專利名稱：檢測(cè)蘇丹紅和對(duì)位紅藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種用于檢測(cè)蘇丹紅和對(duì)位紅藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特別適于辣椒醬、辣椒油、飼料樣本中蘇丹紅和對(duì)位紅藥物殘留的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
蘇丹紅(Sudani)屬于人工合成偶氮類化工染料之一，主要用于機(jī)油、蠟和鞋油等工業(yè)產(chǎn)品的染色。國(guó)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，蘇丹紅染料會(huì)導(dǎo)致鼠類患癌，其代謝產(chǎn)物苯胺可直接作用于人體肝細(xì)胞，從而引起中毒性肝病，長(zhǎng)期攝入苯胺可造成人體的神經(jīng)系統(tǒng)損害，為此國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其列為第三類可致癌物質(zhì)。這類物質(zhì)雖缺乏足夠的直接使人類致癌的證據(jù)，但是所具有的潛在致癌危險(xiǎn)是無可置疑的，如果短期內(nèi)大量食用則會(huì)引起死亡。因此世界各國(guó)都禁止將蘇丹紅作為食品生產(chǎn)中的添加劑，1995年歐盟禁止將蘇丹紅作為食用色素在食品中添加，我國(guó)《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB2760-1996)也不允許在食品中添加蘇丹紅。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)食品中蘇丹紅檢測(cè)方法大都采用液相色譜法或液相與質(zhì)譜聯(lián)用的方法進(jìn)行檢測(cè)，但上述幾種檢測(cè)方法所使用的設(shè)備價(jià)格昂貴，檢測(cè)過程繁瑣，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述不足提供一種用于蘇丹紅和對(duì)位紅藥物檢測(cè)的酶聯(lián)免疫試劑盒，其操作簡(jiǎn)單適，適合現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品的篩選。本發(fā)明試劑盒，它含有(1)包被有包被原的酶標(biāo)板(包被原為抗原、抗體或抗抗體)；(2)酶標(biāo)記物(為酶標(biāo)記半抗原、酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗抗體)；(3)蘇丹紅特異性抗體工作液(當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時(shí)含有)；(4)蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復(fù)溶液。本發(fā)明所提供的檢測(cè)蘇丹紅和對(duì)位紅藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括蘇丹紅特異性抗體工作液及預(yù)包被包被原的酶標(biāo)板和酶標(biāo)記物工作液；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記的抗抗體，酶標(biāo)記蘇丹紅半抗原或酶標(biāo)記蘇丹紅特異性抗體；所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體。所述蘇丹紅抗原是由蘇丹紅半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述蘇丹紅抗體是由蘇丹紅抗原制備獲得。
所述蘇丹紅抗原是通過下述步驟得到的1)取對(duì)二氨基聯(lián)苯25mg，加入0. 2mol/L鹽酸4. 5ml溶解，冰??；2)取亞硝酸鈉10-20mg用0. 5ml水溶解后加入(1)中，在冰上攪拌反應(yīng)0. 5-1小時(shí)，取一部分用于下步反應(yīng)，其余分裝-20°C保存；3)取20-100mgBSA用PH9. 0，5ml硼酸緩沖液溶解，制備成BSA溶液；4)取5-20mg β -萘酚用ΡΗ9. 0，5ml硼酸緩沖液溶解，制備成β -萘酚溶液；
5)將BSA溶液和β -萘酚溶液混合后放在冰上，加入l_3ml重氮化的對(duì)二氨基聯(lián)苯溶液，避光反應(yīng)12_24h;6)用PH7. 4，0. 01mol/L的磷酸鹽緩沖液透析三天，每天換液3次，得到蘇丹紅完全抗原。所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選辣根過氧化物酶；酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標(biāo)記酶與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的；酶標(biāo)記蘇丹紅半抗原是采用混合酸酐或碳化二亞胺法將標(biāo)記酶與蘇丹紅半抗原偶聯(lián)得到的；酶標(biāo)記特異性抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標(biāo)記酶與特異性抗體偶聯(lián)得到的，辣根過氧化物酶可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法將其與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)，如戊二醛法，過碘酸鈉法等，本發(fā)明經(jīng)過長(zhǎng)期的勞動(dòng)創(chuàng)造將過碘酸鈉法進(jìn)行了改良，使其省時(shí)、降低辣根過氧化物酶(HRP)與抗抗體的濃度比率，節(jié)省了原材料。所述蘇丹紅特異性抗體可為蘇丹紅單克隆抗體或蘇丹紅多克隆抗體；它們均是用蘇丹紅半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述蘇丹紅多克隆抗體可為鼠源、馬源、兔源抗體，所述蘇丹紅單克隆抗體優(yōu)選為蘇丹紅鼠單克隆抗體，所述蘇丹紅多克隆抗體優(yōu)選為蘇丹紅兔多克隆抗體。以上抗體均可以用蘇丹紅半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原制備。所述載體蛋白可為牛血清蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、甲狀腺蛋白、血藍(lán)蛋白；所述蘇丹紅半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物通過將蘇丹紅半抗原和載體蛋白用重氮化法偶聯(lián)得到。為了更方便現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。所述濃縮洗滌液為pH值為7. 2 7. 6，含有1. 0 3. 0%吐溫_20，0. 02 0. 04%。 硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液。當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液 A液為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為1 2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時(shí)，顯色液為對(duì)硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為1 2mol/L氫氧化鈉溶液。所述濃縮復(fù)溶液為含有pH值為7. 0 7. 4，4_7%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。酶標(biāo)板在制備過程中所用的包被緩沖液優(yōu)選為pH值為9.6，0. lmol/L碳酸鹽緩沖液，所述封閉液為PH值為7. 2 7. 6，含有4 8%酪蛋白，5%奶粉，0. 02 0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明中酶標(biāo)板的制備過程為用包被緩沖液將包被原稀釋成0. 10 0. 20μ g/ ml，每孔加入100 μ 1，37°C溫育2h，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入 150 200 μ 1封閉液，37°C溫育1 池，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。
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蘇丹紅抗體的制備將蘇丹紅半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原。免疫原的具體制備方法蘇丹紅是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性， 不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。因此將對(duì)氨基聯(lián)苯進(jìn)行改造突出分子結(jié)構(gòu)中的特征集團(tuán)，使制備的蘇丹紅抗體檢測(cè)的特異性較高。蘇丹紅鼠單克隆抗體的制備動(dòng)物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以蘇丹紅半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原，得到較好的多抗血清后，取出脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合。細(xì)胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選細(xì)胞株，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。蘇丹紅兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以蘇丹紅半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，多次免疫后測(cè)定血清抗體效價(jià)得到多克隆抗體。本發(fā)明抗抗體的制備過程羊抗鼠抗抗體是以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對(duì)無病菌體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；羊抗兔抗抗體是以羊作為免疫動(dòng)物，以兔源抗體為免疫原對(duì)無病菌體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。 本發(fā)明所述試劑盒中蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，0 μ g/L，0. 5 μ g/L，1. 5 μ g/L， 4. 5 μ g/L, 13. 5 μ g/L, 40. 5 μ g/L。本發(fā)明的檢測(cè)原理為當(dāng)在微孔條上預(yù)包被蘇丹紅偶聯(lián)抗原時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入蘇丹紅特異性抗體溶液，樣本中殘留的蘇丹紅藥物與酶標(biāo)板上包被的蘇丹紅偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)蘇丹紅特異性抗體，加入酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光值與蘇丹紅藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中蘇丹紅的含量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中蘇丹紅含量的濃度范圍。當(dāng)在微孔條上預(yù)包被蘇丹紅特異性抗體時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記蘇丹紅半抗原溶液，樣本中蘇丹紅藥物與酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)包被在酶標(biāo)板上的蘇丹紅特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與蘇丹紅藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中蘇丹紅的含量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中蘇丹紅含量的濃度范圍。當(dāng)在微孔條上預(yù)包被蘇丹紅偶聯(lián)抗原時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記蘇丹紅特異性抗體溶液，樣本中蘇丹紅藥物與酶標(biāo)板上包被的蘇丹紅偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)蘇丹紅特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與蘇丹紅的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中蘇丹紅的含量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中蘇丹紅含量的濃度范圍。當(dāng)在微孔條上預(yù)包被抗抗體時(shí)，加入蘇丹紅抗體孵育后，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記蘇丹紅偶聯(lián)抗原溶液，樣本中的蘇丹紅藥物與酶標(biāo)記蘇丹紅偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)蘇丹紅特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與蘇丹紅藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中蘇丹紅的含量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中蘇丹紅含量的濃度范圍。本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)蘇丹紅藥物的方法，它包括步驟(1)樣品前處理；(2)用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；(3)分析檢測(cè)結(jié)果。樣品的前處理主要是為了從樣品中獲得蘇丹紅溶液，從而用于后續(xù)的檢測(cè)。本發(fā)明中用試劑盒檢測(cè)時(shí)當(dāng)包被原為蘇丹紅偶聯(lián)抗原時(shí)，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入抗體，溫育后洗滌拍干，再加入酶標(biāo)抗抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值；當(dāng)包被原為蘇丹紅偶聯(lián)抗原時(shí)，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入酶標(biāo)記抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值；當(dāng)包被原為蘇丹紅特異性抗體時(shí)，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入酶標(biāo)記蘇丹紅半抗原，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值；當(dāng)包被原為抗抗體時(shí)，向酶標(biāo)板微孔中加入蘇丹紅抗體，溫育后洗滌拍干，再加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液后加入酶標(biāo)蘇丹紅半抗原，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。本發(fā)明中檢測(cè)結(jié)果分析過程為用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(Btl)再乘以100%，即百分吸光度值。計(jì)算公式為百分吸光度值(％) = (B/B0) X 100%以蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(μ g/L)的半對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本中蘇丹紅的含量。本發(fā)明中檢測(cè)結(jié)果的分析也可以采用回歸方程法，計(jì)算出樣品溶液濃度。本發(fā)明中檢測(cè)結(jié)果的分析還可以利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析。本發(fā)明檢測(cè)的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定性或定量檢測(cè)樣品中蘇丹紅的含量；對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批量樣品；采用高特異性的蘇丹紅單克隆抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、價(jià)格便宜、攜帶便利、檢測(cè)方法高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、適于大批量樣品篩選的定性、定量。本發(fā)明的試劑盒將在蘇丹紅的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。


圖1 蘇丹紅抗原合成技術(shù)路線；圖2 標(biāo)準(zhǔn)品蘇丹紅濃度。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。CN 102539762 A
實(shí)施例1試劑盒組分的制備1.免疫原的合成將蘇丹紅半抗原與牛血清白蛋白采用重氮化法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。免疫原制備過程1)取對(duì)二氨基聯(lián)苯25mg，加入0. 2mol/L鹽酸4. 5ml溶解，冰浴；2)取亞硝酸鈉10_20mg用0. 5ml水溶解后加入(1)中，在冰上攪拌反應(yīng)0. 5-1小時(shí)，取一部分用于下步反應(yīng)，其余分裝-20°C保存；3)取20-100mgBSA用PH9. 0，5ml硼酸緩沖液溶解，制備成BSA溶液；4)取5_20mg β -萘酚用ΡΗ9. 0，5ml硼酸緩沖液溶解，制備成β -萘酚溶液；5)將BSA溶液和β -萘酚溶液混合后放在冰上，加入l_3ml重氮化的對(duì)二氨基聯(lián)苯溶液，避光反應(yīng)12_24h;6)用PH7. 4，0. 01mol/L的磷酸鹽緩沖液透析三天，每天換液3次，得到免疫原。將蘇丹紅半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)得到包被原。包被原的制備過程1)取對(duì)二氨基聯(lián)苯25mg，加入0. 2mol/L鹽酸4. 5ml溶解，冰??；2)取亞硝酸鈉10_20mg用0. 5ml水溶解后加入(1)中，在冰上攪拌反應(yīng)0. 5-1小時(shí)，取一部分用于下步反應(yīng)，其余分裝-20°C保存；3)取20-100mg0VA用PH9. 0，5ml硼酸緩沖液溶解，制備成BSA溶液；4)取5_20mg β -萘酚用ΡΗ9. 0，5ml硼酸緩沖液溶解，制備成β -萘酚溶液；5)將OVA溶液和β -萘酚溶液混合后放在冰上，加入l_3ml重氮化的對(duì)二氨基聯(lián)苯溶液，避光反應(yīng)12_24h;6)用PH7. 4，0. 01mol/L的磷酸鹽緩沖液透析三天，每天換液3次，得到免疫原。單克隆抗體的制備a.動(dòng)物免疫將免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為100 μ g/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體血清。b.細(xì)胞融合和克隆化小鼠血清測(cè)定結(jié)果較高后，取其脾細(xì)胞，按7 1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合， 采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽性孔進(jìn)行克隆化， 直到得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。蘇丹紅的單克隆雜交瘤細(xì)胞株可以無限量的產(chǎn)生蘇丹紅特異性抗體，靈敏度能達(dá)到 0. 5μ g/L。c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將蘇丹紅的單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成IX IO6個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。d.單克隆抗體的生產(chǎn)與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0. 5ml/只，7天后腹腔注射蘇丹紅的單克隆雜交瘤細(xì)胞株5X IO7個(gè)/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，-200C保存。2.多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以蘇丹紅與牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1. 5mg/kg，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3 4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次， 共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫10天后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)，心臟采血， 用硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。3.羊抗鼠抗抗體的制備過程以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對(duì)無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；羊抗兔抗抗體的制備以羊作為免疫動(dòng)物，以兔源抗體為免疫原對(duì)無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。4.酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將蘇丹紅偶聯(lián)抗原稀釋成0. 20 μ g/ml，每孔加入100 μ 1，37°C溫育 2h，傾去包被液，用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌2次，每次30秒，拍干，然后再每孔中加入 200 μ 1封閉液，37°C溫育池，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。5.酶標(biāo)記羊抗鼠抗抗體的置備將抗抗體與辣根過氧化物酶(HRP)采用改良后的過碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)。傳統(tǒng)的過碘酸鈉法要求反映體系中酶與抗抗體的摩爾濃度比為4 1 ；由于辣根過氧化物酶在強(qiáng)氧化的作用下產(chǎn)生許多與抗抗體結(jié)合的位點(diǎn)，這樣活化的辣根過氧化物酶分子充當(dāng)了連接各分子的橋梁，降低了酶標(biāo)記物的酶活性，使制備的偶聯(lián)物中混有許多聚合體，為了解決這個(gè)問題，我們將傳統(tǒng)的方法進(jìn)行了改良，BP 1)省去了氨基的封閉過程，因?yàn)槟墚a(chǎn)生自身氨基連接的氨基實(shí)際很少。2)降低了辣根過氧化物酶抗抗體的摩爾濃度比率至2 1，改良后的方法比傳統(tǒng)的方法簡(jiǎn)便，對(duì)酶的活性的損失減少。實(shí)施例2檢測(cè)蘇丹紅的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測(cè)蘇丹紅的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被蘇丹紅偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板；(2)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體；(3)蘇丹紅單克隆抗體工作液；(4)蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0μ g/L、0. 5μ g/L、l. 5μ g/L、4. 5μ g/L、 13. 5μ g/L、40. 5μ g/L ；(5)底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺；(6)終止液為2mol/L硫酸；(7)濃縮洗滌液為pH值為7. 2 7. 6，含有1. 0% 3. 0%吐溫-20，0. 02 0. 04% 硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液；(8)濃縮復(fù)溶液為含有pH值為7. 0 7. 4，4_7%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。實(shí)施例3樣品中蘇丹紅的檢測(cè)1.樣品前處理a)辣椒醬
稱取勻質(zhì)樣本3 士0. 05g于離心管中，加入6ml乙腈，渦旋30s，，室溫4000rpm離心 3min ；移取2ml上清液于50°C環(huán)境下氮?dú)獯蹈?；加入Iml 2mol/L氫氧化鈉溶液，渦動(dòng)30s ； 加入2ml正己烷渦動(dòng)IOs溶解殘留物；室溫4000rpm離心;3min ；移取Iml上清液于50°C環(huán)境下氮?dú)獯蹈?；加?. 5ml DMF充分溶解殘留物；取50 μ 1加入950 μ 1復(fù)溶液混勻；取50 μ 1 用于分析。b)辣椒油、飼料樣本稱取1 士0. 05g樣品于離心管中，加入aiil 2mol/L氫氧化鈉，加入8ml乙腈，渦旋 30s，，3800rpm離心3min ；吸取Iml上層清液，加入1. 5ml水，混勻，C18柱凈化(將固相萃取裝置連接循環(huán)水式真空泵加壓過柱15滴/分)，洗脫液于50°C環(huán)境下氮?dú)獯蹈?；加?200 μ LDMF溶解殘留物，移取50 μ 1加入950 μ 1復(fù)溶液混勻；取50 μ 1用于分析。C18柱凈化步驟a、加入6ml甲醇活化柱子，待甲醇流干(加壓過柱15滴/分)；b、加3ml水平衡，待水流干(加壓過柱15滴/分)；C、上樣，待樣品液流干(加壓過柱15滴/分)；d、加入5ml 40%乙腈-水淋洗(加壓過柱15滴/分)；e、加入2ml90%乙腈-水洗脫，收集洗脫液。2.用試劑盒檢測(cè)向包被有蘇丹紅偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板微孔中加入蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液 50 μ 1，再加入蘇丹紅單克隆抗體工作液50 μ 1，用蓋板模封板，25°C恒溫箱中反應(yīng)30min， 倒出孔內(nèi)液體，每孔加入250 μ 1洗滌液，30s后倒出孔內(nèi)液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液100μ 1，25°C恒溫箱中反應(yīng) 30min,倒出孔內(nèi)液體，重復(fù)洗板步驟，每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，輕輕振蕩混勻，25°C恒溫箱避光顯色15min，每孔加入2mol/L終止液硫酸50μ 1，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)定在450nm處，測(cè)定每孔吸光度值(0D值)。3.檢測(cè)結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。以蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品濃度(yg/ L)的半對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出蘇丹紅的含量。實(shí)驗(yàn)例1標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗(yàn)分別從三個(gè)不同的時(shí)間段制備的酶標(biāo)板中各抽出一批酶標(biāo)板，每批各抽取10個(gè)試劑盒，每板各抽出20個(gè)微孔，測(cè)定4. 5 μ g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，計(jì)算變異系數(shù)。表1標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)(CV % )
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)蘇丹紅和對(duì)位紅藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于它含有(1)包被有包被原的酶標(biāo)板；(2)酶標(biāo)記物；(3)蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(4)底物顯色液；(5)終止液；(6)濃縮洗滌液；(7)濃縮復(fù)溶液，所述包被原為蘇丹紅抗原、抗體或抗抗體，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記蘇丹紅抗原、酶標(biāo)記蘇丹紅抗體或酶標(biāo)記抗抗體，當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時(shí)還含有蘇丹紅特異性抗體工作液。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述蘇丹紅抗原是由蘇丹紅半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述蘇丹紅抗體是由所述抗原制備獲得。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，所述蘇丹紅抗原是通過下述步驟得到的1)取對(duì)二氨基聯(lián)苯25mg，加入0.2mol/L鹽酸4. 5ml溶解，冰浴；2)取亞硝酸鈉10-20mg用0.5ml水溶解后加入(1)中，在冰上攪拌反應(yīng)0. 5-1小時(shí)，取一部分用于下步反應(yīng)，其余分裝-20°C保存；3)取20-100mg載體蛋白用PH9.0，5ml硼酸緩沖液溶解，制備成BSA溶液；4)取5-20mgβ -萘酚用ΡΗ9. 0，5ml硼酸緩沖液溶解，制備成β -萘酚溶液；5)將載體蛋白溶液和β-萘酚溶液混合后放在冰上，加入l_3ml重氮化的對(duì)二氨基聯(lián)苯溶液，避光反應(yīng)12_24h;6)用PH7.4,0. 01mol/L的磷酸鹽緩沖液透析三天，每天換液3次，得到蘇丹紅抗原。
4.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述蘇丹紅抗體為單克隆抗體。
5.如權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于所述載體蛋白為牛血清蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、甲狀腺蛋白、血藍(lán)蛋白。
6.如權(quán)利要求書1或2所述的試劑盒，其特征在于所述包被緩沖液為pH值為9.6， 0. lmol/L碳酸鹽緩沖液，所述封閉液為pH值為7. 2 7. 6，含有4 8%酪蛋白，5%奶粉， 0. 02 0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液。
7.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶，當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為1 2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶時(shí)，底物顯色液為對(duì)硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為1 2mol/L氫氧化鈉。
8.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于濃縮洗滌液為pH值為7.2 7. 6，含有1. 0% 3. 0%吐溫-20，0. 02 0. 04%。硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液；濃縮復(fù)溶液為含有PH值為7. 0 7. 4，4-7%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度分別為 0 μ g/L, 0· 5 μ g/L, 1· 5 μ g/L, 4. 5 μ g/L, 13. 5 μ g/L, 40. 5 μ g/L。
9.權(quán)利要求1 8任一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測(cè)蘇丹紅藥物殘留中的應(yīng)用。
10. 一種檢測(cè)樣品蘇丹紅藥物殘留的方法，包括步驟1)樣品前處理；2)用權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；3)分析檢測(cè)結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)蘇丹紅和對(duì)位紅藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有包被有包被原的酶標(biāo)板，酶標(biāo)記物，蘇丹紅特異性抗體工作液(當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時(shí)含有)，蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液，底物顯色液，終止液，濃縮洗滌液，濃縮復(fù)溶液。本發(fā)明還公開了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)蘇丹紅和對(duì)位紅的方法，它包括首先進(jìn)行樣品前處理，然后用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，最后分析檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明提供的酶聯(lián)免疫試劑盒可用于檢測(cè)辣椒醬、辣椒油、飼料等樣品中蘇丹紅和對(duì)位紅的含量，其操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控且適合大量樣本的篩查。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102539762SQ20101058816
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月7日
發(fā)明者何麗霞, 余厚美, 馮靜, 扶勝, 段盈盈, 汪善良 申請(qǐng)人:北京望爾生物技術(shù)有限公司