專(zhuān)利名稱(chēng)：用于檢測(cè)肺癌腫瘤標(biāo)志物的分子印跡聚合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及材料化學(xué)和電化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)肺癌腫瘤標(biāo)志物的分子印跡聚合物的制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤的發(fā)生、增殖是一個(gè)逐漸演變的過(guò)程，在這個(gè)漸變過(guò)程中，由惡性腫瘤細(xì)胞異常分泌或脫落，或由機(jī)體因腫瘤反應(yīng)而產(chǎn)生的可進(jìn)入血液或體液中與腫瘤發(fā)生和增殖密切相關(guān)的物質(zhì)稱(chēng)為腫瘤標(biāo)志物(Tumor marker，TM)，粗分為癌胚抗原類(lèi)、酶類(lèi)、激素類(lèi)、糖蛋白類(lèi)、癌基因類(lèi)和細(xì)胞表面腫瘤抗原類(lèi)等六大類(lèi)。對(duì)于這類(lèi)物質(zhì)的動(dòng)態(tài)監(jiān)視及測(cè)定，可為腫瘤的輔助診斷、鑒別診斷、療效觀察、病情監(jiān)測(cè)以及預(yù)后的評(píng)價(jià)提供可靠的依據(jù)。目前臨床血清腫瘤標(biāo)志物的免疫檢測(cè)方法主要有放射免疫法、標(biāo)記抗體的免疫發(fā)射法、酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光免疫法、免疫熒光法、時(shí)間分辨熒光免疫法等，雖然這些方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但仍無(wú)法避免放射污染、耗時(shí)、無(wú)法在社區(qū)醫(yī)院普及等缺點(diǎn)。生物傳感器由識(shí)別元件和信號(hào)轉(zhuǎn)換器組成，識(shí)別元件以適當(dāng)?shù)姆绞焦潭ㄔ谵D(zhuǎn)換器的表面，當(dāng)待測(cè)分子與識(shí)別元件結(jié)合時(shí)，產(chǎn)生一個(gè)物理或化學(xué)信號(hào)，轉(zhuǎn)換器將此信號(hào)轉(zhuǎn)換成一個(gè)可定量的輸出信號(hào)通過(guò)監(jiān)測(cè)輸出信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)分子的實(shí)時(shí)測(cè)定。構(gòu)成生物傳感器的生物分子有酶、抗體、微生物、組織甚至完整的器官；轉(zhuǎn)換器有電極、場(chǎng)效應(yīng)晶體管、光纖、熱敏電阻和壓電晶體等。生物傳感器由于其高靈敏度和特異性，受到廣泛關(guān)注。免疫傳感器是耦聯(lián)含有抗原/抗體分子的生物敏感膜與信號(hào)轉(zhuǎn)換器的一種新型生物傳感器，具有高靈敏度、高特異性、使用簡(jiǎn)便、適于在社區(qū)醫(yī)院普及的優(yōu)點(diǎn)，成為腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的有效方法。 但生物分子固有的缺陷，即對(duì)使用環(huán)境要求較高，難以長(zhǎng)期保存等，使生物傳感器在實(shí)際應(yīng)用中遇到很多不易克服的障礙。同時(shí)，生物分子來(lái)源于生物活體，由于制備和純化繁瑣、昂貴，因此，識(shí)別元件難以得到也是限制生物傳感器發(fā)展的一個(gè)重要因素。獲得廉價(jià)、穩(wěn)定的識(shí)別元件，是生物傳感器進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵之一。通過(guò)對(duì)抗原抗體、酶和底物反應(yīng)原理的研究和理解，科學(xué)家大膽提出了通過(guò)化學(xué)反應(yīng)合成模擬抗體的設(shè)想，開(kāi)創(chuàng)了一項(xiàng)嶄新的技術(shù)——分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technique,MIT) fflil MIT(molecularly imprinted polymers, MIPs)被稱(chēng)為“塑料抗體”，科學(xué)家因此實(shí)現(xiàn)了不依賴(lài)生物活體獲得“抗體”的宿愿，MPs與生物識(shí)別元件(如酶、抗體、核酸等)相比具有很多優(yōu)點(diǎn)①M(fèi)IP的穩(wěn)定性好，能反復(fù)使用50次以上；在室溫干燥環(huán)境中可保存數(shù)年，水中保存4周以上不會(huì)影響其性質(zhì)； 用酸性、堿性、金屬離子和其它多種溶液處理時(shí)不會(huì)降低其識(shí)別特性；能耐受一定的機(jī)械強(qiáng)度、高溫及高壓；②MIP具有很高的選擇性，對(duì)印記分子而言是“量身定做”的，而且理論上任何一個(gè)分子均可制備相應(yīng)的MIP ；③生物識(shí)別元件來(lái)自于生物源，在生產(chǎn)過(guò)程中往往要使用動(dòng)物，而分子印記技術(shù)完全是化學(xué)合成過(guò)程；④生物分子識(shí)別系統(tǒng)不易建立批量生產(chǎn)工藝，所以?xún)r(jià)格昂貴，而MIP費(fèi)用低，對(duì)于某些小分子化合物如藥物來(lái)說(shuō)，制備其MIP相當(dāng)簡(jiǎn)單和省時(shí)，容易建立大規(guī)模生產(chǎn)。以此“塑料抗體”取代生物分子作為識(shí)別元件研制分子印跡仿生傳感器(MPs生物傳感器)的工作在20世紀(jì)90年代后逐漸成為傳感器領(lǐng)域的研究執(zhí)占。MIPs的制備包括3個(gè)步驟(1)通過(guò)共價(jià)鍵或/和非共價(jià)鍵使模板或印跡分子(即待測(cè)分子)與功能單體形成官能團(tuán)和空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的復(fù)合物，所用的功能單體須帶有能與印跡分子發(fā)生作用的功能基。常用的功能單體有丙烯酸、甲基丙烯酸、三氟甲基丙烯酸及苯乙烯等；( 加入交聯(lián)劑，在印跡分子-功能單體復(fù)合物周?chē)a(chǎn)生聚合反應(yīng)，將官能團(tuán)和空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的形式固定在聚合物中。常用的交聯(lián)劑有雙甲基丙烯酸乙二醇酯、季戊四醇三丙烯酸酯及三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯等；(3)從聚合物中除去模板，形成能特異識(shí)別、 結(jié)合模板的空穴，這個(gè)聚合物即MIPs。MII^在與其合成時(shí)相似的溶液中與待測(cè)分子相遇，通過(guò)官能團(tuán)和空間形狀的配合，選擇性重新結(jié)合待測(cè)分子。MPs所具有的優(yōu)勢(shì)使其作為識(shí)別元件，特別適合于傳感器技術(shù)。電化學(xué)免疫傳感器將電化學(xué)分析技術(shù)和免疫技術(shù)相結(jié)合，是目前研究最多的較為成熟的一類(lèi)免疫傳感器，廣泛應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。然而，用MPs這種“人工抗體”來(lái)代替天然抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)精確檢測(cè)在很多小分子(維生素，氨基酸，醛類(lèi)，輔酶，留醇類(lèi)，藥物嗎啡等)的檢測(cè)中獲得成功，但是對(duì)蛋白質(zhì)等大分子的分子印跡研究得比較少，至今科學(xué)家研究的MPs所用的底物最大只能達(dá)到多肽級(jí)別(3kD以下)，未達(dá)到達(dá)到蛋白質(zhì)級(jí)別(20kD以上)。如何將蛋白質(zhì)作為印記分子制備MPs成為實(shí)現(xiàn)MPs-生物傳感器的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服大分子物質(zhì)印跡難的問(wèn)題，提供一種能夠選擇性和特異性識(shí)別肺癌腫瘤標(biāo)志物，可用于肺癌腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的分子印記聚合物。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單的用于檢測(cè)肺癌腫瘤標(biāo)志物的分子印跡聚合物的制備方法。本發(fā)明以競(jìng)爭(zhēng)型電流傳感器為基礎(chǔ)。由于MPs的選擇性主要取決于其官能團(tuán)和空間形狀與底物的配合，有研究表明，對(duì)于生物大分子來(lái)說(shuō)，分子印跡聚合物對(duì)底物的選擇性和親和力不僅是因?yàn)橛≯E聚合物中有可以與底物進(jìn)行專(zhuān)一反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，更為重要的是功能單體在印跡聚合物上形成了高度有序的結(jié)構(gòu)，這種高度有序的結(jié)構(gòu)與離子或(和) 疏水作用力一起對(duì)印跡聚合物的選擇性和親和性起主要作用。所以本發(fā)明將重點(diǎn)放在構(gòu)建具有高度有序結(jié)構(gòu)的MPs上。某些在小分子印跡中影響很大的因素，如溶劑的極性、介電常數(shù)、質(zhì)子化作用及絡(luò)合作用等，在大分子的印跡中，作為其次的影響因素。本發(fā)明選擇肺癌腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原(CEA)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、細(xì)胞角蛋白19片段抗原(CYFRA21-1)為模板，采用擴(kuò)散/分散聚合法，制備得到特異性的腫瘤標(biāo)志物的分子印跡聚合物。根據(jù)大分子作為印跡分子，其MPs作為傳感器識(shí)別元件的特殊性。本發(fā)明一種用于檢測(cè)肺癌腫瘤標(biāo)志物的分子印跡聚合物的制備方法，具體方案包括如下步驟(1)模板分子的電化學(xué)修飾；選電活性物質(zhì)甲酸二茂鐵3-5mg，縮寫(xiě)為FER，溶解于500-1000 μ L，0. 15M，pH為 7. 3的羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液，縮寫(xiě)為Na-HEPES，溶液經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾，加入8-15mg 1-乙基-3-[3-二甲胺基丙胺]碳化二亞胺-鹽酸縮寫(xiě)為EDC和80-120 μ L，500μ g/mL的腫瘤標(biāo)志物，并于室溫下孵育3-5小時(shí)，超濾除去未結(jié)合的甲酸二茂鐵，直到濾出液中不再含有甲酸二茂鐵為止。制得模板復(fù)合物于4°C保存；所述腫瘤標(biāo)志物為癌胚抗原縮寫(xiě)為CEA、神經(jīng)原特異性烯醇化酶縮寫(xiě)為NSE或細(xì)胞角蛋白19片段抗原縮寫(xiě)為 CYFRA21-1 ；(2)分子印跡聚合物的制備；將模板分子即甲酸二茂鐵-腫瘤標(biāo)志物，功能單體，交聯(lián)劑溶于致孔劑， 將溶液移入水中，攪拌，乳化；然后加入引發(fā)劑交聯(lián)，紫外光聚合，得粒徑較均一的球形分子印跡物質(zhì)，其中模板、功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑、引發(fā)劑的用量比可選擇 mmol mmol mmol mL mg = 1 (8-10) (40-50) (90-100) (3-40)；通過(guò)乙醇洗滌離心除去模板分子；所述模板為FER-CEA或FER-NSE或FER-CYFRA21-1 ；所述功能單體為二羥甲基丙烯酸乙酯縮寫(xiě)為EGDMA、甲基丙烯酸甲酯、亞甲基丁二酸、對(duì)乙烯苯甲酸或二丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸縮寫(xiě)為AMPSA ；所述交聯(lián)劑為N，N- 二丙烯酰哌嗪、N， N'-亞甲基二丙烯酰胺、3，5_二苯甲酸、3，5_二丙烯酰胺苯甲酸或N，0-二丙烯酰-L-苯丙氨酸；所述致孔劑為四氫呋喃、甲醇、乙醇或丙醇；所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈縮寫(xiě)為AIBN 或偶氮二異庚腈縮寫(xiě)為AIHN。分子印跡聚合物的制備簡(jiǎn)要過(guò)程如圖1。其中在模板分子的電化學(xué)修飾部分生物大分子本身是沒(méi)有電活性的，不能傳導(dǎo)電流，因此，在制備MPs之前，本發(fā)明利用電活性物質(zhì)對(duì)模板分子進(jìn)行修飾，已有的生物分子的電化學(xué)修飾多采用二茂鐵，硫堇， 殼聚糖等作為電活性物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)中采用甲酸二茂鐵作為電活性物質(zhì)，其同時(shí)具備電活性和適用于本實(shí)驗(yàn)環(huán)境的親水性。修飾后的電活性物質(zhì)-模板分子復(fù)合物再作為模板分子制備其Mffs。其中在分子印跡聚合物的制備部分由于模板分子為生物大分子，采用擴(kuò)散/分散聚合法，在常溫下利用紫外光照射聚合。該方法一般用于熱不穩(wěn)定性小分子的MPs的制備，在小分子的MPs的制備中技術(shù)比較成熟，基本過(guò)程是將模板分子(甲酸二茂鐵-腫瘤標(biāo)志物)，功能單體，交聯(lián)劑溶于有機(jī)溶劑(致孔劑)，然后將溶液移入水中，攪拌，乳化。然后加入引發(fā)劑交聯(lián)，紫外光聚合， 得粒徑較均一的球形分子印跡物質(zhì)。然后通過(guò)乙醇洗滌離心除去模板分子，簡(jiǎn)要過(guò)程如圖 1所示。提高擴(kuò)散速度，縮短響應(yīng)時(shí)間，主要是通過(guò)減少交聯(lián)劑用量、增加致孔劑用量以增大聚合物鏈間的空隙。蛋白質(zhì)為具有一定形狀的模板分子，故交聯(lián)劑的用量要適量低一點(diǎn)。 模板分子的用量不能超過(guò)5%。在該方法中，關(guān)鍵因素為模版分子、功能單體的比例，交聯(lián)劑、致孔劑的比例，紫外光照時(shí)間三個(gè)因素，其他溶劑的量為相對(duì)次要因素，引發(fā)劑的量可根據(jù)制備的容器的大小來(lái)選擇量的多少，其主要影響反應(yīng)時(shí)間，對(duì)制備效果影響不大。去除印跡聚合物中的模板分子，需加入與水相混溶的有機(jī)溶劑可使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚，使與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物釋放出來(lái)。常用的水溶性有機(jī)溶劑有乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氫呋喃等。血清與水溶性有機(jī)溶劑的體積比為1 (1 3)時(shí)，就可以將90%以上的蛋白質(zhì)除去，洗掉蛋白質(zhì)沉淀和甲酸二茂鐵。將本發(fā)明中的分子印跡聚合物制作為電流傳感器以備應(yīng)用，具體操作采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)。本發(fā)明的分子印跡聚合物，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，將該分子印跡聚合物制備的生物傳感器用于腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，對(duì)CEA的檢測(cè)限為0. 22ng/mL，線性范圍為0. 50-25ng/mL，相關(guān)系數(shù)為0. 9981，響應(yīng)時(shí)間為35min，在112ng/mL以下與其他蛋白質(zhì)物質(zhì)無(wú)交叉反應(yīng)，CEA濃度-電流曲線如圖2所示；對(duì)NSE的檢測(cè)限為0. 29ng/mL，線性范圍為0. 53j9ng/mL，相關(guān)系數(shù)為0. 9990，響應(yīng)時(shí)間為^min，在231ng/mL以下與其他蛋白質(zhì)物質(zhì)無(wú)交叉反應(yīng)，NSE濃度-電流曲線如圖3所示；對(duì)CYFRA21-1的檢測(cè)限為0. 41ng/mL，線性范圍0. 63-27ng/mL, 相關(guān)系數(shù)為0. 9986，響應(yīng)時(shí)間為32min，在89ng/mL以下與其他蛋白質(zhì)物質(zhì)無(wú)明顯交叉反應(yīng)，CYFRA21-1濃度-電流曲線如圖4所示，。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下效果(1)本發(fā)明制備的是生物大分子蛋白質(zhì)的分子印跡聚合物，并且對(duì)相應(yīng)的底物分子具有較高的特異性，同時(shí)預(yù)留了電活性物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)。(2)本發(fā)明采用水溶性的二丙烯酰哌嗪(diacrylylpiperazine)作為交聯(lián)劑，在水中合成了并可在親水環(huán)境(10% 100%水)中使用的MIPS。(3)本發(fā)明的檢測(cè)采用競(jìng)爭(zhēng)性電流檢測(cè)法，應(yīng)用電活性物質(zhì)二茂鐵做探針來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)免疫傳感器中的標(biāo)記底物。(4)本發(fā)明所采用的懸浮/分散聚合法，及紫外光引發(fā)聚合，均為較常用，操作簡(jiǎn)單，并且與絲網(wǎng)印刷技術(shù)和流動(dòng)注射技術(shù)相結(jié)合，既實(shí)現(xiàn)了芯片一次性實(shí)用的特點(diǎn)，又使得檢測(cè)方便快速有效。


圖1是分子印跡聚合物的制備簡(jiǎn)要過(guò)程。圖2是CEA濃度-電流曲線圖。圖3是NSE濃度-電流曲線圖。圖4是CYFRA21-1濃度-電流曲線圖。圖5是改變交聯(lián)劑，致孔劑，引發(fā)劑比例后CEA濃度-電流曲線圖。圖6是改變紫外聚合時(shí)間后CEA濃度-電流曲線圖
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何限定。實(shí)施例1用于檢測(cè)CEA的分子印跡聚合物(1) CEA的電化學(xué)修飾取甲酸二茂鐵(FER)4mg,溶解于 800 μ L Na-HEPES 緩沖液(0. 15Μ，ρΗ7· 3)，溶液經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾，加入10mg(l-乙基_3_[3- 二甲胺基丙胺]碳化二亞胺-鹽酸) (EDC)和90 μ L的500 μ g/mL的模板分子CEA并于室溫下孵育4小時(shí)，超濾除去未結(jié)合的甲酸二茂鐵，直到濾出液中不再含有甲酸二茂鐵為止。制得模板復(fù)合物于4°C保存。(2)分子印跡聚合物的合成所述的分子印跡聚合物采用由紫外光引發(fā)的自由基聚合方法制備而成。模板分子為(1)中所得到的模板分子，功能單體為二羥甲基丙烯酸乙酯(EGDMA)，交聯(lián)劑為二丙烯酰哌嗪，致孔劑為甲醇，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈(AIBN)。其過(guò)程為取(1)中所制得的模板復(fù)合物溶液0. Immol與3mg的引發(fā)劑AIBN溶于8mL致孔劑甲醇中，加入3mL交聯(lián)劑二丙烯酰哌嗪4. 5mmol和400 μ L的單體EGDMAlmmol，震蕩混勻10-30分鐘，形成均勻溶液，噴點(diǎn)于絲網(wǎng)印刷電極的工作電極上，通2分鐘氮?dú)馀懦鯕?，于紫外燈下照?小時(shí)，90%-95%乙醇洗滌2-6次。干燥所得聚合物，4°C冰箱保存。(3)分子印跡聚合物性能測(cè)定將所制得的MIPs-傳感器芯片與電流傳感器的信號(hào)收集系統(tǒng)相連接，注入不同濃度的 CEA (0. Ing/mL, Ing/mL, 5ng/mL, 8ng/mL, 12ng/mL, 18ng/mL，25ng/mL)，然后再分別注入等量的甲酸二茂鐵溶液，記錄電流脈沖信號(hào)。做出CEA濃度-電流信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2 所示，做為檢測(cè)樣品時(shí)讀取數(shù)據(jù)依據(jù)。實(shí)施例2用于檢測(cè)NSE的分子印跡聚合物(I)NSE的電化學(xué)修飾取甲酸二茂鐵(FER)4mg,溶解于 800 μ L Na-HEPES 緩沖液(0. 15Μ，ρΗ7· 3)，溶液經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾，加入10mg(l-乙基_3_[3- 二甲胺基丙胺]碳化二亞胺-鹽酸) (EDC)和90 μ L的500 μ 1 g/mL的模板分子NSE并于室溫下孵育4小時(shí)，超濾除去未結(jié)合
的甲酸二茂鐵，直到濾出液中不再含有甲酸二茂鐵為止。制得模板復(fù)合物于4°C保存。(2)分子印跡聚合物的合成所述的分子印跡聚合物采用由紫外光引發(fā)的自由基聚合方法制備而成。模板分子為(1)中所得到的模板分子，功能單體為二羥甲基丙烯酸乙酯(EGDMA)，交聯(lián)劑為二丙烯酰哌嗪，致孔劑為甲醇，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈(AIBN)。其過(guò)程為取(1)中所制得的模板復(fù)合物溶液(0. Immol)與3mg的引發(fā)劑AIBN溶于8mL致孔劑甲醇中，加入3mL交聯(lián)劑二丙烯酰哌嗪(4. 5mmol)和400 μ L的單體EGDMA(Immol)，震蕩混勻10-30分鐘，形成均勻溶液，噴點(diǎn)于絲網(wǎng)印刷電極的工作電極上，通2分鐘氮?dú)馀懦鯕猓谧贤鉄粝抡丈?小時(shí)， 90% -95%乙醇洗滌2-6次。干燥所得聚合物，4°C冰箱保存。(3)分子印跡聚合物性能測(cè)定將所制得的MIPs-傳感器芯片與電流傳感器的信號(hào)收集系統(tǒng)相連接，注入不同濃度的 NSE (0. Ing/mL, Ing/mL, 5ng/mL, 8ng/mL, 12ng/mL, 18ng/mL, 25ng/mL)，然后再分別注入等量的甲酸二茂鐵溶液，記錄電流脈沖信號(hào)。做出NSE濃度-電流信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3 所示，做為檢測(cè)樣品時(shí)讀取數(shù)據(jù)依據(jù)。實(shí)施例3用于檢測(cè)CYFRA21-1的分子印跡聚合物(1)CYFRA21-1的電化學(xué)修飾取甲酸二茂鐵(FER)4mg,溶解于 800 μ L Na-HEPES 緩沖液(0. 15Μ，ρΗ7· 3)，溶液經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾，加入10mg(l-乙基_3_[3- 二甲胺基丙胺]碳化二亞胺-鹽酸) (EDC)和90 μ L的500 μ g/mL的模板分子CYFRA21-1并于室溫下孵育4小時(shí)，超濾除去未結(jié)合的甲酸二茂鐵，直到濾出液中不再含有甲酸二茂鐵為止。制得模板復(fù)合物于4°C保存。(2)分子印跡聚合物的合成所述的分子印跡聚合物采用由紫外光引發(fā)的自由基聚合方法制備而成。模板分
7子為(1)中所得到的模板分子，功能單體為二羥甲基丙烯酸乙酯(EGDMA)，交聯(lián)劑為二丙烯酰哌嗪，致孔劑為甲醇，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈(AIBN)。其過(guò)程為取(1)中所制得的模板復(fù)合物溶液(0. Immol)與3mg的引發(fā)劑AIBN溶于8mL致孔劑甲醇中，加入3mL交聯(lián)劑二丙烯酰哌嗪(4. 5mmol)和400 μ L的單體EGDMA(Immol)，震蕩混勻10-30分鐘，形成均勻溶液，噴點(diǎn)于絲網(wǎng)印刷電極的工作電極上，通2分鐘氮?dú)馀懦鯕?，于紫外燈下照?小時(shí)， 90% -95%乙醇洗滌2-6次。干燥所得聚合物，4°C冰箱保存。(3)分子印跡聚合物性能測(cè)定將所制得的MIPs-傳感器芯片與電流傳感器的信號(hào)收集系統(tǒng)相連接，注入不同濃度的 CYFRA21-1 (0. Ing/mL, Ing/mL, 5ng/mL, 8ng/mL, 12ng/mL, 18ng/mL, 25ng/mL)，然后再分別注入等量的甲酸二茂鐵溶液，記錄電流脈沖信號(hào)。做出CYFRA21-1濃度-電流信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示，做為檢測(cè)樣品時(shí)讀取數(shù)據(jù)依據(jù)。實(shí)施例4用于檢測(cè)CEA的分子印跡聚合物(1) CEA的電化學(xué)修飾取甲酸二茂鐵(FER)4mg,溶解于 800 μ L Na-HEPES 緩沖液(0. 15Μ，ρΗ7· 3)，溶液經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾，加入10mg(l-乙基_3_[3- 二甲胺基丙胺]碳化二亞胺-鹽酸) (EDC)和90 μ L的500 μ 1 g/mL的模板分子CEA并于室溫下孵育4小時(shí)，超濾除去未結(jié)合的甲酸二茂鐵，直到濾出液中不再含有甲酸二茂鐵為止。制得模板復(fù)合物于4°C保存。(2)分子印跡聚合物的合成所述的分子印跡聚合物采用由紫外光引發(fā)的自由基聚合方法制備而成。模板分子為(1)中所得到的模板分子，功能單體為二羥甲基丙烯酸乙酯(EGDMA)，交聯(lián)劑為二丙烯酰哌嗪，致孔劑為甲醇，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈(AIBN)。其過(guò)程為取(1)中所制得的模板復(fù)合物溶液(0. Immol)與aiig的引發(fā)劑AIBN溶于IOmL致孔劑甲醇中，加入2mL交聯(lián)劑二丙烯酰哌嗪(3mmol)和400 μ L的單體EGDMA (Immol)，震蕩混勻10-30分鐘，形成均勻溶液，噴點(diǎn)于絲網(wǎng)印刷電極的工作電極上，通2分鐘氮?dú)馀懦鯕?，于紫外燈下照?小時(shí)，90%-95% 乙醇洗滌2-6次。干燥所得聚合物，4°C冰箱保存。(3)分子印跡聚合物性能測(cè)定將所制得的MIPs-傳感器芯片與電流傳感器的信號(hào)收集系統(tǒng)相連接，注入不同濃度的 CEA (0. Ing/mL, Ing/mL, 5ng/mL, 8ng/mL, 12ng/mL, 18ng/mL，25ng/mL)，然后再分別注入等量的甲酸二茂鐵溶液，記錄電流脈沖信號(hào)。做出CEA濃度-電流信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5 所示。實(shí)施例5用于檢測(cè)CEA的分子印跡聚合物(1) CEA的電化學(xué)修飾取甲酸二茂鐵(FER)4mg,溶解于 800 μ L Na-HEPES 緩沖液(0. 15Μ，ρΗ 7. 3)，溶液經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾，加入10mg(l-乙基_3_[3- 二甲胺基丙胺]碳化二亞胺-鹽酸) (EDC)和90 μ L的500 μ g/mL的模板分子CEA并于室溫下孵育4小時(shí)，超濾除去未結(jié)合的甲酸二茂鐵，直到濾出液中不再含有甲酸二茂鐵為止。制得模板復(fù)合物于4°C保存。(2)分子印跡聚合物的合成所述的分子印跡聚合物采用由紫外光引發(fā)的自由基聚合方法制備而成。模板分子為(1)中所得到的模板分子，功能單體為二羥甲基丙烯酸乙酯(EGDMA)，交聯(lián)劑為二丙烯酰哌嗪，致孔劑為甲醇，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈(AIBN)。其過(guò)程為取(1)中所制得的模板復(fù)合物溶液(0. Immol)與3mg的引發(fā)劑AIBN溶于8mL致孔劑甲醇中，加入3mL交聯(lián)劑二丙烯酰哌嗪(4. 5mmol)和400 μ L的單體EGDMA(Immol)，震蕩混勻10-30分鐘，形成均勻溶液，噴點(diǎn)于絲網(wǎng)印刷電極的工作電極上，通2分鐘氮?dú)馀懦鯕?，于紫外燈下照?小時(shí)， 90% -95%乙醇洗滌2-6次。干燥所得聚合物，4°C冰箱保存。(3)分子印跡聚合物性能測(cè)定將所制得的MIPs-傳感器芯片與電流傳感器的信號(hào)收集系統(tǒng)相連接，注入不同濃度的 CEA (0. Ing/mL, Ing/mL, 5ng/mL, 8ng/mL, 12ng/mL, 18ng/mL，25ng/mL)，然后再分別注入等量的甲酸二茂鐵溶液，記錄電流脈沖信號(hào)。做出CEA濃度-電流信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6 所示。參考文獻(xiàn)[l]Kriz D,Mosbach K. Competitive amperometric morphine sensorbased on an agarose immobilised molecularIyimprinted polymer[J]. Ahal Chim Acta,1995,300 71-75.[2]Kobayasni T, Wang H U, Fuj N. Molecular imprint membranes of poly2 acrylonitriIe copolymer with differentacrylic acid segments[J]. Anal Chim Ac-ta,1998,365 :81.[3]Surugiu I,Ye L,Yilmaz E,et al. An enzyme-linked molecularly imprinted sorbent assay[J]. Analyst,2000,125 (1) :13-16.[4]Kempe M, Glad M, Mosbach K. An approach towards surface imprinting using the enzyme ribonuclease A[J]. J Mol Recognit，1995，8(1/2) :35-39.[5]Z. Yang et al. A chemiluminescent immunosensor based on antibody immobilized carboxylic resin beads coupled with micro-bubble accelerated immunoreaction for fast flow-injection immunoassay [J]. Biosensors and Bioelectronics,2008,24 :35-40.[6]J. Wu et al. A disposable electrochemical immunosensor for flow injection immunoassay of carcinoembryonic antigen[J]. Biosensors and Bioelectronics,2006,22 :102-108.[7]G.P. Gonzalez et alA ΜΙΡ-based flow-through fluoroimmunosensor as an alternative to immunosensors for the determination of digoxin in serum samples[J], Anal Bioanal Chem，2009，394 :963-970.[8]Jie Wu et al.Disposable Reagentless Electrochemical Immunosensor Array Based on a Biopolymer/SoI-Gel Membrane for Simultaneous Measurement of Several Tumor Markers[J]. Clinical Chemistry,2008,54(9) :1481-1488.[9]P. S. Sharma et al. Highly Sensitiye and Selective Detection of Creatinine by Combined Use of MISPE and a Complementary MIP-Sensor [J]. Chromatographia,2007，65 :419-427.[10]Lei Ye · Karsten Haupt. Molecularly imprinted polymers as antibody and receptor mimics for assays,sensors and drug discovery[J]. Anal Bioanal Chem,2004，378 :1887-1897.[ll]01ivier Y. F. et al. Optical interrogation of molecularly imprinted polymers and development of MIP sensors -.a review [J]. Anal Bioanal Chem, 2005, 382 :947-956.[12]Shradha Prabhulkar et al. Amperometric micro-immunosensor for the detection of tumor biomarker[J]. Biosensors and Bioelectronics,2009,24 3524-3530.
權(quán)利要求
1. 一種用于檢測(cè)肺癌腫瘤標(biāo)志物的分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于，包括步驟(1)模板分子的電化學(xué)修飾；選電活性物質(zhì)甲酸二茂鐵3-5mg，縮寫(xiě)為FER，溶解于500-1000 μ L，0. 15Μ，ρΗ為7. 3的羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液，縮寫(xiě)為Na-HEPES，溶液經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾，加入8_15mg 1-乙基-3- [3-二甲胺基丙胺]碳化二亞胺-鹽酸縮寫(xiě)為EDC和80-120 μ L，500 μ g/mL的腫瘤標(biāo)志物，并于室溫下孵育3-5小時(shí)，超濾除去未結(jié)合的甲酸二茂鐵，直到濾出液中不再含有甲酸二茂鐵為止。制得模板復(fù)合物于4°C保存；所述腫瘤標(biāo)志物為癌胚抗原縮寫(xiě)為CEA、 神經(jīng)原特異性烯醇化酶縮寫(xiě)為NSE或細(xì)胞角蛋白19片段抗原縮寫(xiě)為CYFRA21-1 ；(2)分子印跡聚合物的制備；將模板分子即甲酸二茂鐵-腫瘤標(biāo)志物，功能單體，交聯(lián)劑溶于致孔劑，將溶液移入水中，攪拌，乳化；然后加入引發(fā)劑交聯(lián)，紫外光聚合，得粒徑較均一的球形分子印跡物質(zhì)，其中模板、功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑、引發(fā)劑的用量比可選擇mmol mmol mmol mL mg =1 (8-10) (40-50) (90-100) (3-40)；通過(guò)乙醇洗滌離心除去模板分子；所述模板為FER-CEA或FER-NSE或FER-CYFRA21-1 ；所述功能單體為二羥甲基丙烯酸乙酯縮寫(xiě)為EGDMA、甲基丙烯酸甲酯、亞甲基丁二酸、對(duì)乙烯苯甲酸或二丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸縮寫(xiě)為AMPSA ；所述交聯(lián)劑為N，N- 二丙烯酰哌嗪、N，N'-亞甲基二丙烯酰胺、3，5- 二苯甲酸、3，5- 二丙烯酰胺苯甲酸或N，0- 二丙烯酰-L-苯丙氨酸；所述致孔劑為四氫呋喃、甲醇、 乙醇或丙醇；所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈縮寫(xiě)為AIBN或偶氮二異庚腈縮寫(xiě)為AIHN。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種用于檢測(cè)肺癌腫瘤標(biāo)志物的分子印跡聚合物的制備方法。該方法基本過(guò)程為將模板分子(甲酸二茂鐵-腫瘤標(biāo)志物)，功能單體，交聯(lián)劑溶于有機(jī)溶劑(致孔劑)，然后將溶液移入水中，攪拌，乳化。然后加入引發(fā)劑交聯(lián)，紫外光聚合，得粒徑較均一的球形分子印跡物質(zhì)。然后通過(guò)乙醇洗滌離心除去模板分子得到對(duì)肺癌腫瘤標(biāo)志物具有特異性的分子印跡聚合物，并用于生物傳感器的識(shí)別元件，提出了一種新的腫瘤診斷的方法。
文檔編號(hào)G01N27/26GK102268119SQ20101052803
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2010年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月1日
發(fā)明者劉殿奎, 張陽(yáng)德, 李異凡, 李輝瑩, 陳福韜 申請(qǐng)人:中南大學(xué), 中南大學(xué)肝膽腸外科研究中心