專利名稱：肥大細胞脫顆粒的直接監(jiān)測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種測定引起類過敏反應的物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
過敏反應為常見的不良反應之一。過敏反應即變態(tài)反應，是外源性抗原物質(zhì)與體內(nèi)抗體間所發(fā)生的一種非正常的免疫反應。可以誘發(fā)過敏反應的物質(zhì)很多，如蛋白質(zhì)、多肽、多糖等大分子物質(zhì)具有完全的抗原性；另一些分子較小的化合物可作為半抗原與體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合成全抗原，從而引起過敏反應。目前涉及到過敏反應的過敏物質(zhì)很多，發(fā)生頻率較高的有藥品(中藥及西藥)、食品、花粉、螨蟲等。最新調(diào)查研究表明，77 %的急性過敏反應為類過敏反應，類過敏反應發(fā)生率遠高于I型超敏反應。類過敏反應無需IgE介導，首次接觸藥物即可出現(xiàn)過敏癥狀，給人類的生活帶來及大的危害。類過敏反應屬于非免疫反應，無免疫系統(tǒng)參與，不需接觸抗原物質(zhì)，也無抗體參與，首次用藥即可激發(fā)，外來物質(zhì)直接刺激肥大細胞和嗜堿粒細胞脫顆粒，釋放大量組胺， 由此產(chǎn)生過敏癥狀。因此，肥大細胞脫顆粒是類過敏反應中最直接、最重要的環(huán)節(jié)。肥大細胞的脫顆粒過程是由一系列步驟組成的，它包括囊泡的轉(zhuǎn)運、定向、錨定、 融合等環(huán)節(jié)，每一個環(huán)節(jié)均受到嚴格調(diào)控。因此直接觀察囊泡的運動方向監(jiān)測其與膜融合的過程無疑是動態(tài)觀察脫顆粒的最直接方法，但目前還沒有一個合適的方法對其進行評估。RBL-2H3細胞是離體實驗中常用的大鼠肥大細胞株，具有與在體肥大細胞相似的反應特性，因此，常被做為過敏反應的離體研究對象。在本發(fā)明中，綠色熒光蛋白(Green Fluorescence Protein, GFP)與囊泡表面的標志性表面分子CD63基因融合，使RBL-2H3細胞(離體實驗中最常規(guī)使用的大鼠肥大細胞株)特異性表達GFP-⑶63分子，使囊泡具有可識別的綠色熒光，利用全內(nèi)反射顯微鏡成像技術(shù)，通過對囊泡與細胞膜融合釋放活性物質(zhì)的直接觀察，評估肥大細胞脫顆粒的程度，從而建立一種直接觀測方法。該方法在活細胞狀態(tài)下，直觀、靈敏、快速對致敏原進行篩選，克服了原有方法的不足，將為過敏原過敏性篩查、過敏原檢測、環(huán)境安全性監(jiān)測等領(lǐng)域提供新的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種通過肥大細胞脫顆粒的直接監(jiān)測測定過敏物質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟步驟1，轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞和過敏物質(zhì)放到一起培養(yǎng)，步驟2，用顯微鏡掃描采集培養(yǎng)物的圖像，步驟3，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運動確定過敏物質(zhì)的存在。
優(yōu)選的方法包括以下步驟步驟1，轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞放到MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液，孵育；步驟3，加入過敏物質(zhì)用顯微鏡掃描采集圖像，步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運動確定過敏物質(zhì)的存在。更優(yōu)選的方法包括以下步驟步驟1，將轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞放到MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng) 24h ；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液，37°C孵育30min ；步驟3，加入過敏物質(zhì)后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每IOs采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集40min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運動確定過敏物質(zhì)的存在。更優(yōu)選的方法還可以是以下方法，包括以下步驟步驟1，將轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞放到MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng) 24h ；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液，37°C孵育30min ；步驟3，加入過敏物質(zhì)后移至全內(nèi)反射顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每Is采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集20min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運動確定過敏物質(zhì)的存在。本發(fā)明所述的過敏物質(zhì)包括但不限于以下物質(zhì)藥物，花粉，食物，螨蟲，細菌，微生物，植物等。本發(fā)明針對藥物中的過敏物質(zhì)具有特別優(yōu)越的價值，如藥物的注射劑，特別是針對中藥的注射劑如雙黃連粉針、清開靈注射液、穿琥寧注射液、參麥注射液、魚腥草注射液寸。本發(fā)明的方法經(jīng)過以下實驗證明本發(fā)明的方法比現(xiàn)有技術(shù)優(yōu)越1 材料試劑MEM 培養(yǎng)基(GIBC0，美國)；Compound48/80 (Sigma,美國)；CD63-GFP 質(zhì)粒；Iipofect轉(zhuǎn)染試劑(Tiangen Biotech，中國)；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(Tiangen Biotech，中國)；E. coli感受態(tài)大腸桿菌(Tiangen Biotech，中國)；大鼠嗜堿性細胞細胞株RBL-2H3細胞購自協(xié)和細胞庫，使用MEM培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)。儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo 371，美國)；超凈工作臺(蘇州凈化，中國)；激光掃描共焦顯微鏡及全內(nèi)反射顯微鏡(Olympus FV1000,日本)；PCR儀(英國TechneTC-512)2 方法2. 1CD63-GFP RBL-2H3 細胞的構(gòu)建2. 1. 1CD63-GFP融合基因的構(gòu)建CD63全長cDNA是從RBL-2H3細胞中應用逆轉(zhuǎn)錄PCR反應擴增獲得。上游引物為 AGCTTCGAATTCatggc ggtggaagga ggaatg (EC0R I)，下游引物為ACCGGTGGATCCCGCATTACTTCATAGCCACTTCGA (BamH I)。CD63 cDNA通過EcoR I和BamH I雙酶切后與經(jīng)相同酶切后的 pEGFP-Nl質(zhì)粒鏈接，后克隆入感受態(tài)E. coli DH5a中，構(gòu)建成⑶63-GFP E. coli，抗生素篩選后，增菌，進行測序驗證。2. 1. 2質(zhì)粒提取增菌后，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，具體過程按說明書所示。2. 1. 3 轉(zhuǎn)染體外擴增質(zhì)粒后按照DNAfection試劑盒說明書將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RBL-2H3細胞內(nèi)。 轉(zhuǎn)染后使用不含青鏈霉素的MEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。7 后培養(yǎng)液中加入G418 (G418濃度為 0. 6ug/ml)進行篩選。待篩選至有熒光的細胞達到50%左右時，利用流式細胞儀對細胞進行分選，純化后，傳代，得穩(wěn)定表達細胞株。2. 2本發(fā)明的肥大細胞脫顆粒的活體檢測方法2. 2. ITIRFM觀察將RBL-2H3細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換為臺氏液。37°C孵育30min后移至激光掃描共聚焦顯微鏡IOOX油鏡下觀察。選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后切換至TIRFM掃描模式，開始連續(xù)掃描采集圖像，曝光時間0. Is, Is采集一張圖片，連續(xù)采集20min。compound48/80及陰性對照藥(細胞培養(yǎng)液)分別均在圖像采集前加入。2. 2. 2激光掃描共聚焦顯微鏡將RBL-2H3細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h 后，將培養(yǎng)液換為臺氏液。37°C孵育30min后移至激光掃描共聚焦顯微鏡IOOX油鏡下觀察。 選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每隔IOs采集一張圖像，共采集40min。COmpOimd48/80及陰性對照藥(細胞培養(yǎng)液)分別均在圖像采集前加入。4 結(jié)果4. 1CD63-GFP RBL-2H3 細胞株的建立轉(zhuǎn)染了 GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換為臺氏液。37°C孵育30min后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察，激發(fā)波長 488nm，500-600nm波長處采集熒光信號。圖像大小512X512B CD63-GFP轉(zhuǎn)染細胞，圖1 CD63-GFP RBL-2H3細胞株的建立轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換為臺氏液。37°C孵育30min后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察，激發(fā)波長 488nm，500-600nm波長處采集熒光信號。圖像大小512X512。從圖1可以看出，在單純轉(zhuǎn)染Free GFP的對照組細胞中，GFP熒光均勻分布在整個細胞中；而在轉(zhuǎn)染CD63-GFP的細胞中，GFP熒光分布在細胞內(nèi)囊泡的膜表面，形成圓環(huán)樣的形狀，說明轉(zhuǎn)染成功。4. 2Compound48/80刺激后TIRFM觀察細胞膜表面熒光顆粒變化圖2C0mp0und 48/80刺激后，細胞膜表面TIRF結(jié)果圖轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換為臺氏液。37°C孵育30min后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察，激發(fā)波長 488nm，500-600nm波長處采集熒光信號。選取到合適的細胞及視野后，切換至TIRF狀態(tài)， EM-CXD工作狀態(tài)-60°C，圖像采集時間0. ls，大小512X512，每Is采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集20min。TIRF圖像采集在加入compound48/80后立即開始。通過圖2可以看出，經(jīng)抗原刺激后，細胞膜表面在不同時間出現(xiàn)多個熒光顆粒，表明我們觀察到了細胞內(nèi)被熒光標記的囊泡運動到細胞膜表面時的狀態(tài)。圖3細胞經(jīng)Compound 48/80刺激后激光共聚焦成像結(jié)果轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換為臺氏液。37°C孵育30min后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察，激發(fā)波長 488nm，500-600nm波長處采集熒光信號。選取到合適的細胞及視野后，每IOs采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集40min。compound48/80在第二張圖像采集后加入。通過圖3可以看出，經(jīng)抗原刺激后，細胞內(nèi)部熒光顆粒在不同時間點有比較明顯的向細胞外運動的現(xiàn)象，說明我們觀察到了細胞內(nèi)被熒光標記的囊泡向細胞膜運動的過程。4. 3無關(guān)刺激后TIRFM觀察細胞膜表面熒光顆粒變化圖4轉(zhuǎn)染細胞加入無關(guān)刺激后TIRF成像結(jié)果轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換為臺氏液。37°C孵育30min后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察，激發(fā)波長 488nm, 500-600nm波長處采集熒光信號。選取到合適的細胞及視野后，切換至TIRF采集狀態(tài)。EM-CCD工作狀態(tài)-60°C，圖像大小512X512，采集時間0. ls，每Is采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集20min。TIRF圖像采集在加入無關(guān)刺激劑(細胞培養(yǎng)液)后立即開始。通過圖4可以看出，經(jīng)無關(guān)刺激后，細胞膜表面在不同時間點基本無新增熒光顆粒出現(xiàn)，說明沒有被熒光標記的囊泡運動到細胞膜表面。圖5無關(guān)刺激后共聚焦觀察細胞內(nèi)部熒光顆粒運動變化轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換為臺氏液。37°C孵育30min后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察，激發(fā)波長 488nm，500-600nm波長處采集熒光信號。選取到合適的細胞及視野后，每IOs采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集40min。無關(guān)刺激劑(細胞培養(yǎng)液)在第二張圖像采集后加入。通過圖5可以看出，經(jīng)無關(guān)刺激后，細胞內(nèi)部熒光顆粒在不同時間點在做隨機運動，說明我們對無關(guān)刺激細胞未觀察到細胞內(nèi)被熒光標記的囊泡向細胞膜運動的現(xiàn)象。討論⑶63是一種分子量為50_60kDa的四次跨膜的糖蛋白，表達于靜止的嗜堿性顆粒、 肥大細胞和血小板的嗜堿性顆粒膜的表面[1，2].嗜堿性粒細胞或肥大細胞抗原激活后， 胞漿內(nèi)的顆粒與細胞漿膜融合，使顆粒內(nèi)的炎癥介質(zhì)如組胺連續(xù)釋放，引起過敏或類過敏反應。研究表明[3]，用抗IgE抗體激活人嗜堿性粒細胞后，用流式細胞技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)表面的CD63表達增加，說明肥大細胞脫顆粒的過程是細胞內(nèi)嗜堿性顆粒運動到細胞膜表面， 與細胞膜融合后，釋放出顆粒內(nèi)的活性物質(zhì)的過程，CD63的表達與脫顆粒呈正相關(guān)W]。為了監(jiān)測肥大細胞脫顆粒的動態(tài)過程，2001年，Amano T.等用GFP轉(zhuǎn)染大鼠RBL-2H3細胞的 CD63基因，獲得CD63-GFP融合表達細胞[5]，動態(tài)觀察了細胞內(nèi)的熒光顆粒在IgE介導的I 型超敏反應過程中細胞內(nèi)熒光顆粒的運動過程，但對于非IgE介導的類過敏反應的動態(tài)過程尚有待研究。嗜堿性粒細胞和肥大細胞釋放介質(zhì)的機理不盡相同，例如嗜堿性粒細胞釋放介質(zhì)時，每個介質(zhì)顆粒分別與細胞膜融合，形成各自的出口而被排出，而肥大細胞的大多數(shù)介質(zhì)顆粒先在細胞內(nèi)融合，然后經(jīng)共同的通道排出W]。因此，對細胞表面脫顆粒過程的監(jiān)測能更精確的反應出肥大細胞脫顆粒的進程。^rtSMMitIt (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy, TIRF) 是近年來新興的一種光學成像技術(shù)，是利用光線全反射后在介質(zhì)另一面產(chǎn)生衰逝波的特性，激發(fā)熒光分子以觀察熒光標記樣品的極薄的區(qū)域，觀測的動態(tài)范圍通常在200nm以下。 因為激發(fā)光呈指數(shù)衰減的特性，只有極靠近全反射面的樣本區(qū)域會產(chǎn)生熒光反射，大大降低了背景噪音，因此，此項技術(shù)非常適合觀察細胞表面物質(zhì)的動態(tài)觀察。本發(fā)明用GFP-CD63轉(zhuǎn)染肥大細胞株，使囊泡具有可識別的熒光標識，用TIRF觀察它在表面出現(xiàn)的機率，直接評估藥物刺激肥大細胞脫顆粒的特性，從而為類過敏反應的檢測提供新的檢測手段。實驗結(jié)果表明，在無關(guān)抗原刺激下，細胞呈靜止狀態(tài)，囊泡幾乎靜止不動，在抗原的刺激下，囊泡向膜表面運動，并在細胞表面檢測到瞬間出現(xiàn)的熒光信號，激光共聚焦掃描的結(jié)果與全內(nèi)反射顯微鏡檢測到的結(jié)果一致。本發(fā)明建立了一種通過追蹤肥大細胞內(nèi)囊泡運動狀態(tài)反映其脫顆粒狀況的方法， 并通過實際應用充分說明了本方法的快速、靈敏性及可靠性。該方法克服了傳統(tǒng)方法的不足，可應用于類過敏原的早期快速篩查及鑒定，具有廣泛的應用價值。參考文獻1. 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圖IA左為熒光圖，右為透射圖GFP對照細胞，圖IB左為熒光圖，右為透射圖⑶63-GFP轉(zhuǎn)染細胞圖2compound 48/80刺激后，細胞膜表面TIRF結(jié)果3細胞經(jīng)Compound 48/80刺激后激光共聚焦成像結(jié)果圖4轉(zhuǎn)染細胞加入無關(guān)刺激后TIRF成像結(jié)果圖5無關(guān)刺激后共聚焦觀察細胞內(nèi)部熒光顆粒運動變化
具體實施例方式通過以下具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不作為對本發(fā)明的限制。
具體實施例方式通過以下具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不作為對本發(fā)明的限制。實施例1、測定方法步驟1，將轉(zhuǎn)染了 CD63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(MEM培養(yǎng)液 MEM粉9. 4g，L-谷氨酰胺0. ^2g，NaHCO3 2. 2g加三蒸水1000ml，用時加入10%胎牛血清， 青、鏈霉素10萬單位)，傳代三次后，將細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿(直徑3cm，玻璃底厚度 0. 17 μ m) 37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液(配制方法NaC1400mg，KCl IOOmg, MgCl2 50mg, NaHCO3 500mg, NaH2PO4 32. 5mg, CaCl2IOOg,加蒸餾水至 1000ml,臨用前加葡萄糖 1. Og)， 37 °C 孵育 30min ；步驟3，加入測試藥后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每IOs采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集40min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運動確定過敏物質(zhì)的存在。或者步驟1，將轉(zhuǎn)染了 CD63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(MEM培養(yǎng)液 MEM粉9. 4g，L-谷氨酰胺0. ^2g，NaHCO3 2. 2g加三蒸水1000ml，用時加入10%胎牛血清， 青、鏈霉素10萬單位)，傳代三次后，將細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿(直徑3cm，玻璃底厚度 0. 17 μ m) 37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液(配制方法NaC1400mg，KCl IOOmg, MgCl2 50mg, NaHCO3 500mg, NaH2PO4 32. 5mg, CaCl2 100g，加蒸餾水至 1000ml,臨用前加葡萄糖 1. 0g)， 37 °C 孵育 30min ；步驟3，加入測試藥后移至全內(nèi)反射顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每Is采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集 20min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運動確定過敏物質(zhì)的存在。實施例2、過敏物質(zhì)測定方法步驟1，將轉(zhuǎn)染了 CD63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(MEM培養(yǎng)液 MEM粉9. 4g，L-谷氨酰胺0. ^2g，NaHCO3 2. 2g加三蒸水1000ml，用時加入10%胎牛血清， 青、鏈霉素10萬單位)，傳代三次后，將細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿(直徑3cm，玻璃底厚度 0. 17 μ m) 37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液(配制方法NaC1400mg，KCl IOOmg, MgCl2 50mg, NaHCO3 500mg, NaH2PO4 32. 5mg, CaCl2 100g，加蒸餾水至 1000ml,臨用前加葡萄糖 1. 0g)， 37 °C 孵育 30min ；步驟3，加入待測疑似過敏物質(zhì)后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察。 選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每IOs采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集40min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運動確定過敏物質(zhì)的存在。或者步驟1，將轉(zhuǎn)染了 CD63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(MEM培養(yǎng)液 MEM粉9. 4g，L-谷氨酰胺0. ^2g，NaHCO3 2. 2g加三蒸水1000ml，用時加入10%胎牛血清， 青、鏈霉素10萬單位)，傳代三次后，將細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿(直徑3cm，玻璃底厚度 0. 17 μ m) 37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液(配制方法NaC1400mg，KCl IOOmg, MgCl2 50mg, NaHC03500mg, NaH2PO4 32. 5mg, CaCl2 IOOg,加蒸餾水至 1000ml,臨用前加葡萄糖 1. Og)， 37 °C 孵育 30min ；步驟3，加入疑似待測過敏物質(zhì)后移至全內(nèi)反射顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每Is采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集20min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運動確定過敏物質(zhì)的存在。實施例3、中藥注射劑過敏物質(zhì)測定方法步驟1，將轉(zhuǎn)染了 CD63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(MEM培養(yǎng)液 MEM粉9. 4g，L-谷氨酰胺0. ^2g，NaHCO3 2. 2g加三蒸水1000ml，用時加入10%胎牛血清， 青、鏈霉素10萬單位)，傳代三次后，將細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿(直徑3cm，玻璃底厚度 0. 17 μ m) 37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液(配制方法NaC1400mg，KCl IOOmg, MgCl2 50mg, NaHCO3 500mg, NaH2PO4 32. 5mg, CaCl2 100g，加蒸餾水至 1000ml,臨用前加葡萄糖 1. 0g)， 37 °C 孵育 30min ；步驟3，加入中藥注射劑后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每IOs采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集40min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運動確定過敏物質(zhì)的存在?；蛘卟襟E1，將轉(zhuǎn)染了 CD63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(MEM培養(yǎng)液 MEM粉9. 4g，L-谷氨酰胺0. ^2g，NaHCO3 2. 2g加三蒸水1000ml，用時加入10%胎牛血清， 青、鏈霉素10萬單位)，傳代三次后，將細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿(直徑3cm，玻璃底厚度 0. 17 μ m) 37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液(配制方法NaC1400mg，KCl IOOmg, MgCl2 50mg, NaHCO3 500mg, NaH2PO4 32. 5mg, CaCl2 100g，加蒸餾水至 1000ml,臨用前加葡萄糖 1. 0g)， 37 °C 孵育 30min ；步驟3，加入中藥注射劑后移至全內(nèi)反射顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每Is采圖一張，連續(xù)采集圖像， 共采集20min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運動確定過敏物質(zhì)的存在。
權(quán)利要求
1.一種通過肥大細胞脫顆粒的直接監(jiān)測測定過敏物質(zhì)的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1，轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞和過敏物質(zhì)放到一起培養(yǎng)， 步驟2，用顯微鏡掃描采集培養(yǎng)物的圖像，步驟3，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運動確定過敏物質(zhì)的存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1，轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞放到MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液，孵育；步驟3，加入過敏物質(zhì)用顯微鏡掃描采集圖像，步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運動確定過敏物質(zhì)的存在。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1，將轉(zhuǎn)染了 CD63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞放到MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h ； 步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液，37°C孵育30min ；步驟3，加入過敏物質(zhì)后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每IOs采圖一張，連續(xù)采集圖像， 共采集40min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運動確定過敏物質(zhì)的存在。 或步驟1，將轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞放到MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)Mh ； 步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液，37°C孵育30min ；步驟3，加入過敏物質(zhì)后移至全內(nèi)反射顯微鏡下觀察。選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每Is采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集20min。 步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運動確定過敏物質(zhì)的存在。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的過敏物質(zhì)包括但不限于以下物質(zhì)藥物，花粉，食物，螨蟲，細菌，微生物，植物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的過敏物質(zhì)為藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的過敏物質(zhì)為藥物注射劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的過敏物質(zhì)為中藥注射劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的過敏物質(zhì)為雙黃連注射劑、清開靈注射劑、穿琥寧注射劑、參麥注射劑、魚腥草注射劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟1，將轉(zhuǎn)染了CD63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，傳代三次后，將細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液，37°C孵育30min ；步驟3，加入測試藥后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每IOs采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集40min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運動確定過敏物質(zhì)的存在。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟1，將轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3 細胞用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，傳代三次后，將細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺氏液，37°C孵育30min ；步驟3，加入測試藥后移至全內(nèi)反射顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細胞生長狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每Is采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集 20mino步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運動確定過敏物質(zhì)的存在。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物檢測領(lǐng)域，涉及一種通過肥大細胞脫顆粒的直接監(jiān)測測定過敏物質(zhì)的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1，轉(zhuǎn)染了CD63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細胞和過敏物質(zhì)放到一起培養(yǎng)，步驟2，用顯微鏡掃描采集培養(yǎng)物的圖像，步驟3，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運動確定過敏物質(zhì)的存在。
文檔編號G01N21/84GK102156113SQ201010585029
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者于友華, 侯燕鳴, 張倩, 李連達, 王丹巧, 王毅, 胡劍江, 雷洪濤 申請人:中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心