專(zhuān)利名稱(chēng)：血小板血栓或臟器損傷的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血小板血栓或臟器損傷的檢測(cè)方法，尤其是涉及彌散性血管內(nèi)凝血 (Disseminated Intravascular Coagulation ；DIC) sK^^-f^i^SEixlSi^^in (Systemic inflammatory response syndrome ；SIRS)患者的上述檢測(cè)方法。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)分析受 試者(尤其是，DIC或SIRS患者)的生物樣本(例如，血液)中的血管性血友病因子(von Willebrand factor ；VffF)和/或其分解因子，可檢測(cè)血小板血栓或臟器損傷，例如，檢測(cè)或 預(yù)測(cè)血小板血栓形成程度、對(duì)血栓癥或臟器損傷的發(fā)病情況進(jìn)行預(yù)測(cè)(即，發(fā)病的危險(xiǎn)性 評(píng)價(jià))、判斷血栓癥或臟器損傷的有無(wú)、對(duì)血栓癥或臟器損傷的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)、監(jiān)測(cè)、確定治 療方法等。
背景技術(shù)：
DIC繼發(fā)于嚴(yán)重的基礎(chǔ)性病變，在全身微血管內(nèi)形成微血栓。因而，微循環(huán)發(fā)生障 礙，表現(xiàn)出臟器功能衰竭或出血傾向。DIC的病情，也和SIRS有關(guān)。DIC時(shí)，會(huì)發(fā)生以下三 種障礙或反應(yīng)。(1)微血栓形成引發(fā)的微循環(huán)障礙，由于缺血致使多種臟器功能衰竭。(2)微血栓形成引發(fā)的消耗性凝血障礙，即，組織因子在細(xì)胞表面大量表達(dá)，促進(jìn) 外源性血液凝固。此外，血液凝固因子、血小板被消耗，呈現(xiàn)出血傾向。(3)過(guò)度纖溶，即凝固促進(jìn)了纖溶系統(tǒng)的激活，生成分解纖維蛋白的纖溶酶。抑制 纖溶酶的α2纖溶酶抑制物(Ci2PI)被消耗，當(dāng)其減少到低于正常情況的60%時(shí)，纖維蛋白 就會(huì)被纖溶酶分解，呈現(xiàn)出血傾向。此外，在并發(fā)敗血癥的DIC的情況下，單核細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)產(chǎn)生的腫瘤壞死因 子(TNF-a)、白介素(IL-Ιβ)等細(xì)胞因子，激活嗜中性粒細(xì)胞。嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的嗜中 性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、活性氧引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，使得血管內(nèi)皮通透性過(guò)度增加，血管 痙攣，循環(huán)泥化淤滯，發(fā)生微循環(huán)障礙。此外人們還認(rèn)為，在受損的血管內(nèi)皮上，單核細(xì)胞本 身、血管內(nèi)皮細(xì)胞被激活，細(xì)胞表面表達(dá)組織因子，形成微血栓。微血栓形成使微循環(huán)障礙 進(jìn)一步惡化，引發(fā)多臟器功能衰竭(multiple organ failure ；M0F) 0近年普及的SIRS概 念中，將該MOF解釋成是由全身性炎癥反應(yīng)引起的。ARDS(adult respiratory distress syndrome)時(shí)，血小板集中于肺循環(huán)，引起肺動(dòng)脈閉塞。SIRS并非由于因與特定抗原反應(yīng)， 引起細(xì)胞因子數(shù)量增加所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，而是因沒(méi)有特定靶標(biāo)，針對(duì)入侵生物體的侵襲 的非特異性免疫反應(yīng)被激活，細(xì)胞因子生成失控而引起重癥MOF的一類(lèi)疾病(非專(zhuān)利文獻(xiàn) 1，2)。SIRS可分為非感染性SIRS和膿毒癥(S印sis)，前者是由休克、外傷、燒傷或急性 胰腺炎等引起的，后者則是由各種病原菌的菌血癥、其他重癥感染引起的。SIRS是生物體對(duì)病原體入侵、組織損傷或缺氧等發(fā)生的自身免疫反應(yīng)，是和侵襲種類(lèi)無(wú)關(guān)的由各種內(nèi)源 性介質(zhì)引起的非特異性全身急性炎癥反應(yīng)。SIRS并發(fā)的臟器功能衰竭，早期是源于組織 缺血、炎癥，但由SIRS拖延引起的多臟器功能失調(diào)綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome ；MODS)的病情惡化與各種介質(zhì)介導(dǎo)的過(guò)度生物反應(yīng)有關(guān)，SIRS是一組很難預(yù)測(cè) 預(yù)后的疾病。SIRS時(shí)，血中TNF-α、IL-I、IL_6等炎癥因子顯示高值，其中，TNF-α被認(rèn)為是引 發(fā)SIRS狀態(tài)下的嗜中性粒細(xì)胞激活、血液凝固反應(yīng)亢進(jìn)的細(xì)胞因子。若嗜中性粒細(xì)胞的活 化程度超過(guò)其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞保護(hù)作用，會(huì)發(fā)生嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、組織蛋 白酶G(Cath印sin G)所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。引起微循環(huán)障礙或形成微血栓?；罨?嗜中性粒細(xì)胞，不但聚集于引起炎癥反應(yīng)的局部部位，而且還會(huì)聚集于肺、肝(灌流壓低， 白細(xì)胞易于粘附)等遠(yuǎn)處臟器。一般認(rèn)為，微循環(huán)障礙引起血液泥化(sludging)，進(jìn)而通 過(guò)形成微血栓，引起血流停滯(stasis)，組織處于缺血狀態(tài)，從而引發(fā)多臟器功能衰竭。此 外，嗜中性粒細(xì)胞通過(guò)血管外浸潤(rùn)，引起實(shí)質(zhì)性臟器損傷。若微血栓形成持續(xù)下去，血液凝 固因子、血小板將被消耗掉。若SIRS狀態(tài)持續(xù)3天以上，則易并發(fā)DIC。由此，DIC和SIRS 病情非常緊密的關(guān)聯(lián)在一起。嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶是分子量約3萬(wàn)的中性蛋白酶，存在于嗜天青(7夂一 顆粒。生理狀態(tài)下，嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，在嗜中性粒細(xì)胞內(nèi)，消化、分解被吞噬的
細(xì)菌、異物，在嗜中性粒細(xì)胞外，則分解彈性蛋白、膠原(III型、IV型)、纖連蛋白、免疫球蛋 白、血液凝固因子X(jué)III等，調(diào)節(jié)組織生物合成。病理狀態(tài)下，嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶則使 生物體構(gòu)成成分，例如，彈性纖維、蛋白聚糖、膠原纖維、抗凝血酶III、α 2-纖溶酶抑制物失 活。若嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶作用于抗凝血酶III的肝素結(jié)合位點(diǎn)，使抗凝血酶III失 活，則引發(fā)DIC。嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，在血液中，結(jié)合于蛋白酶抑制物(cifprotease inhibitor ； α rAT)，α ^AT可在3毫秒內(nèi)使由嗜中性粒細(xì)胞釋放到血液內(nèi)的嗜中性粒細(xì)胞 彈性蛋白酶失活。然而，在發(fā)生炎癥反應(yīng)的組織，由于Ci1-AT被嗜中性粒細(xì)胞釋放的活性 氧、髓過(guò)氧化物酶、乳鐵蛋白氧化，這使得嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶不能被失活，從而引起 組織損傷。由于嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶底物特異性低，因而當(dāng)其釋放過(guò)量，并且α「AT等 抑制物缺乏時(shí)，則存在生物體構(gòu)成成分被分解，引發(fā)嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶所致的自身 組織損傷的危險(xiǎn)。受到嚴(yán)重?fù)p傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落，血小板粘附凝集于脫落部位，形成血 栓。血漿中人VWF是該血小板粘附所必需的，以其為導(dǎo)火索，引發(fā)血小板凝集、細(xì)胞內(nèi) 顆粒釋放等一系列血小板活化過(guò)程，其結(jié)果是，形成血栓，從而止血。通常，VWF是作為分子 量在20，OOOkDa以上的超大分子由血管內(nèi)皮分泌到血中，然后被其中的金屬蛋白酶，即VWF 分解酶切斷成500 20，OOOkDa的多聚合體(multimer)后，在血液中循環(huán)。在疾病狀態(tài)下 (因閉塞等而產(chǎn)生高應(yīng)力的狀態(tài))，VWF的立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，成為伸展結(jié)構(gòu)。這樣的VWF很 難被VWF分解酶分解，因而，血中殘留大量通常觀察不到的巨大VWF分子，與血小板的結(jié)合 更為有效，由此，促進(jìn)了血管內(nèi)血小板的凝集，在微循環(huán)形成血栓。盡管這種以血小板為主 體的血栓形成是生理性止血機(jī)制所必需的，但血栓形成源自凝固因子(第VII因子、第H因 子等)活化所引起的血小板融合和纖維蛋白形成。非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 :Bone RC, CriticalCare Medicine (美國(guó))，1996，24 卷，第
41125-1128 頁(yè)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2:Davies MG.等，British Journal of Surgery (英國(guó))，1997，84卷， 第 920-935 頁(yè)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題如上述，明確解釋以血小板為主體的血栓和以纖維蛋白為主體的血栓的形成的調(diào) 控機(jī)制的因子，盡管至今尚未報(bào)道，然而，通過(guò)探明DIC患者、SIRS患者身上觀察到的全身 微血管中的由纖維蛋白和血小板構(gòu)成的微血栓的形成機(jī)制，可以對(duì)DIC、SIRS患者常見(jiàn)的 預(yù)后不良狀態(tài)予以改善。此外，通過(guò)適當(dāng)早期治療，則有可能阻止臟器損傷的發(fā)病。本發(fā)明 人經(jīng)過(guò)銳意研究，其結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)彈性蛋白酶、纖溶酶或凝血酶使VWF分解酶分解，該分解 模式因彈性蛋白酶、纖溶酶或凝血酶而有所不同，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)彈性蛋白酶值高的DIC或SIRS 患者的血漿中的VWF分解酶的濃度顯著低于正常健康人，由此完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明的目的在于提供檢測(cè)受試者(尤其是，DIC或SIRS患者)的血小板血 栓或臟器損傷的方法，以及上述檢測(cè)用試劑盒。解決問(wèn)題的手段根據(jù)本發(fā)明方法，通過(guò)分析血管性血友病因子(Von Willebrand VffF)和/或其分 解因子，檢測(cè)彌散性血管內(nèi)凝血或全身性炎癥反應(yīng)綜合征患者的血小板血栓或臟器損傷， 可以解決上述問(wèn)題。根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方式，上述分解因子是選自彈性蛋白酶、纖溶酶和凝 血酶組成的組的蛋白酶(更優(yōu)選彈性蛋白酶)。此外，根據(jù)本發(fā)明方法的其它優(yōu)選實(shí)施方式，通過(guò)免疫學(xué)方法對(duì)血管性血友病因 子予以分析。此外，根據(jù)本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方式，在加入含有血管性血友病因子分解酶的 拮抗劑，抑制劑，激動(dòng)劑或活性調(diào)節(jié)劑作為有效成分的醫(yī)藥組合物后，進(jìn)行上述分析。此外，根據(jù)本發(fā)明方法的其它優(yōu)選實(shí)施方式，加入含有選自彈性蛋白酶、纖溶酶和 凝血酶的蛋白酶的拮抗劑，抑制劑，激動(dòng)劑或活性調(diào)節(jié)劑作為有效成分的醫(yī)藥組合物后，進(jìn) 行上述分析。此外，本發(fā)明還關(guān)于彌散性血管內(nèi)凝血或全身性炎癥反應(yīng)綜合征患者的血小板血 栓或臟器損傷的檢測(cè)用試劑盒，其含有與血管性血友病因子分解酶特異性結(jié)合的抗體或其 片段，和/或與血管性血友病因子分解酶的分解因子特異性結(jié)合的抗體或其片段。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，還含有與經(jīng)選自彈性蛋白酶、纖溶酶和凝 血酶的蛋白酶切斷后的VWF分解酶特異性結(jié)合的抗體或其片段。本說(shuō)明書(shū)中的用語(yǔ)“分析”包含“檢測(cè)”和“測(cè)定”，即判斷分析對(duì)象物質(zhì)(例如， VffF)是否存在(檢測(cè))，又定量或半定量確定分析對(duì)象物質(zhì)的量或活性(測(cè)定)。發(fā)明效果本發(fā)明可檢測(cè)受試者，例如DIC或SIRS患者，更具體而言，發(fā)生彈性蛋白酶值度高 的尿道感染、轉(zhuǎn)移性肺癌、和/或急性骨髓性白血病等基礎(chǔ)病變的DIC或SIRS患者的血小 板血栓或臟器損傷情況，具有很高的臨床價(jià)值。根據(jù)本發(fā)明，可簡(jiǎn)便、迅速和高特異性地對(duì)血小板血栓或臟器損傷進(jìn)行檢測(cè)。


圖1是經(jīng)彈性蛋白酶處理后的重組VWF分解酶抗原的電泳結(jié)果示意圖。圖2是經(jīng)纖溶酶或凝血酶處理后的重組VWF分解酶抗原的電泳結(jié)果示意圖。圖3是顯示VWF分解酶和彈性蛋白酶相關(guān)的圖。圖4是以彈性蛋白酶含量區(qū)分的各組患者的VWF分解酶抗原量的分布示意圖。
具體實(shí)施例方式(1)本發(fā)明的檢測(cè)方法根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)對(duì)VWF分解酶和/或其分解因子的量(濃度)或酶活性進(jìn)行定 量，并與正常健康人的VWF分解酶和/或其分解因子的量(濃度)或酶活性進(jìn)行比較，可對(duì) 血栓癥或臟器損傷進(jìn)行檢測(cè)(診斷)。本說(shuō)明書(shū)中，血栓癥或臟器損傷的檢測(cè)包括，例如， 血小板血栓形成程度的檢測(cè)或預(yù)測(cè)、血栓癥或臟器損傷的發(fā)病預(yù)測(cè)(即，發(fā)病的危險(xiǎn)性評(píng) 價(jià))、血栓癥或臟器損傷的存在與否的判定、血栓癥或臟器損傷的預(yù)后預(yù)測(cè)、檢測(cè)、治療方法 的確定等。本發(fā)明方法既可分析VWF分解酶或VWF分解酶的分解因子的量(濃度)，也可分 析酶活性，但優(yōu)選分析量(濃度)。以下，主要基于分析VWF分解酶或其分解因子的量(濃 度)的實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，以下說(shuō)明也應(yīng)當(dāng)適用于分析酶活性的實(shí)施方式。本說(shuō)明書(shū)中，血管性血友病因子分解酶(VWF分解酶)是指特異性切斷血管性血友 病因子(VWF)的A2區(qū)域的酪氨酸(842)和甲硫氨酸(843)，也被稱(chēng)為ADAMT13的金屬蛋白 酶。本發(fā)明方法中，可以將VWF分解酶濃度比正常健康人低作為指標(biāo)。如后述實(shí)施例3 所示，彈性蛋白酶為高值(例如，lOOng/mL以上)的DIC和SIRS患者，與正常健康人相比， 其體液樣本中所含的VWF分解酶濃度要低，其具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(50%或其以下)。類(lèi)似地， 采用本發(fā)明方法，對(duì)VWF分解酶濃度進(jìn)行定量，若比正常健康人的正常值范圍低(例如，超 過(guò)閾值)，可斷定血小板血栓形成程度高，還可斷定血栓癥或臟器損傷發(fā)病的危險(xiǎn)性高，進(jìn) 而還可斷定血栓癥或臟器損傷的預(yù)后情況不好。另一方面，若VWF分解酶濃度在正常值范 圍內(nèi)，則可斷定血小板血栓形成程度低，還可斷定血栓癥或臟器損傷發(fā)病危險(xiǎn)性低，進(jìn)而還 可斷定血栓癥或臟器損傷的預(yù)后情況良好。本發(fā)明方法的可適用對(duì)象(受試者)，只要是需要進(jìn)行血小板血栓形成程度的檢 測(cè)，或血栓癥或臟器損傷(例如，腎損傷或肝損傷，優(yōu)選腎損傷)的發(fā)病或預(yù)后預(yù)測(cè)的患者 即可，沒(méi)有特別限定，例如，可以是DIC或SIRS患者，優(yōu)選彈性蛋白酶為高值的DIC或SIRS 患者，例如，患有白血病(例如，急性骨髓性白血病)、感染(例如，尿道感染)或癌(轉(zhuǎn)移性 肺癌)等基礎(chǔ)病變的DIC或SIRS患者。血栓癥時(shí)，血液在血管中凝固，附著于血管壁形成血栓，由此，血管變狹窄，完全阻 塞，血液流動(dòng)停滯，引起組織、臟器損傷。血管受傷破裂時(shí)，血液中的血小板聚集于上述傷 口，進(jìn)行止血。纖維蛋白凝集于此處形成血栓，完全止血，血管壁細(xì)胞開(kāi)始增殖，血管被修 復(fù)。通常情況下，隨后，溶解血栓的成分發(fā)揮作用，血流恢復(fù)流動(dòng)。若該纖溶作用沒(méi)有正常發(fā)揮作用，則血栓會(huì)阻礙血液流動(dòng)，當(dāng)血液流動(dòng)被完全阻斷時(shí)，就成了血栓癥。據(jù)說(shuō)，40多 歲的日本人，5人中就有1人，50多歲的，3人中就有1人，60多歲的2人中就有1人，70多 歲的基本上都患有血栓癥。血栓癥的主要癥狀是，在腦部，發(fā)生腦血栓、腦栓塞、短暫性腦缺 血發(fā)作；在肺部，發(fā)生肺血栓栓塞癥，在心臟，發(fā)生心絞痛、心肌梗塞、心房?jī)?nèi)血栓，其它的還 有，腸系膜血栓、深部靜脈血栓癥(工二 7 S —癥等)。本發(fā)明方法，通過(guò)分別從正常健康人和受試者(例如，DIC或SIRS患者)采集待 檢樣品，分別測(cè)定其VWF分解酶濃度后，比較測(cè)定值，可進(jìn)行上述檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)，然而，通 常優(yōu)選預(yù)先用采自正常健康人的待檢樣本，確定VWF分解酶濃度的正常值范圍或判定用閾 值。在正常值范圍或判定用閾值預(yù)先確定的情況下，只需對(duì)作為預(yù)測(cè)對(duì)象的受試者的VWF 分解酶進(jìn)行分析，就可以對(duì)上述受試者進(jìn)行上述檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)。上述正常值范圍或判定 用閾值范圍，會(huì)因各種條件，例如，基礎(chǔ)病變、性別、年齡等有所變化，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員， 通過(guò)適當(dāng)選擇與受試者對(duì)應(yīng)的適當(dāng)?shù)哪讣瘓F(tuán)，并對(duì)從該集團(tuán)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理， 就可確定正常值范圍或判定用閾值。本發(fā)明方法中，VWF分解酶的分析方法，只要能夠定量或半定量確定VWF分解酶的 量，或者是判定VWF分解酶的存在與否即可，沒(méi)有特別的限定，例如可以舉出，使用抗VWF分 解酶抗體或其片段的免疫學(xué)方法(例如，酶免疫測(cè)定法、乳膠凝集免疫測(cè)定法、化學(xué)發(fā)光免 疫測(cè)定法、熒光抗體法、放射免疫測(cè)定法、免疫沉降法、免疫組織染色或ffesternblot等)、 生化學(xué)方法(例如，酶學(xué)測(cè)定法)或測(cè)定mRNA量的分子生物學(xué)方法等。在采用免疫學(xué)方法作為VWF分解酶的分析方法的情況下，抗VWF分解酶抗體或其 片段，可以依照公知的方法，例如，W02004/029242號(hào)小冊(cè)子中記載的方法進(jìn)行制備，各種免 疫學(xué)測(cè)定，例如，可依據(jù)W02004/029242號(hào)小冊(cè)子中記載的方法進(jìn)行。VWF分解酶的測(cè)定方法，從敏感度和簡(jiǎn)便性考慮，優(yōu)選免疫學(xué)方法。此處，免疫學(xué)方 法指的是，使用VWF分解酶的抗體，例如，以ELISA法、乳膠法或免疫色譜法對(duì)VWF分解酶進(jìn) 行分析的方法。免疫學(xué)方法，例如有，對(duì)VWF分解酶進(jìn)行標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法、對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo) 記的夾心法、觀察涂覆有抗體的珠子的凝集情況的乳膠珠法、或使用了結(jié)合于膠體金等著 色粒子的抗體的方法等各種各樣的方法，只要是使用了 VWF分解酶的抗體的方法，就包含 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式內(nèi)?？贵w，可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。此外，抗體 片段，例如可以使用Fab、Fab，、F (ab，)2或Fv。本發(fā)明方法中，待檢樣本，優(yōu)選，例如血漿形態(tài)的血液，但也可使用其它材料，例 如，細(xì)胞組織液、淋巴液、胸腺水、腹水、羊水、胃液、尿、胰液、骨髓液或唾液等各種體液。此 外，上述血漿優(yōu)選是枸櫞酸血漿或肝素血漿。本發(fā)明方法中，可以對(duì)VWF分解酶和VWF分解酶分解因子一起分析，也可以分別獨(dú) 立分析。作為待分析的上述分解因子，例如，可以是至少一種選自彈性蛋白酶、纖溶酶或凝 血酶的蛋白酶。如后述實(shí)施例1和實(shí)施例2所示，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)VWF分解酶可被彈性蛋白 酶、纖溶酶或凝血酶分解，并且，其分解模式也因彈性蛋白酶、纖溶酶或凝血酶而有所不同。 因而，VWF分解酶的低下，是由彈性蛋白酶、纖溶酶或凝血酶造成的。本發(fā)明方法，通過(guò)分析VWF分解酶或VWF分解酶分解因子的任意一方，可對(duì)血小板 血栓或臟器損傷進(jìn)行檢測(cè)，但若既對(duì)VWF分解酶進(jìn)行分析，又對(duì)上述分解因子(即，蛋白酶) 進(jìn)行分析，則可更準(zhǔn)確地檢測(cè)或預(yù)測(cè)。
本發(fā)明方法，可以將和正常健康人比較得到的上述蛋白酶濃度的變動(dòng)作為指標(biāo)。上述蛋白酶濃度，可用各種公知方法予以測(cè)定，例如，可采用如下方法測(cè)定。在血 中，90%或90%以上的彈性蛋白酶以和Ci1-抗胰蛋白酶結(jié)合的狀態(tài)存在。該復(fù)合體可采用 使用單克隆抗體的ELISA法測(cè)定。此外，血中產(chǎn)生的凝血酶，也由于被各種因子快速中和， 因而，無(wú)法直接測(cè)定。然而，通過(guò)測(cè)定凝血酶和抗凝血酶III形成的復(fù)合體(TAT)，可在一定 程度上對(duì)血中產(chǎn)生的凝血酶的量進(jìn)行預(yù)測(cè)。纖溶酶，和凝血酶一樣，由于很快從血中消失， 因而無(wú)法直接測(cè)定，但可作為纖溶酶和α 2-抗纖溶酶形成的復(fù)合物(PIC)來(lái)測(cè)定。在測(cè)定 TAT、PIC復(fù)合物時(shí)，可以使用采用單克隆抗體、多克隆抗體的ELISA法、乳膠凝集法等。本發(fā)明方法也可用于監(jiān)測(cè)患者服用所需的醫(yī)藥組合物后的狀態(tài)(例如，血小板血 栓形成程度的評(píng)價(jià)、血栓癥或臟器損傷發(fā)病或預(yù)后預(yù)測(cè))。上述醫(yī)藥組合物，沒(méi)有特殊限定， 例如可以舉出，含有VWF分解酶的拮抗劑、抑制劑、激動(dòng)劑或活性調(diào)節(jié)劑作為有效成分的醫(yī) 藥組合物，或者是，含有選自彈性蛋白酶、纖溶酶和凝血酶的蛋白酶的拮抗劑、抑制劑、激動(dòng) 劑或活性調(diào)節(jié)劑作為有效成分的醫(yī)藥組合物。此外，由于上述各種蛋白酶對(duì)VWF分解酶的分解模式不同，本發(fā)明人認(rèn)為，血小板 血栓和纖維蛋白血栓的生成調(diào)控如下首先，通過(guò)彈性蛋白酶分解VWF分解酶，形成血小板 血栓，接著，纖維蛋白沉淀附著，形成纖維蛋白血栓，據(jù)此分泌的纖溶酶、凝血酶分解VWF分 解酶。例如，通過(guò)掌握導(dǎo)致VWF分解酶的量的變化的主要因素是基于哪種蛋白酶，可更準(zhǔn)確 的判斷病情。例如，當(dāng)觀察到彈性蛋白酶量的增高和VWF分解酶量的減少時(shí)，可判斷處于血小 板血栓形成初期階段，或者是當(dāng)觀察到纖溶酶或凝血酶量的增高和VWF分解酶量的減少 時(shí)，可判斷處于血小板形成后的后期階段。通過(guò)更準(zhǔn)確地掌握病情，可選擇更為適當(dāng)?shù)闹委?方案。上述蛋白酶之中，從VWF分解酶分解活性最高和參與初期階段考慮，優(yōu)選以彈性蛋白 酶作為診斷指標(biāo)。(2)本發(fā)明的檢測(cè)用試劑盒本發(fā)明試劑盒，至少包含抗VWF分解酶抗體或其片段，和/或與VWF分解酶的分解 因子特異性結(jié)合的抗體或其片段，優(yōu)選包含2種或2種以上不同的抗VWF分解酶抗體，和/ 或2種或2種以上不同的抗分解因子抗體。此外，本發(fā)明試劑盒，根據(jù)需要還可含有與經(jīng)蛋 白酶切斷后的VWF分解酶特異性結(jié)合的抗體或其片段，其中，上述蛋白酶選自彈性蛋白酶、 纖溶酶和凝血酶。本發(fā)明試劑盒，可在實(shí)施本發(fā)明方法時(shí)使用。本發(fā)明試劑盒所含的抗VWF分解酶抗體或抗分解因子抗體，可以是單克隆抗體或 多克隆抗體。此外，在含有2種或2種以上不同的抗VWF分解酶抗體，或2種或2種以上不 同的抗分解因子抗體的情況下，可將任意一方(第2抗體)作為標(biāo)記抗體，或者不標(biāo)記，而 是再在試劑盒中追加經(jīng)過(guò)標(biāo)記的抗第2抗體的抗體。
實(shí)施例以下，根據(jù)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的范圍并不限于此?！秾?shí)施例1彈性蛋白酶對(duì)重組VWF分解酶抗原的分解作用》將重組VWF分解酶1. 5 μ g溶解于tris緩沖液/生理鹽水，添加彈性蛋白酶直至 終濃度為20nmol/L或140nmol/L，37°C孵育15分鐘或1小時(shí)后，分別取相當(dāng)于0. 5 μ g的VffF分解酶。將其以非還原SDS電泳(5 20%凝膠)分離后，用Westernblot法轉(zhuǎn)移至 PVDF(聚偏氟乙烯)膜。用市售封閉劑(Block Ace，大日本制藥)室溫封閉30分鐘后，以 tris緩沖液清洗。于1 μ g/mL抗VWF分解酶單克隆抗體(WH2-22-1A 以VWF分解酶的解聯(lián) 蛋白區(qū)域作為抗原決定簇)/tris緩沖液(pH7. 4)/10% Block Ace中，室溫反應(yīng)1小時(shí)后， 以tris緩沖液(pH7. 4)/0. 05% NP-40清洗3次，然后在稀釋了 2000倍的HRP (辣根過(guò)氧 化物酶)標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(BioRad)/tris緩沖液(pH7. 4)/10% Block Ace溶液中， 室溫孵育1小時(shí)。以tris緩沖液(ρΗ7· 4) /0. 05% ΝΡ-40清洗3次后，用TMB溶液(Pierce 公司)顯色。結(jié)果示于圖1。圖1中各泳道的對(duì)應(yīng)關(guān)系如下1 未添加彈性蛋白酶2 添加20nmol/L彈性蛋白酶后，37°C反應(yīng)15分鐘3 添加140nmol/L彈性蛋白酶后，37°C反應(yīng)15分鐘4:未添加彈性蛋白酶5 添加20nmol/L彈性蛋白酶后，37°C反應(yīng)1小時(shí)6 添加140nmol/L彈性蛋白酶后，37°C反應(yīng)1小時(shí)在添加20nmol/L彈性蛋白酶，37°C反應(yīng)15分鐘的情況下，VWF分解酶的160KDa條 帶基本上都被切斷成50KDa，在37°C反應(yīng)1小時(shí)的情況下，160KDa條帶消失，50KDa的條件 也基本上消失。另外，在添加140nmol/L彈性蛋白酶的情況下，若孵育15分鐘以上，160KDa 的條帶全部消失。該結(jié)果提示，彈性蛋白酶對(duì)VWF分解酶的分解作用具有濃度和時(shí)間依賴(lài) 性?！秾?shí)施例2纖溶酶或凝血酶重組VWF分解酶抗原的分解作用》將重組VWF分解酶1. 5 μ g溶解于tris緩沖液/生理鹽水，添加纖溶酶原(終濃 度1 μ mol/L)和組織纖溶酶原激活物(tPA)(終濃度0. 2nmol/L或2nmol/L)，或者是添加凝 血酶直至終濃度為20mU或200mU，37°C孵育15分鐘或1小時(shí)后，分別取相當(dāng)于0. 5 μ g的 VffF分解酶。將其用SDS電泳分離后，以和實(shí)施例1 一樣的方法.進(jìn)行Wfesternblot，檢測(cè) VWF分解酶的條帶。結(jié)果示于圖2。圖2中各泳道的對(duì)應(yīng)關(guān)系如下1 添加 0. 2nmol/L tPA 后，37°C反應(yīng) 15 分鐘2 添加 2nmol/L tPA 后，37°C反應(yīng) 15 分鐘3 添加20mmol/L凝血酶后，37°C反應(yīng)15分鐘4 添加200mmol/L凝血酶后，37°C反應(yīng)15分鐘5:未添加蛋白酶6 添加 0. 2nmol/L tPA 后，37°C反應(yīng) 1 小時(shí)7 添加 2nmol/L tPA 后，37°C反應(yīng) 1 小時(shí)8 添加20mmol/L凝血酶后，37°C反應(yīng)1小時(shí)9 添加200mmol/L凝血酶后，37°C反應(yīng)1小時(shí)在添加纖溶酶或凝血酶，在37°C反應(yīng)15分鐘的情況下，基本上都沒(méi)有觀察到 160KDa條帶分解。在添加纖溶酶，37°C反應(yīng)1小時(shí)的情況下，兩個(gè)濃度，除160KDa條帶外， 還都出現(xiàn)被認(rèn)為是分解得到的130KDa和IOOKDa的條帶。此外，在添加凝血酶，37°C反應(yīng)1小時(shí)的情況下，添加200mU時(shí)，出現(xiàn)130KDa條帶。由此顯示，纖溶酶和凝血酶對(duì)VWF分解酶 剪切的部位相同，但在剪切時(shí)間上，兩者存在差異?！秾?shí)施例3=VffF分解酶和彈性蛋白酶之間的相關(guān)性》本實(shí)施例中，以來(lái)自正常健康人、DIC患者和SIRS患者的血漿為待檢樣本，測(cè)定 VffF分解酶抗原量和彈性蛋白酶量。VWF分解酶抗原量，用市售試劑盒(VWF分解酶ELISA kit，三菱化學(xué)~卜口 >)測(cè)定。此外，用市售試劑盒(PMN彈性蛋白酶/α I-PI復(fù)合物ELISA 試劑盒，CALBI0CHEM公司)，測(cè)定彈性蛋白酶/ α 1-抗胰蛋白酶量來(lái)表示彈性蛋白酶量。結(jié)果示于圖3和圖4。圖3中，X軸是彈性蛋白酶/ α 1-抗胰蛋白酶量(單位ng/ mL)，Y軸是VWF分解酶抗原量(單位%)。此外，圖4中，“N. S.”表示沒(méi)有顯著性差異。彈性蛋白酶/α 1-抗胰蛋白酶和VWF分解酶抗原量之間顯示了良好的負(fù)相關(guān)(y =-0. 1382X+74. 643 ；R2 = 0. 1549)，這表明，在彈性蛋白酶/ α 1-抗胰蛋白酶高值，即組 織破壞繼續(xù)發(fā)展之類(lèi)的MOF狀態(tài)下，由于VWF分解酶抗原被彈性蛋白酶分解，因而，VffF 分解酶抗原量降低。此外，彈性蛋白酶高于等于lOOng/mL的患者，VWF分解酶抗原量為 46. 4士23. 2% (Mean士SD)，而彈性蛋白酶低于等于50ng/mL的患者，為71.7士29.0%，VffF 分解酶抗原量顯著降低(P < 0. 05)。產(chǎn)業(yè)上的可利用性基于本發(fā)明得到的信息提示，TNF-α等細(xì)胞因子激活嗜中性粒細(xì)胞，引發(fā)血液凝 固反應(yīng)過(guò)度進(jìn)行，在嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G等蛋白酶作用下，血管內(nèi)皮細(xì) 胞受損，此時(shí)，為修復(fù)損傷組織而釋放到血中的彈性蛋白酶，將VWF分解酶積極分解，從而 促進(jìn)血小板血栓形成。另一方面，血液發(fā)生過(guò)度凝固反應(yīng)，纖維蛋白從血小板血栓上析出， 纖溶酶類(lèi)開(kāi)始發(fā)揮作用，該作用晚于比彈性蛋白酶的作用，纖溶酶將VWF分解酶分解，引起 纖維蛋白和血小板構(gòu)成的微血栓在微血管中形成，引發(fā)DIC、SIRS發(fā)病。該信息提示，血小 板血栓和纖維蛋白血栓的形成始于絲氨酸蛋白酶對(duì)VWF分解酶的調(diào)控參與。世界上還有大 量血栓癥不能僅用纖維蛋白血栓分解物解釋。本發(fā)明可能有助于解釋上述這樣的血栓癥的 機(jī)制。本發(fā)明可適用于檢測(cè)受試者(例如，DIC或SIRS患者)的血小板血栓或臟器損傷。多數(shù)DIC，常常合并惡性病變或嚴(yán)重病變等預(yù)后不良病情，不乏病情進(jìn)一步惡化的 情況。因此，在DIC治療時(shí)，DIC是繼發(fā)于各種基礎(chǔ)病變，引發(fā)凝固體系活化或凝固調(diào)控因 子降低，微血栓在全身微血管大量發(fā)生，引起血管內(nèi)閉塞，另一方面，由該血栓形成使血小 板和凝固纖溶因子被消耗，并發(fā)消耗性止血障礙，出現(xiàn)嚴(yán)重出血傾向、臟器損傷。因此，在早 期阻止微血栓形成并進(jìn)行早期治療是非常重要的。早期預(yù)測(cè)診斷SIRS的意義如下所述。發(fā)展至多臟器損傷的病例的救活率很低，即 使進(jìn)行高度集中治療，改善效果也微乎其微，病例并沒(méi)有減少。因此，早期捕捉到向臟器損 傷轉(zhuǎn)移的警告信號(hào)，防止其向臟器功能衰竭發(fā)展，至為重要。即，正確判斷SIRS階段患者病 情、嚴(yán)重程度，商討對(duì)策，是必要的。以上，依照特定實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的變形或改 良，也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.抗彈性蛋白酶抗體或其片段在制備用于預(yù)測(cè)彌散性血管內(nèi)凝血癥患者或全身性炎 癥反應(yīng)綜合征患者的體液試樣中血管性血友病因子分解酶的量或酶活性的試劑盒中的用 途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用途，其中，所述的試劑盒進(jìn)一步包含與血管性血友病因子分 解酶特異結(jié)合的抗體或其片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中，所述的試劑盒是根據(jù)預(yù)測(cè)的血管性血友病因 子分解酶的量或酶活性進(jìn)一步檢測(cè)血小板血栓癥或臟器損傷的試劑盒。
4.與血管性血友病因子分解酶特異結(jié)合的抗體或其片段在制備用于預(yù)測(cè)彌散性血管 內(nèi)凝血癥患者或全身性炎癥反應(yīng)綜合征患者的體液試樣中彈性蛋白酶的量的試劑盒中的 用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述用途，其中，所述的試劑盒進(jìn)一步包含抗彈性蛋白酶的抗體或 其片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的用途，其中，所述的試劑盒是根據(jù)預(yù)測(cè)的抗彈性蛋白酶的 量進(jìn)一步檢測(cè)血小板血栓或臟器損傷的試劑盒。
7.試劑盒，其包含抗彈性蛋白酶抗體或其片段，所述試劑盒是用于預(yù)測(cè)彌散性血管內(nèi) 凝血癥患者或全身性炎癥反應(yīng)綜合征患者的體液試樣中血管性血友病因子分解酶的量或 酶活性的試劑盒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述試劑盒，其中，還含有與血管性血友病因子分解酶的分解因子 特異性結(jié)合的抗體或其片段。
9.試劑盒，其包含與血管性血友病因子分解酶特異性結(jié)合的抗體或其片段，所述試劑 盒是用于預(yù)測(cè)彌散性血管內(nèi)凝血癥患者或全身性炎癥反應(yīng)綜合征患者的體液試樣中彈性 蛋白酶的量的試劑盒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述試劑盒，其中，還含有抗彈性蛋白酶的的抗體或其片段。
11.試劑盒，其包含(1)與血管性血友病因子分解酶特異性結(jié)合的抗體或其片段，以及(2)抗彈性蛋白酶抗體或其片段。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了分析血管性血友病因子VWF分解酶和/或其分解因子，檢測(cè)彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)或全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)患者的血小板血栓或臟器損傷的方法。公開(kāi)了彌散性血管內(nèi)凝血或全身性炎癥反應(yīng)綜合征患者的血小板血栓或臟器損傷的檢測(cè)用試劑盒，其含有與血管性血友病因子VWF分解酶特異性結(jié)合的抗體或其片段，和/或與血管性血友病因子VWF分解酶的分解因子特異性結(jié)合的抗體或其片段。
文檔編號(hào)G01N33/573GK102121939SQ201010550130
公開(kāi)日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2005年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月8日
發(fā)明者小野智子 申請(qǐng)人:三菱化學(xué)美迪恩斯株式會(huì)社