專利名稱：一種以sox2蛋白表達(dá)水平作為前列腺癌惡性程度判斷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種醫(yī)學(xué)診斷用的方法，具體的說是一種通過檢測前列腺癌組織中 S0X2蛋白的表達(dá)情況來判斷前列腺癌惡性程度的方法，該方法是通過免疫檢測技術(shù)實(shí)現(xiàn) 的，屬于臨床免疫診斷方法，特別是運(yùn)用免疫組化方法檢測S0X2蛋白從而判斷前列腺癌惡 性程度的方法。
背景技術(shù)：
前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤之一，位于歐美國家男性腫瘤致死率第二位，僅 次于肺癌。近幾年，在我國的發(fā)病率呈上升趨勢。前列腺癌的預(yù)后與發(fā)現(xiàn)早晚、病理類型、 患者年齡，及相應(yīng)的治療措施是否得當(dāng)密切相關(guān)。癌細(xì)胞的分化程度與腫瘤的惡性程度和 病人的預(yù)后密切相關(guān)。病理報告上常用Gleason評分來評價前列腺癌細(xì)胞的分化程度。因 此，對前列腺癌的惡性程度的早期快速診斷可以對治療及預(yù)后判斷產(chǎn)生積極的作用。S0X2 (SRY-Related HMG-Box Gene 2)是SOX家族的一個成員，是干細(xì)胞的標(biāo)志性 基因之一，存在干細(xì)胞的核中，是一種維持干細(xì)胞特性的重要的轉(zhuǎn)錄因子，在維持胚胎干細(xì) 胞及癌癥干細(xì)胞的多能性及自我更新能力方面起到至關(guān)重要的作用。S0X2與癌癥干細(xì)胞的 致癌能力密切相關(guān)。因此癌細(xì)胞中的S0X2極有可能對癌癥的分化程度進(jìn)行密切的調(diào)節(jié)，并 有可能成為腫瘤分化程度判斷的標(biāo)志蛋白。我們通過對127例前列腺癌組織芯片(包括病 理分級1-3級，Gleason評分2_10分)的免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn)S0X2的表達(dá)水平隨著病 理分級的增高以及Gleason評分的增高而表達(dá)水平顯著增高，這表明S0X2可以成為前列腺 癌分化程度的標(biāo)志蛋白，進(jìn)而為前列癌的預(yù)后判斷提供參考。即在前列腺癌組織中S0X2蛋 白表達(dá)程度越高，其分化程度越低，惡性程度越高。(見表1)表1. S0X2表達(dá)水平與前列腺癌病理分級的關(guān)系
組別
總例數(shù)
例數(shù)
P
病理分級 !級 2級
3級
Gleason 評分 2-4 5-6 7-10
24 45 58
25 36 65
7 3
7 3 0
11 20 13
12 17 14
6
15
20
5 12 25
O 7
24
4 26 本實(shí)驗(yàn)以S0X2陽性細(xì)胞數(shù)占組織細(xì)胞的百分比作為陰性及陽性結(jié)果的判斷，即 < 10%為陰性(-)，而彡10%并< 30%為弱陽性(+)，彡30%并< 50%為中陽性(++)， 彡50%為強(qiáng)陽性(+++)。結(jié)果表明S0X2的表達(dá)水平隨著病理分級的增高以及Gleason評分的增高而表達(dá)水平增高，X 2檢驗(yàn)分析顯示兩者之間均存在顯著相關(guān)性。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，本發(fā)明通過免疫組化的方法檢測病理組織中的S0X2蛋白，以此判 斷前列腺癌的分化程度。具體的講就是，通過對病理組織的免疫組化反應(yīng)，檢測該組織中 S0X2分子的表達(dá)數(shù)量，根據(jù)免疫組化反應(yīng)的結(jié)果來判斷前列腺癌的分化程度。其技術(shù)內(nèi)容包括免疫組化反應(yīng)和顯微鏡觀察等步驟。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
1.脫蠟和水化
具體步驟如下
①組織切片置于二甲苯I中浸泡10分鐘，
②組織切片置于二甲苯II浸泡10分鐘，
③組織切片置于無水乙醇中I浸泡10分鐘，
④組織切片置于無水乙醇II浸泡10分鐘，
⑤組織切片置于95%乙醇中浸泡10分鐘，
⑥組織切片置于80%乙醇中浸泡10分鐘，
⑦組織切片置于自來水中浸泡1分鐘，
⑧組織切片置于蒸餾水中浸泡5分鐘。
2.抗原修復(fù)，將IOmM的Citrate Buffer (pH 6.0)通過微波爐，加熱10分鐘，放入
組織切片中低火加熱10-15分鐘，在室溫下晾涼。3.用超純水洗處理過的組織切片3次，每次五分鐘。4.將3%雙氧水溶液滴加在載玻片上，室溫靜置10分鐘，甩去多余液體。5.用超純水洗2次，各五分鐘6.滴加封閉液(正常山羊血清，5% BSA溶液)，在室溫下孵育一小時，甩去多余液 體。7.滴加一抗(1 100) 50 μ L，室溫靜置1小時。8. TBST緩沖液洗3次，每次5分鐘。9.滴加二抗(1 100) 50 μ L，室溫靜置0. 5小時。10. TBST緩沖液洗3次，每次5分鐘。11.滴加三抗(1 100) 50 μ L，室溫靜置0.5小時。12. TBST緩沖液洗4次，每次5分鐘。13. DAB顯色，在顯微鏡下掌握染色程度，在達(dá)到滿意效果后放入清水中終止染色， 后用自來水沖洗10分鐘。14.蘇木精復(fù)染20秒，自來水沖洗10分鐘。15.脫水、透明具體步驟如下①組織切片置于80%乙醇中浸泡30秒，②95%乙醇中浸泡3分鐘，③無水乙醇中II浸泡5分鐘，
④無水乙醇I浸泡5分鐘，⑤二甲苯II中浸泡5分鐘，⑥二甲苯I浸泡5分鐘，16.樹脂封片、鏡檢。


圖1在惡性程度較低，分化程度高的前列腺癌細(xì)胞中檢測結(jié)果顯示S0X2低表達(dá)。圖2在惡性程度較高，分化程度低的前列腺癌細(xì)胞中檢測結(jié)果顯示S0X2高表達(dá)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例1樣本某婦女淋巴結(jié)的組織切片。1.脫蠟和水化具體步驟如下①組織切片置于二甲苯I中浸泡10分鐘，②組織切片置于二甲苯II浸泡10分鐘，③組織切片置于無水乙醇中I浸泡10分鐘，④組織切片置于無水乙醇II浸泡10分鐘，⑤組織切片置于95%乙醇中浸泡10分鐘，⑥組織切片置于80%乙醇中浸泡10分鐘，⑦組織切片置于自來水中浸泡1分鐘，⑧組織切片置于蒸餾水中浸泡5分鐘。2.抗原修復(fù)，將IOmM的Citrate Buffer (pH 6. 0)通過微波爐，加熱10分鐘，放入 組織切片中低火加熱10-15分鐘，在室溫下晾涼。3.用超純水洗處理過的組織切片3次，每次五分鐘。4.將3%雙氧水溶液滴加在載玻片上，室溫靜置10分鐘，甩去多余液體。5.用超純水洗2次，各五分鐘6.滴加封閉液(正常山羊血清，5% BSA溶液)，在室溫下孵育一小時，甩去多余液 體。7.滴加一抗(1 100) 50 μ L，室溫靜置1小時。8. TBST緩沖液洗3次，每次5分鐘。9.滴加二抗(1 100) 50 μ L，室溫靜置0. 5小時。10. TBST緩沖液洗3次，每次5分鐘。11.滴加三抗(1 100) 50 μ L，室溫靜置0.5小時。12. TBST緩沖液洗4次，每次5分鐘。13. DAB顯色，在顯微鏡下掌握染色程度，在達(dá)到滿意效果后放入清水中終止染色， 后用自來水沖洗10分鐘。14.蘇木精復(fù)染20秒，自來水沖洗10分鐘。
15脫水、透明具體步驟如下①組織切片置于80%乙醇中浸泡30秒，②95%乙醇中浸泡3分鐘，③無水乙醇中II浸泡5分鐘，④無水乙醇I浸泡5分鐘，⑤二甲苯II中浸泡5分鐘，⑥二甲苯I浸泡5分鐘，16.樹脂封片、鏡檢。鏡檢結(jié)果如圖1所示?？梢娫摻M織切片中S0X2的表達(dá)程度低，有少量棕黃色顆粒，為S0X2檢測弱陽性 ⑴結(jié)果，后經(jīng)病理檢測結(jié)果為低惡性、高分化前列腺癌，Gleason評分4分。實(shí)施例2樣本某婦女前列腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織切片。1.脫蠟和水化具體步驟如下①組織切片置于二甲苯I中浸泡10分鐘，②組織切片置于二甲苯II浸泡10分鐘，③組織切片置于無水乙醇中I浸泡10分鐘，④組織切片置于無水乙醇II浸泡10分鐘，⑤組織切片置于95%乙醇中浸泡10分鐘，⑥組織切片置于80%乙醇中浸泡10分鐘，⑦組織切片置于自來水中浸泡1分鐘，⑧組織切片置于蒸餾水中浸泡5分鐘。2.抗原修復(fù)，將IOmM的Citrate Buffer (pH 6. 0)通過微波爐，加熱10分鐘，放入 組織切片中低火加熱10-15分鐘，在室溫下晾涼。3.用超純水洗處理過的組織切片3次，每次五分鐘。4.將3%雙氧水溶液滴加在載玻片上，室溫靜置10分鐘，甩去多余液體。5.用超純水洗2次，各五分鐘6.滴加封閉液(正常山羊血清，5% BSA溶液)，在室溫下孵育一小時，甩去多余液 體。7.滴加一抗(1 100) 50 μ L，室溫靜置1小時。8. TBST緩沖液洗3次，每次5分鐘。9.滴加二抗(1 100) 50 μ L，室溫靜置0.5小時。10. TBST緩沖液洗3次，每次5分鐘。11.滴加三抗(1 100) 50 μ L，室溫靜置0.5小時。12. TBST緩沖液洗4次，每次5分鐘。13. DAB顯色，在顯微鏡下掌握染色程度，在達(dá)到滿意效果后放入清水中終止染色，后用自來水沖洗10分鐘。14.蘇木精復(fù)染20秒，自來水沖洗10分鐘。15.脫水、透明具體步驟如下①組織切片置于80%乙醇中浸泡30秒，②95%乙醇中浸泡3分鐘，③無水乙醇中II浸泡5分鐘，④無水乙醇I浸泡5分鐘，⑤二甲苯II中浸泡5分鐘，⑥二甲苯I浸泡5分鐘，16.樹脂封片、鏡檢。鏡檢結(jié)果如圖2所示?？梢娫摻M織切片中S0X2的表達(dá)程度高，有明顯棕黃色顆粒，為S0X2檢測強(qiáng)陽性 (+++)結(jié)果，后經(jīng)病理檢測結(jié)果為高惡性、低分化前列腺癌，Gleason評分10分。
權(quán)利要求
一種以SOX2蛋白表達(dá)水平作為前列腺癌惡性程度判斷的方法，其特征在于，處理病病理組織切片，抗原修復(fù)，對病理組織的進(jìn)行免疫組化反應(yīng)，將組織切片脫水、透明化處理，并樹脂封片，鏡檢，由此檢測該組織中SOX2分子的表達(dá)數(shù)量，根據(jù)免疫組化反應(yīng)的結(jié)果來判斷前列腺癌的分化程度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以S0X2蛋白表達(dá)水平作為前列腺癌惡性程度判斷的方 法，其特征在于，免疫組化反應(yīng)所滴加的抗體滴加一抗(1 100) 50 μ L，室溫靜置1小時； 滴加二抗(1 100) 50 μ L，室溫靜置0. 5小時； 滴加三抗(1 100) 50 μ L，室溫靜置0. 5小時；DAB顯色，在顯微鏡下掌握染色程度，在達(dá)到滿意效果后放入清水中終止染色，后用自 來水沖洗10分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以S0X2蛋白表達(dá)水平作為前列腺癌惡性程度判斷的方 法，其特征在于，顯微鏡觀察檢測該組織中S0X2分子的表達(dá)數(shù)量，從而判斷前列腺癌的分化程度。
全文摘要
本發(fā)明屬于一種醫(yī)學(xué)診斷用的方法，具體的說是一種通過檢測前列腺癌組織中SOX2蛋白的表達(dá)情況來判斷前列腺癌惡性程度的方法，該方法是通過免疫檢測技術(shù)實(shí)現(xiàn)的，屬于臨床免疫診斷方法。前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤之一，位于歐美國家男性腫瘤致死率第二位，僅次于肺癌。近幾年，在我國的發(fā)病率呈上升趨勢。通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織中SOX2蛋白表達(dá)程度越高，其分化程度越低，惡性程度越高，由此SOX2可以成為前列腺癌分化程度的標(biāo)志蛋白，進(jìn)而為前列癌的預(yù)后判斷提供參考。本發(fā)明通過對病理組織的免疫組化反應(yīng)，檢測該組織中SOX2分子的表達(dá)數(shù)量，根據(jù)免疫組化反應(yīng)的結(jié)果來判斷前列腺癌的分化程度。
文檔編號G01N1/28GK101995474SQ20101053164
公開日2011年3月30日 申請日期2010年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月4日
發(fā)明者劉寅, 劉艷華, 向榮, 呂丹, 張舒, 李娜, 李雪霏, 牟雯君, 賈現(xiàn)培 申請人:南開大學(xué)