhèn)靜劑類、腎上腺素能受體阻斷劑。獸藥在防治動物疾病、提高生產(chǎn)效率、改善畜產(chǎn)品質(zhì)量等方面起著十分重要的作 用。然而，由于養(yǎng)殖人員對科學(xué)知識的缺乏以及一味地追求經(jīng)濟利益，致使濫用獸藥現(xiàn)象在 當(dāng)前畜牧業(yè)中普遍存在。濫用獸藥極易造成動物源食品中有害物質(zhì)的殘留，獸藥殘留嚴(yán)重 威脅著人們的身體健康和生命安全，同時嚴(yán)重影響我國動物性食品的出口貿(mào)易，成為當(dāng)前 亟待解決的問題。隨著人民生活水平的不斷提高，肉、禽、蛋、乳等動物性食品在我國人民的膳食結(jié) 構(gòu)中所占的比重越來越大。食品安全問題越來越為廣大消費者所關(guān)注，動物性食品中的獸 藥殘留問題已成為人們普遍關(guān)注的一個社會熱點問題。除了嚴(yán)格控制獸藥殘留的監(jiān)督管 理，還必須不斷研究新的檢測方法。建立一種高靈敏度和特異性的快速檢測獸藥殘留物的方法，便成為當(dāng)前該研究領(lǐng) 域亟需解決的問題之一。目前已有的獸藥殘留物檢測方法主要包括HPLC或LC-MS聯(lián)用技 術(shù)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細(xì)管電泳(CE)、薄層色譜法、免疫化學(xué)分析法。1.借助于HPLC或LC-MS聯(lián)用技術(shù)等大型精密儀器建立起來的獸藥殘留物儀器 檢測方法，對獸藥殘留物的檢測雖說具有很高的靈敏度，但是該方法不能一次就鑒定出分 析物的結(jié)構(gòu)，往往還需要用GC-MS確認(rèn)結(jié)構(gòu)，技術(shù)成本較高，傳統(tǒng)方法所需的時間一般都較 長，有的甚至長達(dá)幾個小時，操作復(fù)雜，且重現(xiàn)性差不能用于現(xiàn)場的快速檢測。2.高效液相色譜法(HPLC)檢測獸藥殘留是目前國內(nèi)絕大多數(shù)檢測機構(gòu)都在使用 的方法，雖然靈敏度高，但具有樣品的前處理相對復(fù)雜、檢測周期長、程序復(fù)雜、所需試劑繁 多等缺點。3.毛細(xì)管電泳(CE)所需樣品量極少，一般只需幾納克，靈敏度主要通過更靈敏的 檢測器或樣品預(yù)濃縮技術(shù)來解決。紫外檢測器能檢測到幾個問，但因樣品用量只有幾個nL 的體積，故所用濃度被限制在10_6級，因此在使用UV檢測器測定獸藥殘留時樣品一般要經(jīng) 過濃縮才能達(dá)到要求。4.薄層色譜分析法能夠檢測動物組織中的青霉素類殘留物，但其缺點是復(fù)雜，操 作費用高，時間長，而且靈敏度低。
5.免疫親和柱由于檢測費用過高而無法普及，應(yīng)用ELISA法時，由于樣品的復(fù)雜 多樣，使得分析人員在實際檢測樣品中易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。這些已越來越不適用現(xiàn)代檢測分析的要求。免疫傳感器具有無放射性污染、檢測 設(shè)備相對簡單、操作方便、靈敏度高、分析速度快、選擇性強、體系容易集成化、微型化等優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了一種樣品處理簡單、檢測速度快、靈敏度高、特 異性強的檢測獸藥殘留物的標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器的制備及檢測方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下措施來實現(xiàn)的一種檢測獸藥殘留物 的標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其特征是包括以下步驟(1)選擇能與獸藥殘留物識別的抗體；(2)制備石墨烯；(3)制備酶標(biāo)抗體；(4)利用組裝表面修飾技術(shù)等，將單層石墨烯、電活性物質(zhì)及酶標(biāo)抗體修飾到電極 表面，制作標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器。本發(fā)明所述將石墨烯、電活性物質(zhì)及酶標(biāo)抗體修飾到電極表面包括以下步驟(1)將所用電極進行預(yù)處理，用0. 05 μ m的氧化鋁粉仔細(xì)地打磨，依次在無水乙醇 和水中超聲清洗，再分別用無水乙醇、丙酮、純水清洗，氮氣干燥；(2)將制備的石墨烯超聲分散處理，得到分散的石墨烯溶液；(3)將分散的石墨烯溶液滴涂到步驟(1)處理的電極表面，晾干；(4)將步驟(3)石墨烯修飾的電極浸泡在含有電活性物質(zhì)和酶標(biāo)抗體溶液中 4-8h，溫度4 °C，洗凈，取出晾干；(5)將步驟(4)電極浸泡在含有待測抗原的樣品溶液中10-20min，溫度37。C，洗 滌；(6)將修飾后的電極結(jié)合電化學(xué)工作站進行測定。本發(fā)明所述的標(biāo)記物有酶和電活性物質(zhì)，用做標(biāo)記的酶有堿性磷酸酶、辣根過氧 化物酶、乳酸脫氧酶、葡萄糖氧化酶、尿素水解酶等。本發(fā)明所述電活性物質(zhì)包括二茂鐵衍生物、苯醌、氯醌、亞甲基監(jiān)、血紅素等。本發(fā)明的有益效果1.本發(fā)明是以抗原與抗體的特異性可逆結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)，較其他方法 具有更高的專一性和選擇性，非常適合于復(fù)雜機制中痕量組分的分離和檢測。2.該發(fā)明很大程度上簡化了前處理步驟，檢測設(shè)備相對簡單、使用方便，可以作為 相對獨立的快速檢測獸藥殘留的方法。3.發(fā)明另一特點是便攜性，其高度的自動化、微型化與集成化減少了對使用者及 環(huán)境技術(shù)條件的依賴，測定速度快，適合現(xiàn)場或野外進行快速篩選檢測。4.制備傳感器中將酶和電活性物質(zhì)作為標(biāo)記物，通過酶的催化放大作用，與免疫 分析的高特異性相結(jié)合，形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物，使檢測過程進行了放大，提高了電子的 傳遞效率，增強了其檢測靈敏度。
實施例1 (抗生素類，如氨芐青霉素)一種檢測氨芐青霉素的標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，包括以下步驟(1)選擇能與氨芐青霉素發(fā)生特異性識別的氨芐青霉素抗體；(2)石墨烯制備在超聲攪拌的條件下，向氧化石墨烯的分散液中，加入還原劑對 苯二酚，得到穩(wěn)定的石墨烯懸浮液；(3)取制備好的石墨烯，在環(huán)戊酮溶劑中，超聲30min，得到穩(wěn)定性較好的均勻分 散石墨烯溶液；(4)工作電極選用玻碳電極，將電極表面用0.05 μ m的氧化鋁粉仔細(xì)地打磨，依次 在無水乙醇和水中超聲清洗，再分別用無水乙醇、丙酮、純水清洗，氮氣干燥；(5)將分散的石墨烯溶液滴涂到處理后的電極表面，室溫下晾干；(6)酶標(biāo)抗體的制備選擇辣根過氧化物酶(HRP)作為標(biāo)記酶，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1. 25%的戊二醛反應(yīng)結(jié)合15h，溫度20°C，pH6. 5，經(jīng)凝膠柱洗脫，再與氨芐青霉素抗體溶液 混合，溫育4°C，電磁攪拌結(jié)合24h，然后4°C透析，磷酸緩沖溶液洗脫，分裝4-10°C保存；(7)傳感器的制備，將步驟(5)石墨烯修飾的電極浸泡在亞甲藍(lán)和辣根過氧化 物酶標(biāo)記的氨芐青霉素抗體混合溶液中5h后取出，再浸于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的明膠溶液中 30min。則氨芐青霉素傳感器制備完畢，用超純水沖洗干凈，保存待用。將上述制得的氨芐青霉素標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器結(jié)合電化學(xué)工作站，對食品 (雞蛋、奶品、肉品)中氨芐青霉素進行檢測。其檢測結(jié)果見表1。利用高效液相色譜法 (HPLC)對食品(雞蛋、奶品、肉品)中氨芐青霉素進行檢測，結(jié)果見表1。表1本發(fā)明標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器與高效液相色譜法(HPLC)檢測效果對比
權(quán)利要求
一種檢測獸藥殘留物的標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其特征是包括以下步驟1.1選擇能與獸藥殘留物識別的抗體；1.2制備石墨烯；1.3制備酶標(biāo)抗體；1.4利用組裝表面修飾技術(shù)等，將單層石墨烯、電活性物質(zhì)及酶標(biāo)抗體修飾到電極表面，制作標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述電極制備方法，其特征是所述將石墨烯、電活性物質(zhì)及酶標(biāo)記 抗體修飾到傳感器電極表面包括以下步驟2. 1將所用電極進行預(yù)處理，用0. 05 μ m的氧化鋁粉仔細(xì)地打磨，依次在無水乙醇利水 中超聲清洗，再分別用無水乙醇、丙酮、純水清洗，氮氣干燥；2. 2將制備的石墨烯超聲分散處理，得到分散的石墨烯溶液；2. 3將分散的石墨烯溶液滴涂到經(jīng)處理的電極表面；2.4將步驟2. 3石墨修飾的電極浸泡在含有電活性物質(zhì)和酶標(biāo)抗體溶液中4-8h，溫度 4°C，洗凈，取出晾干。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述電極制備方法，其特征是所述石墨烯的制備采用以下步驟在 超聲攪拌的條件下，向氧化石墨烯的分散液中，加入還原劑對苯二酚，得到穩(wěn)定的石墨烯懸 浮液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述電極制備方法，其特征是酶標(biāo)抗體的制備采用以下步驟 選擇合適的標(biāo)記酶，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25%的戊二醛反應(yīng)結(jié)合15-20h，溫度10-40°C，pH 6. 0-8. 0，經(jīng)凝膠柱洗脫，再與抗體溶液混合，溫育4°C，電磁攪拌結(jié)合20-24h，然后4°C透 析，磷酸緩沖溶液洗脫，分裝4-10°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的電極制備方法，其特征是所述用做標(biāo)記的酶有堿性磷酸酶、 辣根過氧化物酶、乳酸脫氧酶、葡萄糖氧化酶、尿素水解酶等。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電極制備方法，其特征是標(biāo)記型免疫傳感器的制備采用以下 步驟將經(jīng)過處理的電極浸泡在酶標(biāo)抗體和電活性物質(zhì)的混合液中3-5h，再浸于質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為5%的明膠溶液中20-30min。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述電極制備方法，其特征是所述電活性物質(zhì)包括二茂鐵衍生物、 苯醌、氯醌、亞甲基藍(lán)、血紅素等。
8.—種檢測痕量獸藥殘留物的方法，其特征是包括如下步驟將權(quán)利要求1所述的標(biāo) 記型免疫傳感器結(jié)合電化學(xué)工作站，用于對食品樣品中的獸藥殘留物的檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測獸藥殘留物的標(biāo)記型傳感器及檢測獸藥殘留物的方法。該傳感器的制備，包括以下步驟選擇能與獸藥殘留物相互作用的抗體；選擇合適的標(biāo)記物(酶和電活性物質(zhì))與抗體結(jié)合；選擇合適的電極，進行預(yù)處理，并利用組裝表面修飾技術(shù)等，將標(biāo)記抗體修飾到電極表面，制作標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器。一種檢測獸藥殘留物的方法，包括如下步驟將經(jīng)過修飾的電極浸入到含有待測獸藥殘留物的樣品中，通過電信號強度進行檢測。本發(fā)明的傳感器特異性強，靈敏度高，操作簡單，反應(yīng)及結(jié)果均由儀器自動完成和記錄。
文檔編號G01N33/558GK101995462SQ20101052406
公開日2011年3月30日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月29日
發(fā)明者于京華, 盧娟娟, 張叢叢, 戴平, 葛慎光, 顏梅, 高亮 申請人:濟南大學(xué)