專利名稱：一種用于細(xì)胞檢測(cè)的3d微流控結(jié)構(gòu)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于流式細(xì)胞檢測(cè)的三維微流控芯片結(jié)構(gòu)型式及其制備方法。
背景技術(shù)：
流式細(xì)胞術(shù)是一種對(duì)處在液流中的細(xì)胞顆粒逐個(gè)進(jìn)行多參數(shù)自動(dòng)分析和檢測(cè)的 技術(shù)。它可較為精準(zhǔn)地實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞特征和細(xì)胞(或細(xì)胞器)組成的定性及定量分析，因而 在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷中有著極為重要的應(yīng)用價(jià)值。流式細(xì)胞儀(FCM)就是基于上述 流式細(xì)胞術(shù)的基本原理，綜合利用光學(xué)、機(jī)械、流體動(dòng)力學(xué)和計(jì)算機(jī)控制技術(shù)來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞檢 測(cè)及分析功能的一種現(xiàn)代化生物醫(yī)學(xué)儀器。它的核心部件之一，是帶有特定流體控制結(jié)構(gòu) (通道)的流動(dòng)室系統(tǒng)；其基本功能，是通過合理控制液流(包括鞘流及待測(cè)樣液)的運(yùn)動(dòng) 參數(shù)及形態(tài)，來實(shí)現(xiàn)對(duì)樣液的“水力聚焦”(hydro-focusing)。整個(gè)檢測(cè)/分析過程可概要 描述如下將經(jīng)熒光染色或標(biāo)記的細(xì)胞懸浮液放入樣品管中，通過注射等方式壓入流動(dòng)室； 流動(dòng)室內(nèi)同時(shí)注入鞘流，在鞘流的夾裹作用下，樣液將被“聚焦”為寬度極小(與細(xì)胞分子 直徑約在同一數(shù)量級(jí))的微小流束，從而使其中的細(xì)胞能排成單列，以一定速度逐個(gè)地進(jìn) 入檢測(cè)區(qū)。在此區(qū)域內(nèi)，由光源系統(tǒng)產(chǎn)生的激光光束以特定角度照射到樣液上，在細(xì)胞上產(chǎn) 生散射光，并激發(fā)出熒光。利用光學(xué)傳感器對(duì)這些信號(hào)進(jìn)行接收，并通過光電轉(zhuǎn)換器件將其 轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，再將采集到的電信號(hào)做采樣編碼、濾波整流等后處理，最后通過DAQ數(shù)據(jù)采 集卡送入計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析，便可得到所需的細(xì)胞信息。由此可見，流式細(xì)胞儀流控結(jié)構(gòu)的設(shè) 計(jì)與制造，對(duì)液流的聚焦效果，進(jìn)而對(duì)整個(gè)儀器的檢測(cè)及分析精度，具有至關(guān)重要的影響。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科技的發(fā)展，開發(fā)新型的高性能、便攜式的流式細(xì)胞分析儀，以進(jìn)一 步提升分子細(xì)胞學(xué)檢測(cè)、分析的效率和水平，已成為一項(xiàng)迫在眉睫的任務(wù)。近年來，微機(jī)電 系統(tǒng)(MEMS)和微流控技術(shù)的興起和發(fā)展，為上述目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)提供了一種全新和有效的技 術(shù)手段。利用這一技術(shù)，我們可以在玻璃、硅片、有機(jī)聚合物等材料上制作微通道、微泵、微 閥、微電極和連接器等功能器件，因此也可方便地制作用于細(xì)胞檢測(cè)的微流動(dòng)室結(jié)構(gòu)，并可 望將其與微泵和光學(xué)檢測(cè)器件等集成到單一芯片上，形成所謂微流控芯片實(shí)驗(yàn)室。相比于 傳統(tǒng)裝置，微流控芯片的微米級(jí)結(jié)構(gòu)將顯著增大流體環(huán)境的面積/體積比，從而使系統(tǒng)性 能發(fā)生顯著改善(如體積減小、效率提高、成本降低，試樣和試劑消耗量下降等)，具有明顯 的技術(shù)和經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。然而，目前已有的用于細(xì)胞分析的微流控芯片，盡管具體形式和尺寸參數(shù)各不相 同，但卻基本都屬于一種“二維”聚焦結(jié)構(gòu)，主要體現(xiàn)在整個(gè)流控結(jié)構(gòu)系一次性刻蝕得到，所 有的液流通道及匯聚區(qū)都具有相同的深度，且底部平整，這使得流體的聚焦只能在芯片所 在二維平面內(nèi)實(shí)現(xiàn)(即樣液在左右兩側(cè)鞘流的夾裹下沿寬度方向匯聚)，而在與之垂直的 方向即通道的深度方向，則無法實(shí)現(xiàn)匯聚。這就有可能造成同一時(shí)刻有不止一個(gè)細(xì)胞分子 上下重疊通過檢測(cè)點(diǎn)(激光光束照射處)，影響到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。而理想的情況，是希 望樣液同時(shí)也能在垂直方向受到某種力或約束的作用，實(shí)現(xiàn)真正的“三維”聚焦，以保證通 過檢測(cè)點(diǎn)細(xì)胞數(shù)目的唯一性。這就需要對(duì)現(xiàn)有流控結(jié)構(gòu)進(jìn)行創(chuàng)新設(shè)計(jì)，使之既能滿足上述三維聚焦的功能需求，又便于加工制備，具有較好的經(jīng)濟(jì)性及實(shí)用性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)三維聚焦的新型細(xì)胞計(jì)數(shù)用微流控芯片結(jié) 構(gòu)，以及加工制備這種結(jié)構(gòu)的工藝方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的—種用于細(xì)胞檢測(cè)的3D微流控結(jié) 構(gòu)，該結(jié)構(gòu)為上行式微流控結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)由玻璃 蓋片和聚二甲基硅氧烷PDMS的流控結(jié)構(gòu)和基底封接而成，流控結(jié)構(gòu)由鞘流入流通道、樣液 入流通道、匯流腔、匯聚通道以及上行臺(tái)階和出口構(gòu)成，所述的鞘流入流通道在樣液入流通 道左右兩側(cè)對(duì)稱排列，樣液入流通道在中間，此三股通道與匯流腔相通并具有相同的深度， 匯流腔通過上行臺(tái)階與匯聚通道相通，匯聚通道的深度小于匯流腔。一種用于細(xì)胞檢測(cè)的3D微流控結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)為下行式微流控結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)由玻璃 蓋片和聚二甲基硅氧烷PDMS的流控結(jié)構(gòu)和基底封接而成，流控結(jié)構(gòu)由鞘流入流通道、樣液 入流孔、匯流腔、匯聚通道以及下行臺(tái)階和出口構(gòu)成，所述的鞘流入流通道為左右對(duì)稱排 列，與匯流腔相通并具有相同的深度，樣液入流孔位于匯流腔底部，匯流腔通過下行臺(tái)階與 匯聚通道相通，匯聚通道的深度大于匯流腔。一種用于細(xì)胞檢測(cè)的3D微流控結(jié)構(gòu)的制備方法，采用兩次光刻，一次顯影的制備 方法，即(a)在硅片或玻璃基底的一表面涂覆一層負(fù)型感光材料；(b)提供第一塊掩模板，該掩模板的曝光圖案為上述微結(jié)構(gòu)的二維圖案，利用紫外 光光束對(duì)負(fù)型感光材料進(jìn)行曝光；(c)曝光后不顯影，緊接著再在第一層負(fù)型感光材料上涂覆第二層相同的負(fù)型感 光材料；(d)提供第二塊掩模板，制作上行式結(jié)構(gòu)時(shí)，該第二塊掩模板的曝光圖案為鞘流、 樣流入流通道及匯流腔的二維圖案，制作下行式結(jié)構(gòu)時(shí)該第二塊掩模板的曝光圖案為匯聚 通道的二維圖案，與第一塊掩模板對(duì)準(zhǔn)后利用紫外光光束對(duì)負(fù)型感光材料進(jìn)行二次曝光；(e)經(jīng)兩次曝光后，進(jìn)行顯影程序，得到所需陽模；(f)在此陽模上注塑聚二甲基硅氧烷PDMS材料，固化后得到所需的3D微流控結(jié) 構(gòu)。其中該負(fù)型感光材料均為SU-8光刻膠。在上行式結(jié)構(gòu)中，由于匯流腔的深度比匯聚通道區(qū)大，而前后兩次涂覆負(fù)型感光 材料的總厚度正是聚二甲基硅氧烷PDMS微通道匯流腔的深度，因此第一層負(fù)型感光材料 涂覆的厚度等于匯聚通道區(qū)深度，第一塊掩模板的曝光圖案為整體微結(jié)構(gòu)的二維圖案；第 二層負(fù)型感光材料涂覆的厚度等于匯流腔深度與匯聚通道深度之差，第二塊掩模板的曝光 圖案為液流入流通道及匯流腔的二維圖案。同理，在下行式結(jié)構(gòu)中，由于匯流腔的深度比匯聚通道區(qū)小，因此第一層負(fù)型感光 材料涂覆的厚度等于匯流腔深度，第一塊掩模板的曝光圖案為整個(gè)微通道的二維圖案；第 二層負(fù)型感光材料涂覆的厚度等于匯聚通道深度減去匯流腔深度，第二塊掩模板的曝光圖 案為液流匯聚通道的二維圖案。
本發(fā)明所述用于流式細(xì)胞分析的新型3D微流控芯片結(jié)構(gòu)，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)微流體 在垂直方向和水平方向的三維聚焦，從而保證了在某一時(shí)刻通過激光檢測(cè)點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)目的 唯一性。該結(jié)構(gòu)加工方便，用PDMS做結(jié)構(gòu)材料，成本較低，生物兼容性較好。


圖1顯示的是2D微流控芯片細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果圖2顯示的是本發(fā)明新型3D微流控芯片細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果圖3-a為本發(fā)明上行式新型3D微流控結(jié)構(gòu)示意(玻璃蓋片省略)圖3-b為本發(fā)明下行式新型3D微流控結(jié)構(gòu)示意(玻璃蓋片省略)圖4至圖12顯示本發(fā)明聚二甲基硅氧烷PDMS微流控結(jié)構(gòu)制備工藝示意圖。簡(jiǎn)單符號(hào)說明1 玻璃該片2 PDMS流控結(jié)構(gòu)3 基底4 鞘流入流通道5 樣液入流通道(孔)6 匯流腔7 匯聚通道8 上行臺(tái)階結(jié)構(gòu)9 下行臺(tái)階結(jié)構(gòu)10 出口100檢測(cè)激光20 基底21 第一層SU-8光刻膠22 第一塊掩模板23 紫外光光束24 第二層SU-8光刻膠25 第二塊掩模板26 SU-8 陽模27 PDMS 材料28 PDMS流控結(jié)構(gòu)29 玻璃蓋片201 基底的表面
具體實(shí)施例方式圖1顯示的是2D微流控芯片細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果。由于2D微流控芯片流體的聚焦只能 在芯片所在二維平面內(nèi)實(shí)現(xiàn)(即樣液在左右兩側(cè)鞘流的夾裹下沿寬度方向匯聚)，而在與 之垂直的方向即通道的深度方向，則無法實(shí)現(xiàn)匯聚。因此就有可能造成同一時(shí)刻有不止一 個(gè)細(xì)胞分子上下重疊通過檢測(cè)點(diǎn)(激光光束照射處)，影響到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
圖2顯示的是本發(fā)明新型3D微流控芯片細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果。由于在匯聚通道添加了 臺(tái)階結(jié)構(gòu)，使得3D微流控芯片的流體在垂直方向也受到約束而實(shí)現(xiàn)聚焦，使得同一時(shí)刻只 有一個(gè)細(xì)胞通過檢測(cè)點(diǎn)，改善了 2D微流控芯片的不足。圖3-a為本發(fā)明上行式新型3D微流控結(jié)構(gòu)示意(玻璃蓋片省略)。其結(jié)構(gòu)由玻璃 蓋片(1)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)流控結(jié)構(gòu)2和基底3封接而成，流控結(jié)構(gòu)2由鞘流入流 通道4、樣液入流通道5、匯流腔6、匯聚通道7以及上行臺(tái)階8和出口 10構(gòu)成，所述的鞘流 入流通道4在樣液入流通道5左右兩側(cè)對(duì)稱排列，樣液入流通道5在中間，此三股通道與匯 流腔6相通并具有相同的深度，匯流腔6通過上行臺(tái)階8與匯聚通道7相通，匯聚通道7的 深度小于匯流腔6。圖3-b為本發(fā)明下行式新型3D微流控結(jié)構(gòu)示意(玻璃蓋片省略)。其結(jié)構(gòu)由玻璃 蓋片1和聚二甲基硅氧烷(PDMS)流控結(jié)構(gòu)2和基底3封接而成，流控結(jié)構(gòu)2由鞘流入流通 道4、樣液入流孔5、匯流腔6、匯聚通道7以及下行臺(tái)階9和出口 10構(gòu)成，所述的鞘流入流 通道4為左右對(duì)稱排列，與匯流腔6相通并具有相同的深度，樣液入流孔5位于匯流腔6底 部，匯流腔6通過下行臺(tái)階9與匯聚通道7相通，匯聚通道7的深度大于匯流腔6。圖4至圖12，顯示本發(fā)明PDMS微流控結(jié)構(gòu)制備工藝的示意 圖。首先，參考圖4，提 供一基底20，該基底20的材料一般為硅或玻璃。接著，參考圖5，涂覆第一層SU-8光刻膠 21于該基底20的一表面201上，該第一層SU-8光刻膠21為一種負(fù)型感光材料。接著，參考圖6，提供第一光掩模板22，利用紫外光光束23對(duì)該第一層SU_8光刻 膠21進(jìn)行曝光程序，使得相對(duì)應(yīng)部分的該第一層SU-8光刻膠21發(fā)生光固化反應(yīng)而成為固 體。接著，參考圖7，在顯影程序之前，于第一層SU-8光刻膠21基礎(chǔ)上再涂覆第二層SU-8 光刻膠24。接著，參考圖8，提供第二光掩模板25，利用紫外光光束23對(duì)該第二層SU-8光 刻膠24進(jìn)行曝光程序，使得相對(duì)應(yīng)部分的該第二層SU-8光刻膠24發(fā)生光固化反應(yīng)而成為 固體。由于第二塊掩模板曝光圖案的面積當(dāng)小于該第一塊掩模板，因此，曝光后發(fā)生光固化 反應(yīng)，第二層SU-8光刻膠24固化體積小于第一層SU-8光刻膠21固化體積，由此而形成 臺(tái)階形狀SU-8模具26。接著，參考圖9，對(duì)進(jìn)行過光刻的第一層SU-8光刻膠21和第二層 SU-8光刻膠24共同進(jìn)行顯影程序，未曝光部分被顯影液溶解掉，曝光部分保留下來，形成 臺(tái)階狀SU-8模具26。至此，臺(tái)階狀SU-8模具制作完成，接下來是PDMS澆鑄、固化、鉆孔、封裝等程序。 接著，參考圖10，將PDMS材料27澆鑄在SU-8模具26表面并固化。接著，參考圖11，去除 SU-8模具26后得到具有微流體通道的PDMS流控結(jié)構(gòu)28。參考圖12，打孔，并使用玻璃29 封裝。(1)本發(fā)明所述新型3D微流控芯片結(jié)構(gòu)描述為整體結(jié)構(gòu)由玻璃蓋片1、聚二甲基硅氧烷PDMS流控結(jié)構(gòu)2和基底3封接而成。流 控結(jié)構(gòu)2由左右對(duì)稱的鞘流入流通道4、樣液入流通道(孔)5、匯流腔6、匯聚通道7以及臺(tái) 階狀結(jié)構(gòu)8、9構(gòu)成和出口 10。為實(shí)現(xiàn)三維聚焦，匯聚通道和前述其它結(jié)構(gòu)區(qū)具有不同的深 度，即在它們的結(jié)合處設(shè)計(jì)有臺(tái)階狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)匯聚液流Z向約束方位的不同，又可分為液 流上行式與下行式兩種結(jié)構(gòu)(a)上行式。鞘流、樣液入流通道和匯流腔一次刻蝕形成，具有相同的深度，并通過 上行臺(tái)階與較淺的匯聚通道相通。這樣，液流被壓入芯片并進(jìn)行匯聚后，將溯臺(tái)階而上，樣液將同時(shí)受左、右、下三個(gè)方向的作用(約束)而實(shí)現(xiàn)三維聚焦；(b)下行式。鞘流入流通道和匯流腔一次刻蝕形成，具有相同的深度，并通過下行 臺(tái)階與較深的匯聚通道相通；樣液通過匯流腔底部的入流孔進(jìn)入芯片。液流在匯流腔匯聚 后，將沿臺(tái)階向下流入?yún)R聚通道，樣液將始終被壓迫在通道底部，同時(shí)受左、右、上三個(gè)方向 的作用而實(shí)現(xiàn)三維聚焦；(2)本發(fā)明所述微流控芯片聚二甲基硅氧烷PDMS流控結(jié)構(gòu)的制作步驟是

(a)提供一基底20，并在該基底一表面涂覆一層負(fù)型感光材料21 ；(b)提供第一塊掩模板22，利用紫外光光束23對(duì)該負(fù)型感光材料21進(jìn)行曝光；(c)曝光后先不進(jìn)行顯影程序，緊接著在第一層負(fù)型感光材料21基礎(chǔ)上涂覆第二 層負(fù)型感光材料24 ；(d)提供第二光掩模板25，利用紫外光光束對(duì)該第二層負(fù)型感光材料24進(jìn)行曝 光；(e)兩次曝光后，利用顯影液對(duì)該第一層和該第二層負(fù)型感光材料進(jìn)行顯影處理， 可得到臺(tái)階狀陽模26;(f)在此陽模上注塑聚二甲基硅氧烷PDMS材料27，固化后得到所需微流控芯片的 PDMS流控結(jié)構(gòu)28。(g)對(duì)“下行式”結(jié)構(gòu)，在匯流腔底部利用激光打孔，形成樣液入流孔。(h)將脫模后的PDMS流控結(jié)構(gòu)反置粘貼在基底210上，并在其上表面覆蓋玻璃 29，形成封裝芯片。由此，可以解決具有臺(tái)階狀結(jié)構(gòu)通道的聚二甲基硅氧烷PDMS微流控芯片制備的 問題。
權(quán)利要求
1.一種用于細(xì)胞檢測(cè)的3D微流控結(jié)構(gòu)，其特征在于，該結(jié)構(gòu)為上行式微流控結(jié)構(gòu)，其 結(jié)構(gòu)由玻璃蓋片(1)和聚二甲基硅氧烷PDMS的流控結(jié)構(gòu)(2)和基底(3)封接而成，流控結(jié) 構(gòu)(2)由鞘流入流通道(4)、樣液入流通道( 、匯流腔(6)、匯聚通道(7)以及上行臺(tái)階(8) 和出口(10)構(gòu)成，所述的鞘流入流通道(4)在樣液入流通道( 左右兩側(cè)對(duì)稱排列，樣液 入流通道( 在中間，此三股通道與匯流腔(6)相通并具有相同的深度，匯流腔(6)通過上 行臺(tái)階⑶與匯聚通道(7)相通，匯聚通道(7)的深度小于匯流腔(6)。
2.一種用于細(xì)胞檢測(cè)的3D微流控結(jié)構(gòu)，其特征在于，該結(jié)構(gòu)為下行式微流控結(jié)構(gòu)，其 結(jié)構(gòu)由玻璃蓋片(1)和聚二甲基硅氧烷PDMS的流控結(jié)構(gòu)(2)和基底(3)封接而成，流控結(jié) 構(gòu)⑵由鞘流入流通道G)、樣液入流孔(5)、匯流腔(6)、匯聚通道(7)以及下行臺(tái)階(9) 和出口(10)構(gòu)成，所述的鞘流入流通道⑷為左右對(duì)稱排列，與匯流腔(6)相通并具有相 同的深度，樣液入流孔( 位于匯流腔(6)底部，匯流腔(6)通過下行臺(tái)階(9)與匯聚通道 (7)相通，匯聚通道(7)的深度大于匯流腔(6)。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述用于細(xì)胞檢測(cè)的3D微流控結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在 于，采用兩次光刻，一次顯影的制備方法，即(a)在硅片或玻璃基底00)的一表面涂覆一層負(fù)型感光材料；(b)提供第一塊掩模板(22)，該掩模板的曝光圖案為上述微結(jié)構(gòu)的二維圖案，利用紫 外光光束對(duì)負(fù)型感光材料進(jìn)行曝光；(c)曝光后不顯影，緊接著再在第一層負(fù)型感光材料上涂覆第二層相同的負(fù)型感光材料；(d)提供第二塊掩模板(25)，制作上行式結(jié)構(gòu)時(shí)，該第二塊掩模板的曝光圖案為鞘流、 樣流入流通道及匯流腔的二維圖案，制作下行式結(jié)構(gòu)時(shí)該第二塊掩模板的曝光圖案為匯聚 通道的二維圖案，與第一塊掩模板02)對(duì)準(zhǔn)后利用紫外光光束對(duì)負(fù)型感光材料進(jìn)行 二次曝光；(e)經(jīng)兩次曝光后，進(jìn)行顯影程序，得到所需陽模06)；(f)在此陽模上注塑聚二甲基硅氧烷PDMS材料(XT)，固化后得到所需的3D微流控結(jié) 構(gòu)(28)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中該負(fù)型感光材料均為SU-8光刻膠。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于細(xì)胞檢測(cè)的3D微流控結(jié)構(gòu)及其制備方法，整體結(jié)構(gòu)由玻璃蓋片、聚二甲基硅氧烷PDMS流控結(jié)構(gòu)和基底封接而成。其PDMS流控結(jié)構(gòu)上刻有鞘流及樣流入流通道(孔)、匯流腔及用以實(shí)現(xiàn)三維聚焦的臺(tái)階狀結(jié)構(gòu)和匯聚通道。在匯流腔，所設(shè)計(jì)的通道形狀可實(shí)現(xiàn)流體左、右兩個(gè)方向聚焦，在匯聚通道中，液流通過一個(gè)臺(tái)階狀結(jié)構(gòu)，受到垂直方向的約束，從而可實(shí)現(xiàn)三維聚焦。同時(shí)提出了采用“兩次光刻、一次顯影”的方式來制備上述微流控結(jié)構(gòu)的工藝方法。本發(fā)明用簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)方案即可實(shí)現(xiàn)三維流體聚焦，應(yīng)用效果好、加工方便；用聚二甲基硅氧烷PDMS做結(jié)構(gòu)材料，成本低，生物兼容性好。
文檔編號(hào)G01N15/14GK102128777SQ20101055723
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者李義平, 王冰, 王小鵬, 王敬元, 王永泉, 陳花玲 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)