專利名稱：抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體及應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域，尤其涉及一種抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體 及應用。
背景技術(shù)：
ItMMi^IiE (Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) 是目前重要的豬傳染病之一，本病以母豬發(fā)熱、厭食、不孕、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、產(chǎn)弱仔 及仔豬呼吸道癥狀和高死亡率為特征，俗稱“藍耳病”。該病1987年首先在美國爆發(fā)，造成 嚴重經(jīng)濟損失，引起了國際上的廣泛關注。我國于1996由郭寶清等從發(fā)病豬群分離病毒并 確認為豬繁殖與呼吸綜合征(PRRSV)。目前本病毒已造成我國很多省市豬群地方性流行。 2006年，田克恭等確診我國豬群發(fā)生的“豬無名高熱征”主要是由變異的PRRSV感染引起， 并分離出病毒，命名為PRRSV JXA1，該病表現(xiàn)出的特征高熱、高發(fā)病率、高死亡率，和較低 的低治愈率。豬繁殖與呼吸綜合征超強變異株(Nsp21594-1680變異株)NVDC-JXA1，在專利 ZL200710086549. 7 中公開，保藏號為CGMCC No. 1964。PRRSV屬于尼多病毒目，動脈炎病毒科，動脈炎病毒屬，有囊膜的單股正鏈RNA病 毒，直徑50-65nm，基因組全長為約15kb。根據(jù)其病毒基因組和血清型特性，主要分為美洲 型(ATCC VR-2332型)和歐洲型(LV型)，我國流行的主要為美洲型毒株。目前對豬繁殖與呼吸綜合征的檢測技術(shù)包括病毒分離、免疫過氧化物酶單層細 胞試驗(IPMA)、間接免疫熒光(IFA)、RT-PCR等方法，但檢測所需時間長，成本昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體及應用。本發(fā)明提供了一種保藏號為CGMCC No. 4109的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆 抗體雜交瘤細胞株3C3。本發(fā)明還提供了一種抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體，由保藏號為 CGMCCNo. 4109的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株3C3產(chǎn)生。所述的單克隆抗體在檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測病毒抗原中的應用也是 本發(fā)明保護的范圍。所述檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原方法包括間接免疫熒光檢測法、抗原捕獲 酶聯(lián)免疫檢測法、免疫組織化學檢測法或試紙條檢測法。所述試紙條檢測法包括膠體金檢測法或酶標檢測法。所述免疫組織化學檢測法中，酶標抗體為羊抗鼠辣根過氧化物酶，顯色用AEC酶 底物顯色試劑盒，樣本為疑似PRRSV豬病料組織如肺、扁桃體、淋巴結(jié)等。所述的單克隆抗體在檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒中的應用；或所述 的單克隆抗體在制備檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的膠體金快速檢測試紙條中的應用，上 述應用均是本發(fā)明保護的范圍。
含有所述的單克隆抗體的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒也是本發(fā)明保 護的范圍；或含有所述的單克隆抗體的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的膠體金快速檢測試 紙條也是本發(fā)明保護的范圍。經(jīng)篩選得到能穩(wěn)定分泌的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株 3C3，該雜交瘤細胞株3C3的分類命名為抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體雜交瘤細 胞，已于2010年09月01日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱 CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)， 保藏號為 CGMCC No. 4109。本發(fā)明的實驗證明，用純化的PRRSV JXAl株免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤技術(shù)， 篩選出1株能穩(wěn)定分泌抗PRRSV單克隆抗體的雜交瘤細胞，并對其進行生物學特性鑒定，為 進一步建立特異、敏感、快速的PRRSV檢測方法奠定了基礎。


圖1為單抗腹水IPMA陽性照片圖2為單抗腹水IPMA細胞對照照片圖3為3C3單克隆抗體蛋白免疫印跡結(jié)果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、單克隆抗體的制備和生物學特性的測定一、單克隆抗體的制備1、毒種和細胞豬繁殖與呼吸綜合征超強變異株(Nsp21594-1680變異株) NVDC-JXAlCGMCCNo. 1964，以下簡稱 PRRSV JXAl 株。PRRSV JXAl株、Marc-145細胞、SP2/0細胞由中國動物疫病預防控制中心保存。2、病毒增殖和純化PRRSV JXAl株接種已長成單層的Marc_145細胞，37°C吸附lh，加入維持液，待 75%以上細胞出現(xiàn)細胞病變(CPE)時收獲病毒，將收獲的病毒液反復凍融三次，以6000rpm 離心30min，收集上清液，在上清液加入PEG 6000 (終濃度8% ) 4°C過夜攪拌，IOOOOrpm離 心60min。沉淀用1 %原體積的PBS溶解，再經(jīng)不連續(xù)蔗糖密度梯度40000rpm超速離心 3h，收集提純的病毒條帶作為免疫原和ELISA檢測用純化PRRSV JXAl株病毒蛋白，以同方 法處理、純化不接毒正常培養(yǎng)Marc-145細胞作為對照蛋白，紫外分光光度計測其蛋白含 量，-30°C保存?zhèn)溆谩?、BALB/c 小鼠免疫選擇6-8周齡雌性BALB/c小鼠。用純化的PRRSV JXAl株與等體積弗氏完全佐劑 (Sigma公司，目錄號為F5881)乳化均勻后，腹腔及背部皮下多點注射BALB/c小鼠，100 μ g/ 只；首免后第2周和第4周分別用用純化的病毒與等體積弗氏不完全佐劑(Sigma公司，目 錄號為F5506)乳化后進行二免和三免；最后一次免疫2周后采血用間接ELISA測血清抗體效價。待ELISA效價達1 IO5以上時進行細胞融合。融合前3天，尾靜脈或腹腔注射 100 μ g不加佐劑的抗原液進行加強免疫。4.骨髓瘤細胞(SP2/0)的培養(yǎng)融合前36_48h將SP2/0細胞分瓶擴大培養(yǎng)于75cm2細胞瓶內(nèi)。融合當天，選擇形 態(tài)良好、呈對數(shù)生長的SP2/0細胞，將其從瓶壁上輕輕吹下，收集于50mL離心管內(nèi)，IOOOrpm 離心5min，然后用DMEM營養(yǎng)液(GIBC0公司，目錄號為12800-017)重新懸浮，取少量臺盼藍 染色計數(shù)，保證細胞成活率大于90%以上，用于細胞融合。5、免疫脾細胞的制備在加強免疫后第三天取免疫小鼠，摘除眼球放血并分離血清作為抗體檢測時陽性 對照；將頸椎脫臼處死的小鼠置75%酒精中浸泡5min，置超凈工作臺蠟盤內(nèi)；無菌取出小 鼠脾臟，放入盛有IOmL DMEM營養(yǎng)液的平皿中，輕輕漂洗，除去附著的結(jié)締組織與脂肪；用 剪刀剪碎脾臟，置于200目銅網(wǎng)上，用注射器內(nèi)芯研磨脾臟，并用DMEM營養(yǎng)液沖洗使脾細 胞全部通過網(wǎng)孔進入溶液中；將脾細胞溶液轉(zhuǎn)入50mL離心管中，加DMEM營養(yǎng)液至30mL，混 勻，IOOOrpm離心5min，棄上清液；同法離心、洗滌細胞一次，然后將細胞懸于IOmL DMEM營 養(yǎng)液中混勻；取上述細胞混懸液進行臺盼藍染色計數(shù)備用。6、飼養(yǎng)細胞的制備細胞融合的當日或前一日，將未經(jīng)免疫的BALB/c小鼠(8_12周齡)眼球采血，頸 椎脫臼處死，浸泡于75%酒精5min，置超凈工作臺蠟盤內(nèi)，腹部向上固定；將BALB/c小鼠皮 膚用消毒鑷子提起，小心剪開腹部皮膚，分離皮膚與腹膜，充分暴露腹膜；用無菌注射器吸 取適量DMEM營養(yǎng)液注入腹腔，按摩腹部，待腹腔細胞與注入的營養(yǎng)液充分混合后，輕輕吸 回營養(yǎng)液加入無菌離心管內(nèi)，重復沖洗2-3次；所得液體IOOOrpm離心5min，棄上清液。向 沉淀中加入IOmL DMEM營養(yǎng)液，重新吹散細胞，取上述細胞混懸液進行臺盼藍染色計數(shù)；用 含HAT (Sigma公司，目錄號H0262)的培養(yǎng)液懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度為1_2 X IO5個/mL，加 入96孔細胞培養(yǎng)板中(100 μ L/孔)，置于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。7、細胞融合按常規(guī)方法將免疫小鼠的脾細胞與SP2/0細胞按5-10 1比例混合于離心管內(nèi)， IOOOrpm離心8min，棄上清液，輕輕彈擊管底，使沉淀細胞松散均勻成糊狀；用ImL移液管吸 取預熱至37°C的50% PEG(WT 1450Sigma公司，目錄號P5402) (PH8. 0)溶液lmL，沿轉(zhuǎn)動的 管壁緩緩滴入，控制在60s加完，然后將細胞懸液吸入移液管(時間控制在30s左右)，靜 置30s，再將其吹入離心管內(nèi)(時間也控制在30s左右)；在5min內(nèi)向離心管內(nèi)加入25mL DMEM營養(yǎng)液終止融合作用；將融合后的細胞液IOOOrpm離心5min，棄上清液，用37°C水浴 預熱的含HAT培養(yǎng)液重懸；加入有飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板中，100 μ L/孔，置37°C、5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天記錄細胞生長情況，融合后第四天，用HAT選擇培養(yǎng)液半量換液， 約7-10天，改用HT (Sigma公司，目錄號H0137)選擇培養(yǎng)液半量換液繼續(xù)培養(yǎng)。8、陽性雜交瘤細胞的篩選及克隆化每天觀察細胞的生長情況，融合后3-5天，可見有克隆細胞生長，待細胞集落生長 至孔底的1/3-1/2時，對其上清液用間接ELISA和免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)方法進 行檢測，對檢測出特異性抗體陽性孔的細胞，以有限稀釋法克隆三次，使陽性率達100%，注 意及時凍存細胞，然后擴大培養(yǎng)以制備腹水，并將一部分細胞連續(xù)傳代、凍存、復蘇，觀察細胞分泌單克隆抗體的穩(wěn)定性。經(jīng)間接ELISA篩選并用進口 LSI-PRRS商品化抗體檢測試劑盒(法國LSI公司) 和IPMA進行鑒定，3次亞克隆化獲得了 1株穩(wěn)定分泌抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗 體的雜交瘤細胞株，命名為3C3。該細胞株具有雙親代的生物學性質(zhì)，腹腔接種給BALB/c小 鼠后可以形成腫瘤，并穩(wěn)定地產(chǎn)生特異性抗體，經(jīng)穩(wěn)定傳代3個月后凍存于液氮中，3個月、 6個月后復蘇細胞生長良好，抗體分泌水平未見降低。經(jīng)篩選得到能穩(wěn)定分泌抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株 3C3，該雜交瘤細胞株3C3的分類命名為抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體雜交瘤細 胞，已于2010年09月01日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱 CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)， 保藏號為 CGMCC No. 4109。9、單克隆抗體的制備將篩選得到能穩(wěn)定分泌抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株 3C3CGMCC No. 4109采用擴大培養(yǎng)或同系小鼠體內(nèi)誘生腹水法進行單克隆抗體的制備。1)細胞擴大培養(yǎng)法進行單克隆抗體的制備采用生物反應器發(fā)酵培養(yǎng)法進行分泌抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體的 雜交瘤細胞株3C3CGMCC No. 4109的大量培養(yǎng)，當細胞濃度達2 X IO6個細胞/mL以上時，采 用邊自動添加新鮮培養(yǎng)基邊自動收集的方式收集培養(yǎng)的雜交瘤細胞3C3CGMCC No. 4109上 清液，3000rpm離心lOmin，將收集的細胞上清液進行超濾濃縮，得到濃縮的單克隆抗體(細 胞上清液)。上述發(fā)酵培養(yǎng)中的培養(yǎng)基為GIBCO公司DMEM培養(yǎng)基，目錄號為12800-017，培 養(yǎng)時間7天-21天，培養(yǎng)條件溫度37°C，溶氧60% -80%, PH 7.2。2)同系小鼠單克隆抗體腹水的制備選擇20g以上BALB/c小鼠，每只腹腔內(nèi)注射滅菌液體石蠟0. 5mL ； 14d后，小鼠腹 腔接種雜交瘤細胞3C3CGMCC No. 4109 (3-5 X IO5個細胞/只)；植入細胞后第7天起，每天 觀察小鼠腹部，待小鼠腹部明顯膨大，用9#針頭穿刺腹腔，采集腹水，一般可連續(xù)采集3-6 次，將腹水以3000rpm離心lOmin，去除油脂和沉淀，收集上清液，測定抗體效價后，_30°C保 存?zhèn)溆?，得到單克隆抗體(腹水)。10、單克隆抗體的純化將步驟9得到單克隆抗體(腹水)先進行預處理加入鹿角膠(Sigma公司) 和CaCl2除去油脂類雜質(zhì)和部分雜蛋白，12000rpm離心30min，再將上清液用0. 22 μ m微 孔濾膜(MILLIPORE公司)過濾，加入等體積0. OlM PH 7. 4的PBS緩沖液，用ProteinG Sepharose 4B層析柱(Amersham Biosciences公司)分離純化，收集蛋白洗脫峰，以0. OlM PH 7. 4的PBS透析過夜，用截留分子量為30kD的濾膜(MILLIPORE公司超濾濃縮，得到純化 的單克隆抗體(腹水)，紫外分光光度計測其蛋白含量，_30°C保存?zhèn)溆谩⒉襟E9得到的濃縮的單克隆抗體(細胞上清液)按照上述方法直接進行純化， 得到純化的單克隆抗體(細胞上清液)。二、單克隆抗體的生物學特性的測定1、抗體類及亞類的鑒定按照SBA Clonotyping System/AP kit單抗亞型鑒定試劑盒(SouthernBiotechnology Associates, Inc.)說明書對上述步驟一得到的單克隆抗體進行 類及亞類的鑒定。結(jié)果為雜交瘤細胞株3C3CGMCC No. 4109分泌的單克隆抗體的重鏈為IgG2a,輕鏈 為 kappa |j|02、ELISA效價的測定用上述一得到純化的PRRSV JXAl株病毒蛋白和Marc_145細胞對照蛋白(將蛋白 用PH 9. 6的碳酸鹽緩沖液稀釋成2 μ g/mL)包被酶標板100 μ L/孔，4°C過夜。用含3% BSA 的 PBST(0. OlM PH 7. 4 含 0.05% (體積百分比)Tween20 的 PBS) 37°C封閉 2h ；用 PBST 溶 液洗滌3次，分別加入10倍系列稀釋(稀釋液為0. OlM PH 7. 4的PBS)由步驟一得到的單 克隆抗體(細胞上清液)和單克隆抗體(腹水)，100 μ L/孔，37°C孵育Ih ；用PBST溶液洗 滌5次后加入辣根過氧化物酶標記的抗鼠二抗(JacksonlmmunoResearch，Inc. 1 5000稀 釋)100 μ L/孔37°C孵育Ih ；用PBST溶液洗滌5次后加入TMB (四甲基聯(lián)苯胺)和過氧化氫 的混合物(1 1體積比混合)100yL/孔，37°C孵育顯色15min。每孔加入50 μ L 0. 2M的 H2SO4終止反應，輕輕振蕩混勻，用酶標儀測定每孔吸光度值(0D450值)，以實驗組的OD45tlnm/ 對照組的OD45tlnm > 2. 1的孔判為陽性(即Ρ/Ν > 2. 1時的最高稀釋倍數(shù)為效價判定終點)。采用步驟一中的方法制備SP2/0細胞培養(yǎng)上清液和SP2/0細胞腹水，作為陰性對 照。結(jié)果見表1和表2所示，由雜交瘤細胞株3C3CGMCC No. 4109得到的單克隆抗體細 胞上清液和腹水與PRRSV JXAl株病毒蛋白的ELISA抗體滴度在1 IO4和1 107。表1腹水間接ELISA檢測OD值
權(quán)利要求
保藏號為CGMCC No.4109的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株3C3。
2.由保藏號為CGMCCNo. 4109的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體雜交瘤細胞 株3C3產(chǎn)生的單克隆抗體。
3.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒中的應用。
4.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的膠體金快速 檢測試紙條中的應用。
5.含有權(quán)利要求2所述的單克隆抗體的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒。
6.含有權(quán)利要求2所述的單克隆抗體的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的膠體金快速 檢測試紙條。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體及應用。本發(fā)明提供了一種保藏號為CGMCC No.4109的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株3C3。本發(fā)明還提供了一種抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體，由保藏號為CGMCCNo.4109的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株3C3產(chǎn)生。本發(fā)明的實驗證明，用純化的PRRSV JXA1株免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤技術(shù)，篩選出1株能穩(wěn)定分泌抗PRRSV單克隆抗體的雜交瘤細胞，并對其進行生物學特性鑒定，為進一步建立特異、敏感、快速的PRRSV檢測方法奠定了基礎。
文檔編號G01N33/577GK101979512SQ201010536550
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者張倩, 曲萍, 曹振, 王傳彬, 田克恭, 翟新驗, 遇秀玲, 鄧小雨 申請人:中國動物疫病預防控制中心