專利名稱：分析蛋白的抗原表位的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析蛋白的抗原表位的方法。
技術(shù)背景
宿主的抗體反應(yīng)在抵抗病原體感染的過程中起著重要作用，而體內(nèi)的多克隆抗 體反應(yīng)是由針對(duì)不同抗原或同一抗原的不同抗原表位的單克隆抗體組成的。深入的理解 這個(gè)復(fù)雜的過程能夠?yàn)檠芯考膊〉陌l(fā)病機(jī)制提供關(guān)鍵的信息，還能夠?yàn)楦咝б呙绲难邪l(fā) 和疾病治療提供重要的理論基礎(chǔ)。
在抗原表位的諸多研究方法中，興起于1990年的噬菌體展示肽庫技術(shù) (Scott, J.K.and G.P.Smith, Searching for peptide ligands with an epitope library.Science,1990.249 (4967) p.386-90.),即用隨機(jī)合成的短肽文庫(一般6_12個(gè)氨基酸，庫容量達(dá) IOll-IO12)和噬菌體展示系統(tǒng)進(jìn)行篩選的方法，以其快捷、準(zhǔn)確、不受氨基酸位點(diǎn)限制的 優(yōu)點(diǎn)而逐漸成為目前應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的抗原表位篩選平臺(tái)之一。然而，噬菌體展示 肽庫技術(shù)也存在很大的局限性(1)短肽文庫可以產(chǎn)生的絕大部分是線性表位，不能很 好地模擬占抗原表位80%以上的構(gòu)象型表位；(2)噬菌體的衣殼蛋白所能容納的外源分 子小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，對(duì)外源蛋白缺乏修飾，該系統(tǒng)中很多細(xì)胞毒性分子和真核生物蛋白難 以表達(dá)和展示；( 噬菌體個(gè)體過小，多采用親合層析柱或親合聚苯乙烯板進(jìn)行篩選， 篩選效率低；(4)每輪篩選后，噬菌體必須重新感染宿主細(xì)胞以便獲得足夠的病毒粒子 進(jìn)行下一輪篩選，重組病毒粒子間感染能力的差別會(huì)造成一定的擴(kuò)增優(yōu)勢(shì)；( 噬菌體 易被空氣傳播，因而容易引起交叉污染。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種分析蛋白的抗原表位的方法。
本發(fā)明提供的分析蛋白的抗原表位的方法，包括如下步驟
(1)構(gòu)建目的蛋白的DNA文庫；所述DNA文庫中，所述目的蛋白的編碼基因的 DNA片段插入T載體；所述T載體含有酵母a凝集素Aga2p的編碼基因，且所述DNA 片段編碼的肽片段的N端與所述酵母a凝集素Aga2p的C端融合；
(2)將所述DNA文庫展示在酵母表面，得到酵母展示文庫；
(3)將目的蛋白的抗體與酵母展示文庫混合，分選出與抗體結(jié)合的酵母；
(4)將篩選出的酵母提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)插入所述T載體的DNA片段的核 苷酸序列分析蛋白的抗原表位(包括線型表位和構(gòu)象型表位)。
所述T載體為在PCTC0N2質(zhì)粒的Nhe I和BamH I位點(diǎn)之間插入序列表的序列 表3自5’末端第11至40位核苷酸所示的DNA得到的pCTC0N2_T質(zhì)粒；所述目的蛋 白的DNA片段插入所述pCTC0N2-T質(zhì)粒的Xcm I酶切位點(diǎn)。
所述酵母為釀酒酵母，優(yōu)選為釀酒酵母EBY100。
所述方法中，可利用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)進(jìn)行步驟(3)中的所述分選。3
步驟O)中，將所述DNA文庫展示在所述酵母表面包括如下步驟
①提取所述DNA文庫的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述酵母，得到重組酵母；
②收集重組酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)36小時(shí)以上，得到酵母展示文庫；所述誘導(dǎo)是通過向 培養(yǎng)酵母的體系中加入半乳糖實(shí)現(xiàn)的。
所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的參數(shù)具體可為采用SGCAA培養(yǎng)基，20°C、250rpm搖床中培 養(yǎng)36小時(shí)。SGCAA培養(yǎng)基的配方具體為半乳糖20g，酵母氮源6.7g，酸水解酪素相， NaHPO4 · 12H20 13.6g, NaH2PO4 · H2O 8.56g,加重蒸水至 1L。
構(gòu)建所述DNA文庫的方法包括如下步驟
(1)將目的蛋白的編碼基因用DNase I進(jìn)行消化，回收50_100bp的DNA片段；
(2)將步驟(1)回收的DNA片段進(jìn)行隨機(jī)片段重組；
(3)將步驟⑵重組后的DNA片段加A尾；
(4)將加A尾后的DNA片段插入所述pCTCON2_T質(zhì)粒的Xcm I酶切位點(diǎn)，然后轉(zhuǎn)化宿主菌，得到所述DNA文庫。
所述隨機(jī)片段重組的反應(yīng)體系具體可為90ng小片段DNA，4μ1 5XPhire buffer, 0.8 μ 1 dNTPs, 0.5 μ 1 Phire DNA 聚合酶(1 個(gè)單位)，力卩 ddH20 至 20 μ 1。所述隨機(jī)片段重組的反應(yīng)程序具體可為95°C 2分鐘；94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C N秒鐘， 10個(gè)循環(huán)或15個(gè)循環(huán)；72°C 10分鐘；第1個(gè)循環(huán)時(shí)，N為60秒，自第2個(gè)循環(huán)開始， 每個(gè)循環(huán)比上個(gè)循環(huán)N增加k (即第2個(gè)循環(huán)時(shí)，N為65秒，第3個(gè)循環(huán)時(shí)N為70秒， 以此類推)。所述反應(yīng)程序中，優(yōu)選10個(gè)循環(huán)或15個(gè)循環(huán)。
也可用物理剪切法、隨機(jī)引物擴(kuò)增法和酶消化法等方法構(gòu)建目標(biāo)蛋白的DNA文庫。
所述目的蛋白的抗體可為多克隆抗體(如商購的多克隆抗體或用目的蛋白免疫 動(dòng)物得到的多克隆抗體)或單克隆抗體。
所述宿主菌可為大腸桿菌，優(yōu)選大腸桿菌DH5a。
所述目的蛋白可為序列表的序列1所示的蛋白(H5N1禽流感病毒的HA蛋白)。 所述目的蛋白的編碼基因優(yōu)選序列表的序列2所示的DNA。
本發(fā)明還保護(hù)pCTCON2-T質(zhì)粒，是在pCTCON2質(zhì)粒的Nhe I和BamH I位點(diǎn)之間插入序列表的序列表3自5’末端第11至40位核苷酸所示的DNA得到的。
本發(fā)明還保護(hù)-種酵母表面展示系統(tǒng)，包括所述pCTCON2-T質(zhì)粒和酵母。
所述酵母可為釀酒酵母，優(yōu)選為釀酒酵母EBY100。
上述方法基于如下原理信號(hào)肽引導(dǎo)外源多肽向細(xì)胞外分泌，外源多肽片段的 N端與酵母a凝集素Aga2p的C端融合(320個(gè)氨基酸殘基，含有GPI錨的信號(hào)序列)， 可通過Aga2p錨定到酵母表面的Agalp受體，從而暴露在酵母細(xì)胞表面。
與噬菌體展示相比，酵母表面展示系統(tǒng)在構(gòu)建和篩選蛋白文庫方面具有獨(dú)到的 優(yōu)點(diǎn)(1)酵母細(xì)胞對(duì)蛋白的修飾途徑更多，可以方便地展示大分子量和復(fù)雜的蛋白， 以更好的模擬空間構(gòu)象；( 酵母可采用FACS逐個(gè)篩選，大大提高準(zhǔn)確性與篩選通量； (3)酵母可獨(dú)立完成自身的生長復(fù)制過程，操作簡(jiǎn)便，干擾因素少；(4)酵母不易被空氣 傳播，不易交叉感染。


圖1為表面展示HA、HAU HA2的酵母的流式檢測(cè)結(jié)果。
圖2為熒光顯微鏡下觀察HA在重組酵母甲表面展示的情況。
圖3為H5N1-HA蛋白的抗原表位的分析流程圖。
圖4為構(gòu)建H5N1-HA蛋白的DNA文庫過程中的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖5為FACS分選前后的FACS分析結(jié)果(富集效果)。
圖6為分選得到的部分單個(gè)酵母克隆的FACS檢測(cè)結(jié)果。
圖7為序列比對(duì)結(jié)果。
圖8為頻率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
圖9為血清優(yōu)勢(shì)識(shí)別區(qū)域。
具體實(shí)施方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí) 驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。FACS分析和分選采用AriaII流式細(xì)胞儀進(jìn)行。 下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。 以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
pCTCON2質(zhì)粒(酵母展示載體)由MIT Dane Wittrup教授惠贈(zèng)，公眾可以從清 華大學(xué)獲得；參考文獻(xiàn)Chao, G.，etal.，Isolating and engineering humanantibodies using yeast surface display.NATURE PROTOCOLS, 2006.1(2) p.755-768)。
釀酒酵母EBYlOO invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)C839-00。Biomed質(zhì)粒小提 試劑盒博邁德公司。大腸桿菌DH5 α 天根公司。Phire DNA聚合酶(Phire hot-start DNAPolymerase) New England Biolabs。單鏈 carrier DNA (鮭魚精 DNA) Merck 公司， 產(chǎn)品目錄號(hào)CB262012o
YPD培養(yǎng)基葡萄糖2g，蛋白胨2g，酵母提取物lg，加重蒸水至100ml。
SDCAA培養(yǎng)基葡萄糖20g，酵母氮源6.7g，酸水解酪素5g，NaHPO4 · 12H20 13.6g，NaH2PO4 · H2O 8.56g，加重蒸水至 1L。
SDCAA平板葡萄糖20g，酵母氮源6.7g，酸水解酪素5g，瓊脂粉15g， NaHPO4 · 12H2013.6g, NaH2PO4 · H2O 8.56g,加重蒸水至 1L。
SGCAA培養(yǎng)基半乳糖20g，酵母氮源6.7g，酸水解酪素5g，NaHPO4 · 12H20 13.6g，NaH2PO4 · H2O 8.56g，加重蒸水至 1L。
實(shí)施例1、pCTCON2質(zhì)粒和酵母展示外源蛋白能力的評(píng)價(jià)
1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
將H5N1-HA蛋白的編碼基因(H5N1禽流感病毒的HA蛋白，如序列表的序列1 所示，其編碼基因如序列表的序列2所示)插入pCTCON2質(zhì)粒的Nhe I和BamH I位點(diǎn) 之間，得到重組質(zhì)粒甲。
將H5N1-HA1蛋白的編碼基因(如序列表的序列2自5’末端第1_987位核苷 酸所示，編碼序列表的序列1自N末端第1至3 位所示的氨基酸殘基)插入pCTCON2 質(zhì)粒的Nhe I和BamH I位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒乙。
將H5N1-HA2蛋白的編碼基因(如序列表的序列2自5’末端第988-1545位核苷酸所示，編碼序列表的序列1自N末端第330至515位所示的氨基酸殘基)插入pCTCON2 質(zhì)粒的Nhe I和BamH I位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒丙。
2、重組酵母的獲得
將重組質(zhì)粒甲轉(zhuǎn)化酵母菌株EBY100，得到重組酵母甲。
將重組質(zhì)粒乙轉(zhuǎn)化酵母菌株EBY100，得到重組酵母乙。
將重組質(zhì)粒丙轉(zhuǎn)化酵母菌株EBY100，得到重組酵母丙。
3、外源蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
分別將重組酵母甲、重組酵母乙和重組酵母丙進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，然后用H5N1-HA 蛋白免疫的小鼠血清和FITC熒光標(biāo)記的抗小鼠的二抗進(jìn)行酵母染色，最后分別利用 FACS檢測(cè)和熒光顯微鏡檢測(cè)表面展示情況。
FACS檢測(cè)結(jié)果見圖1;同陰性對(duì)照相比，三種酵母都能被熒光標(biāo)記，出現(xiàn)了一 個(gè)陽性峰；比較HAl和HA2的流式結(jié)果還可以看出，HAl酵母的熒光強(qiáng)度比HA2酵母 的熒光強(qiáng)度要強(qiáng)，這反映了在H5N1-HA蛋白免疫的小鼠多抗血清中，大部分抗體是針對(duì) HAl的。重組酵母甲的熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果見圖2，在熒光顯微鏡下可以觀察到，酵母 表面有綠色熒光。以上兩個(gè)結(jié)果表明酵母展示系統(tǒng)能夠很好的工作。
實(shí)施例2、pCTCON2-T質(zhì)粒(重組酵母展示載體)的構(gòu)建
為了便于建庫，需要將pCTCON2質(zhì)粒改造成T載體，步驟如下
1、合成序列表的序列3所示的DNA(雙鏈)。
5， -AGTCGCTAGC CCAGGGATAGGGTGGCCACCCTATCCCTGGGGATCCGGGT-3，(序列 3)。
左邊的下劃線標(biāo)注Nhe I識(shí)別序列，右邊的下劃線標(biāo)注BamH I識(shí)別序列，粗體 標(biāo)注兩個(gè)Xcm I識(shí)別序列。
2、用限制性內(nèi)切酶Nhe I和BamH I雙酶切步驟1合成的DNA，回收酶切產(chǎn)物。
3、用限制性內(nèi)切酶Nhe I和BamH I雙酶切pCTCON2質(zhì)粒，回收載體骨架。
4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到pCTCON2-T質(zhì)粒(骨 架載體為pCTCON2質(zhì)粒，在骨架載體的Nhe I和BamH I位點(diǎn)之間插入了序列表3自5， 末端第11至40位核苷酸所示的DNA)。pCTCON2-T質(zhì)粒在pCTCON2質(zhì)粒里引入了兩 個(gè)Xcm I酶切位點(diǎn)，用限制性內(nèi)切酶Xcm I酶切會(huì)形成T尾。
實(shí)施例3、應(yīng)用本發(fā)明的方法分析H5N1-HA蛋白的抗原表位
應(yīng)用本發(fā)明的方法篩選H5N1-HA蛋白的抗原表位，流程如圖3所示。首先隨 機(jī)切割H5N1-HA蛋白的編碼基因并進(jìn)行重組，得到隨機(jī)片段；將隨機(jī)片段通過T-A連 接插入PCTCON2-T質(zhì)粒；然后轉(zhuǎn)化釀酒酵母，誘導(dǎo)表達(dá)后多種融合多肽(隨機(jī)片段編碼 的多肽與Aga2蛋白的C端融合)展示在釀酒酵母表面(酵母展示文庫)；通過H5N1-HA 蛋白的抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)進(jìn)行FACS分選，獲得與抗體結(jié)合的重組酵母； 將各個(gè)篩選得到的重組酵母提質(zhì)粒測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行抗原抗體相互作用的研究。
一、構(gòu)建H5N1-HA蛋白的DNA文庫(H5N1-HA隨機(jī)切割片段文庫)
構(gòu)建H5N1-HA蛋白的DNA文庫，首先將H5N1-HA蛋白的編碼基因通 過DNaseI進(jìn)行隨機(jī)切割，獲得約50_100bp的小片段，然后通過隨機(jī)重組得到具有特 定長度分布的隨機(jī)片段 DNA 文庫(Lin，Ζ.，S.Li and Y.Chen, Identification of ViralPeptideFragments for Vaccine Development.Viral Applications of Green FluorescentProtein Methods and Protocols, 2009 p.261-274. ； Chen, Y., et al.，Randomdissection to select for protein split sites and its application in proteinfragment complementation.PROTEIN SCIENCE, 2009.18 (2) p.399-409.)。上述方法非常類似于 DNA shuffling 的程序 (Lorimer, Land I.Pastan, Randomreeombination of antibody single-chain fv sequences after fragmentation withdnasei in the presence of Mn2+.Nucleic Acids Res, 1995.23 (15) p.3067-3608.),巧妙地利用片段重組過程來調(diào)節(jié)隨機(jī)片段DNA文庫的分布，可根據(jù)篩選 需要構(gòu)建更為合理的文庫，為獲得關(guān)鍵的構(gòu)象型抗原表位提供基礎(chǔ)。
1、大量擴(kuò)增目的基因
①進(jìn)行目的基因PCR擴(kuò)增
合成序列表的序列2所示的H5N1-HA蛋白的編碼基因，作為模板，用HA_F和 HA-R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(模板DNA)。模板DNA的瓊 脂糖凝膠電泳圖見圖4的泳道A。
HA-F 5，-GATCAGATTTGCATTGGTTA-3，；
HA-R 5，-TATTTGGTAAGTTCCTATTG-3，。
②采用QIAquick PCR Purification Kit純化回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行DNA定量 (DNA的濃度應(yīng)大于130ng/ μ 1)。
2、DNase I 隨機(jī)消化
①準(zhǔn)備DNase I 底物溶液；4 μ g 模板 DNA、2.5 μ 1 IM Tris-Cl (ρΗ7.5)，10 μ 1 50mMMnCl2,力口 ddH20 至 49 μ 1。
②加入1 μ 1 DNaseI(0.075U)(購自 Worthington 公司，產(chǎn)品目錄號(hào) LS006361)， 15°C 反應(yīng) 4min。
③加入10 μ 1 0.5Μ EDTA水溶液終止反應(yīng)。
④90°C放置10分鐘，進(jìn)一步使DNase I失活。
3、純化DNase I酶切片段產(chǎn)物
①使用Pall超濾濃縮離心管(截留分子量為30K)過濾去除步驟2的反應(yīng)體系中 的模板DNA。
②將步驟①收集的濾液通過Pall超濾濃縮離心管(截留分子量為3K)，回收分 子量為3K以下的小片段DNA。采用Nanodrop 2000分光光度計(jì)(rThermo)確定DNA濃度。
步驟②得到的小片段DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖4的泳道B，大小為 50-100bp。
4、小片段DNA的重組
將步驟3得到的小片段DNA進(jìn)行隨機(jī)片段重組，得到隨機(jī)片段。
重組反應(yīng)體系90ng小片段 DNA，4 μ 1 5 XPhire buffer, 0.8 μ 1 dNTPs, 0.5 μ 1 PhireDNA聚合酶(1個(gè)單位)，加ddH20至20 μ 1。
重組反應(yīng)程序95°C 2分鐘；94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C N秒鐘，10個(gè)循 環(huán)或15個(gè)循環(huán)；72°C 10分鐘；4°C保存。第1個(gè)循環(huán)時(shí)，N為60秒，自第2個(gè)循環(huán)開 始，每個(gè)循環(huán)比上個(gè)循環(huán)N增加即第2個(gè)循環(huán)時(shí)，N為65秒，第3個(gè)循環(huán)時(shí)N為70秒，以此類推)
得到的隨機(jī)片段用QIAquick PCR Purification Kit純化并定量其濃度。
10個(gè)循環(huán)得到的隨機(jī)片段的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖4的泳道C，大小為 100-500bp。15個(gè)循環(huán)得到的隨機(jī)片段的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖4的泳道D，大小為 200-800bp。將15個(gè)循環(huán)得到的隨機(jī)片段進(jìn)行步驟5。
5、隨機(jī)片段加A尾
將步驟4得到的隨機(jī)片段采用Α-tailing DNAKit(Takara)按試劑盒的說明書加A尾，具體步驟如下
在微量離心管中配制如下加“A”反應(yīng)液(50ul) IOXA-Tailing Buffer 5 μ 1, dNTP Mixture 4 μ 1，Α-Tailing Enzyme 0.5 μ 1，隨機(jī)片段 2 μ g，力口 ddH20 至 50 μ 1 ； 72°C反應(yīng)20分鐘，然后冰浴4分鐘；然后用QIAquick PCR Purification Kit純化，并用 Nanodrop2000分光光度計(jì)定量DNA片段濃度。
6、骨架載體的制備
用限制性內(nèi)切酶酶切pCTCON2-T質(zhì)粒，得到骨架載體。
酶切體系pCTCON2-T質(zhì)粒 24 μ g，10XNEB buffer2 10 μ 1，10XBSA 1 μ 1， 限制性內(nèi)切酶Xcm I 2 μ 1，力卩ddH20至100 μ 1。
反應(yīng)條件37°C水浴3-6小時(shí)。
采用QIA quick Gel Extraction ICit回收酶切產(chǎn)物。將回收的酶切產(chǎn)物用 QIAquickPCR Purification Kit純化，并用Nanodrop2000分光光度計(jì)定量DNA片段濃度。
7、隨機(jī)片段庫與載體的結(jié)合
將步驟5加“A”后的隨機(jī)片段和步驟6的骨架載體恒溫金屬浴16°C連接過 夜(12小時(shí)以上均可)。連接體系10XT4 ligase buffer 20 μ 1，力卩“Α”后的隨機(jī)片段 (1 μ g)，骨架載體(4 μ g)，T4 ligase (New England Biolabs) 10 μ 1，力口 ddH20 M 200 μ L
8、電轉(zhuǎn)
①用QIAquick PCR Purification Kit純化步驟7的連接混合物。
②將純化后的片段電轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5a細(xì)胞中。
③涂LB平板(含50mg/ml氨芐青霉素)，37°C溫箱中過夜培養(yǎng)，次日查看轉(zhuǎn)化 結(jié)果，統(tǒng)計(jì)板上的菌落數(shù)(庫容量)。庫容量為500,000左右。
④采用刮板器刮干凈LB平板上的菌落，放入60ml LB培養(yǎng)基(含lOOmg/ml氨 芐青霉素)，即為H5N1-HA蛋白的DNA文庫。
二、酵母轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)和誘導(dǎo)
1、酵母轉(zhuǎn)化
平行進(jìn)行10組酵母轉(zhuǎn)化，每組均采用如下方法
(1)從YPD平板上挑取一個(gè)新鮮的釀酒酵母EBY100單克隆至5ml YPD液體培 養(yǎng)基，30°C 250rpm過夜培養(yǎng)；
(2)將過夜培養(yǎng)物稀釋至OD600值為0.4-0.5，在30°C搖床中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600 值達(dá)到2(約4小時(shí))；
(3)室溫1500g離心5分鐘，棄上清，收集酵母細(xì)胞；用25ml無菌水重懸酵母 細(xì)胞，室溫1500g離心5分鐘，棄上清，收集酵母細(xì)胞；8
(4)用Iml 0.1M醋酸鋰溶液重懸酵母細(xì)胞，30C水浴10分鐘，然后13000g離心5s,棄上清，收集酵母細(xì)胞；
(5)用0.5ml 0.1M醋酸鋰溶液重懸酵母細(xì)胞，50ul每管分裝(感受態(tài)細(xì)胞)；
(6)將單鏈carrier DNA放入沸水中水浴5分鐘，然后立即取出冰??；
(7)采用Biomed質(zhì)粒小提試劑盒(博邁德)提取步驟一得到的DNA文庫的質(zhì) 粒，將1 μ g質(zhì)粒稀釋至50ul ；
(8)取一管步驟( 得到的感受態(tài)細(xì)胞，13000g離心&，棄上清；依次加入 240 μ 50% PEG溶液、36 μ 1 IM 醋酸鋰溶液、25 μ 1 單鏈 carrier DNA、50ul 步驟(7)的 質(zhì)粒，充分混勻；30°C水浴30分鐘，然后42°C水浴15分鐘；13000g離心&，棄上清， 收集酵母細(xì)胞；
(9)用Iml無菌水重懸酵母細(xì)胞，取出IOOul涂SDCAA平板，在30°C恒溫箱中 放置約48小時(shí)，能看到明顯的菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算酵母轉(zhuǎn)化效率。每一組的轉(zhuǎn)化效 率(菌落數(shù))為50,000-100,000,10組的庫容量就是500,000-1000,000，能夠涵蓋通過理論 計(jì)算的絕大多數(shù)克隆。
2、誘導(dǎo)
(1)每組剩余的900ul菌液用IOml SDCAA重懸后混合在一起，30°C，250rpm搖 床中培養(yǎng)至OD600約為3 (24小時(shí))。
(2)取500微升菌液，室溫8000rpm離心1分鐘，棄上清，用Iml SGCAA培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后稀釋至OD600在0.5-1之間；
(3) 200C 250rpm搖床中誘導(dǎo)36小時(shí)，得到的菌液即為酵母展示文庫。
三、酵母展示文庫的FACS分選及FACS分選效果評(píng)價(jià)
1、篩選血清的制備
用H5N1-HA蛋白(北京義翹神州生物技術(shù)公司貨號(hào)11048-V08H1)免疫 BALB/c小鼠(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所，SPF級(jí))，采用腹部皮下免疫注射，共免疫 4次，每次間隔3周，第1次免疫劑量為20ug/只，其余次數(shù)免疫劑量為IOug/只；第4 次免疫后取血清作為篩選血清；第1次免疫前取血清作為陰性對(duì)照血清。
2、酵母展示文庫的FACS分選
將步驟二得到的酵母展示文庫進(jìn)行FACS分析或FACS分選(FACS分析取IO6-IO7 個(gè)細(xì)胞，F(xiàn)ACS分選取IO7-IO8個(gè)細(xì)胞)。FACS分析中用陰性血清作為篩選血清的對(duì)照。
①取酵母細(xì)胞裝入1.5ml Ep管中，8000rpm(或> 8000rpm也可)離心1分鐘，棄上清；
②加入lmlPBS，輕彈管壁將酵母重懸，8000rpm離心1分鐘，取沉淀；重復(fù)此操作一次；
③加入用50ul PBS 100倍稀釋的篩選血清，輕彈混勻，冰浴1小時(shí)，期間每隔 15-20分鐘輕彈管壁；
④加入lmlPBS，混勻，8000rpm 4°C離心1分鐘，取沉淀；重復(fù)此操作一次；
⑤加入用50ul PBS 100倍稀釋的熒光標(biāo)記的二抗(PE標(biāo)記羊抗鼠^G，購自 SantaCruz公司，貨號(hào)sc-3738)，輕彈混勻，冰浴45分鐘，期間每隔15-20分鐘輕彈管壁 (注意避光)；
⑥加入lmlPBS，混勻，8000rpm 4°C離心1分鐘，取沉淀(酵母)；重復(fù)此操作一次；
⑦用PBS重懸酵母(FACS分析用0.5-lml PBS, FACS分選用3_4ml PBS)，轉(zhuǎn) 移到流式細(xì)胞儀進(jìn)行FACS分選或FACS分析。
采用陰性血清的FACS分析圖譜見圖5A，采用篩選血清的FACS分析圖譜見圖 5B。與篩選血清結(jié)合的酵母細(xì)胞約占2%。FACS分選中收集與篩選血清結(jié)合的酵母細(xì) 胞。
3、FACS分選效果評(píng)價(jià)
將步驟2分選得到的酵母細(xì)胞(10萬-50萬)轉(zhuǎn)移到試管中，加入SDCAA培 養(yǎng)基至總體積為2ml，將試管置于30°C搖床中，讓酵母復(fù)蘇2-3小時(shí)。取出200ul(大約 5000-10000個(gè)酵母細(xì)胞)復(fù)蘇的菌液涂SDCAA平板，將平板倒置在30°C恒溫箱中，48 小時(shí)后收菌，得到55個(gè)陽性單克隆；剩余的菌液加入SDCAA至總體積為5ml，30°C搖 床培養(yǎng)M小時(shí)(混合菌液)。將陽個(gè)陽性單克隆和混合菌液分別進(jìn)行誘導(dǎo)，然后進(jìn)行 FACS分析。誘導(dǎo)方法同步驟二的2。FACS分析方法同步驟三的1。
混合菌的FACS分析圖譜見圖5C，與篩選血清結(jié)合的酵母細(xì)胞占40%左右。
11個(gè)單克隆的FACS分析結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，不同的單克隆的圖譜 是不一樣的，這表明不同的單克隆與血清的反應(yīng)情況是不一樣的。
四、測(cè)序及序列分析
1、對(duì)于步驟三的3中FACS分析為陽性的克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后，用甘油凍存菌種 (甘油終濃度15% )，剩余全部菌液用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒；
2、由于從酵母中提取的質(zhì)?？截悢?shù)很低，將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5a,然后進(jìn)行測(cè)序(檢測(cè)插入pCTCON2-T質(zhì)粒中的片段的核苷酸序列)。
3、序列分析
采用kquencher軟件將插入到pCTCON2載體中的隨機(jī)片段與HA全長進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果見圖7。采用Excel軟件依照序列比對(duì)結(jié)果將HA上每個(gè)位點(diǎn)上氨基酸出現(xiàn)的 頻率進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖8。采用PyMOL軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果和蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分 析，結(jié)果見圖9。kquencher軟件，Excel軟件和PyMOL (軟件均無特殊的參數(shù)設(shè)定，均 按照軟件的操作手冊(cè)進(jìn)行分析。
挑選出來的片段都是能與多克隆抗體血清反應(yīng)的片段，從頻率圖就可以看出多 抗識(shí)別位點(diǎn)的分布情況。血清主要識(shí)別HA1，在HAl與HA2的交界處都沒有識(shí)別位點(diǎn)。 血清中的多克隆抗體有80%是針對(duì)HAl的，20%是針對(duì)HA2。另外，血清中的多克隆 抗體在HAl區(qū)域有兩個(gè)優(yōu)勢(shì)識(shí)別區(qū)域，位于70aa_120aa和150aa_200aa，這兩個(gè)區(qū)域都位 于HA的受體結(jié)合區(qū)域(ReceptorBinding Domain)，藍(lán)色區(qū)域位于70aa_120aa，粉紅色區(qū) 域位于 150aa_200aa。
重復(fù)進(jìn)行三次實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)，均得到相似的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.分析蛋白的抗原表位的方法，包括如下步驟(1)構(gòu)建目的蛋白的DNA文庫；所述DNA文庫中，所述目的蛋白的編碼基因的 DNA片段插入T載體；所述T載體含有酵母a凝集素Aga2p的編碼基因，且所述DNA 片段編碼的肽片段的N端與所述酵母a凝集素Aga2p的C端融合；(2)將所述DNA文庫展示在酵母表面，得到酵母展示文庫；(3)將目的蛋白的抗體與酵母展示文庫混合，分選出與抗體結(jié)合的酵母；(4)將篩選出的酵母提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)插入所述T載體的DNA片段的核苷酸 序列分析蛋白的抗原表位。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述T載體為在pCTCON2質(zhì)粒的NheI 和BamH I位點(diǎn)之間插入序列表的序列表3自5’末端第11至40位核苷酸所示的DNA得 到的pCTCON2-T質(zhì)粒；所述目的蛋白的DNA片段插入所述pCTCON2_T質(zhì)粒的Xcm I 酶切位點(diǎn)；所述酵母為釀酒酵母，優(yōu)選為釀酒酵母EBY100。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法中，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行步 驟(3)中的所述分選。
4.如權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于步驟(2)中，將所述DNA文庫 展示在所述酵母表面包括如下步驟①提取所述DNA文庫的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述酵母，得到重組酵母；②收集重組酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)36小時(shí)以上，得到酵母展示文庫；所述誘導(dǎo)是通過向培養(yǎng) 酵母的體系中加入半乳糖實(shí)現(xiàn)的。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于步驟(1)中，構(gòu)建所述DNA 文庫的方法包括如下步驟(1)將目的蛋白的編碼基因用DNaseI進(jìn)行消化，回收50_100bp的DNA片段；(2)將步驟(1)回收的DNA片段進(jìn)行隨機(jī)片段重組；(3)將步驟(2)重組后的DNA片段加A尾；(4)將加A尾后的DNA片段插入所述pCTCON2-T質(zhì)粒的XcmI酶切位點(diǎn)，然后轉(zhuǎn) 化宿主菌，得到所述DNA文庫。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述宿主菌為大腸桿菌，優(yōu)選大腸桿菌 DH5a。
7.如權(quán)利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述目的蛋白為序列表的序列 1所示的蛋白；所述目的蛋白的編碼基因優(yōu)選序列表的序列2所示的DNA。
8.pCTCON2-T質(zhì)粒，是在pCTCON2質(zhì)粒的NheI和BamH I位點(diǎn)之間插入序列表的 序列表3自5’末端第11至40位核苷酸所示的DNA得到的。
9.一種酵母表面展示系統(tǒng)，包括權(quán)利要求8所述的pCTCON2-T質(zhì)粒和酵母。
10.如權(quán)利要求9所述的酵母表面展示系統(tǒng)，其特征在于所述酵母為釀酒酵母，優(yōu) 選為釀酒酵母EBY100。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分析蛋白的抗原表位的方法。本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)構(gòu)建目的蛋白的DNA文庫；蛋白的編碼基因的DNA片段插入T載體；T載體含酵母a凝集素Aga2p的編碼基因，DNA片段編碼的肽段與酵母a凝集素Aga2p的C端融合；(2)將DNA文庫展示在酵母表面，得到酵母展示文庫；(3)分選出與目的蛋白的抗體結(jié)合的酵母；(4)提取質(zhì)粒測(cè)序，分析蛋白的抗原表位。本發(fā)明具如下優(yōu)點(diǎn)(1)酵母細(xì)胞對(duì)蛋白的修飾途徑多，可方便地展示大分子量和復(fù)雜的蛋白，更好的模擬空間構(gòu)象；(2)酵母可采用FACS逐個(gè)篩選，提高準(zhǔn)確性與篩選通量；(3)酵母可獨(dú)立完成自身的生長復(fù)制過程，操作簡(jiǎn)便，干擾因素少；(4)酵母不易被空氣傳播，不易交叉感染。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102021242SQ201010526018
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月25日
發(fā)明者劉中華, 史宣玲, 左騰, 張林琦, 徐望暉, 林章凜 申請(qǐng)人:清華大學(xué)