專利名稱：Caco-2細胞表面特異性結(jié)合的多肽及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及篩選血管特異性結(jié)合肽，特別是一種Caco-2細胞 表面特異性結(jié)合的多肽及其篩選方法。
背景技術(shù)：
結(jié)直腸癌(colorectal cancer)是消化道常見惡性腫瘤之一，隨著經(jīng)濟發(fā)展和人 民生活水平的不斷提高、生活環(huán)境、生活方式及膳食結(jié)構(gòu)的改變，發(fā)病率近年來有迅猛增高 的趨勢，在西方發(fā)達國家，如美國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率居第四位，在惡性腫瘤死亡原因中居 第二位，僅次于肺癌的死亡率，在初診患者中中晚期癌占大多數(shù)，部分病人由于臨床癥狀不 明顯或較晚發(fā)現(xiàn)而致延誤治療，成為威脅人類生命和健康不容忽視的疾病。結(jié)腸癌的診斷 及外科治療已取得了長足進步，但早期結(jié)腸癌的檢出率仍較低而死亡率仍較高，要提高結(jié) 腸癌術(shù)后生存率和降低死亡率的關(guān)鍵就在于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療。噬菌體展示技術(shù)(Phage Display Technology)是一項特異性多肽或蛋白的篩選 技術(shù)，1985年由美國Missouri大學G. P. Smith等首創(chuàng)，此技術(shù)可將目的基因編碼的多肽以 融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和 生物活性，使大量隨機多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使得各種靶分子(如抗 體、酶和細胞表面受體等)的多肽配體通過體外親和淘選程序得以快速鑒定。噬菌體展示 技術(shù)已被廣泛用于腫瘤診斷標志物和抗腫瘤先導化合物的篩選、腫瘤特異性抗體和腫瘤藥 物靶向運輸?shù)确矫娴难芯?。噬菌體展示技術(shù)正逐步發(fā)展成熟，為獲取對癌癥診斷和治療有價值的多肽或抗體 提供了重要手段。目前已發(fā)現(xiàn)多種與腫瘤相關(guān)的基因和抗原，腫瘤相關(guān)配體和多肽的篩選 已成為尋找抗腫瘤藥物的新熱點，針對腫瘤細胞不同表達分子的特異性結(jié)合多肽，為腫瘤 治療提供了新的靶點，也為放射標記的腫瘤檢測、化療藥物的給藥、藥物敏感實驗及腫瘤的 免疫治療提供了新的分子靶位，噬菌體多肽還具有抑制腫瘤相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄、阻礙腫瘤新生 血管生成和轉(zhuǎn)移及誘導腫瘤細胞凋亡等作用，將多肽與脂質(zhì)體或納米藥物偶聯(lián)，既有助于 在達到更好的靶向治療效果，又減小了藥物的毒副作用，還可用于腫瘤血管三維成像和分 子影像技術(shù)的檢測及腫瘤治療療效評價。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種Caco-2細胞表面特異性結(jié)合的多肽及其篩選方法， 該方法利用噬菌體展示隨機十二肽庫篩選出能夠和人結(jié)直腸癌Caco-2細胞株結(jié)合的十二 肽，并鑒定它們與結(jié)腸癌細胞的親和力和特異性，分析氨基酸序列組成，尋找能夠和結(jié)腸癌 細胞特異性結(jié)合的配體，分析這些蛋白與細胞結(jié)合的氨基酸決定簇位點，為研究噬菌體展 示多肽在腫瘤早期診斷和靶向藥物等研究方面提供實驗依據(jù)。為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案Caco-2細胞表面特異性結(jié)合的多肽，其特征在于，利用噬菌體展示隨機十二肽庫篩選得到4條多肽片段，其氨基酸序列分別為SPSIDTRYSRLG，CVSVGMKPSPRP， SVSVGMKPSPRP 和 MVSMDSSPRDRL。4條多肽均為親水性多肽，富含絲氨酸、脯氨酸、精氨酸、纈氨酸和天冬氨酸。4條 多肽片段的氨基酸序列具有一定的同源性，含有共有序列XXSXXXXXXXRXX ；4條多肽片段能夠特異性結(jié)合Caco-2細胞，而不識別人胚腎HEK293細胞。所述的Caco-2細胞表面特異性結(jié)合的多肽的篩選方法，其特征在于，該方法利 用噬菌體隨機十二肽庫，以體外培養(yǎng)的結(jié)直腸癌Caco-2細胞系為靶細胞，以人胚腎細胞 HEK293細胞系為吸附細胞，進行4輪全細胞消減篩選，隨機挑取30個噬菌體克隆擴增并滴 定，利用酶聯(lián)免疫吸附實驗鑒定陽性克隆，比較陽性克隆與Caco-2細胞的親和力，排除假 陽性克隆，提取陽性噬菌體克隆單鏈DNA測序，分析多肽的氨基酸序列的基本特征，多肽同 源性比較，檢索出現(xiàn)頻率高的多肽基序，BLAST檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，檢測多肽基序同源性較 高的蛋白質(zhì)，及可能結(jié)合的細胞表面受體和配體；細胞免疫熒光法檢測噬菌體多肽克隆的 靶向性，進一步鑒定陽性克隆的特異性。本發(fā)明利用噬菌體多肽展示技術(shù)篩選結(jié)直腸癌Caco-2細胞結(jié)合的多肽序列， ELISA鑒定噬菌體克隆與結(jié)直腸癌細胞的親和力，獲得10個噬菌體克隆，測序獲得4條多肽 序列，其共有氨基酸序列為XXSXXXXXXXRXX，同源性分析表明多肽基序可能為腫瘤細胞表面 受體結(jié)合的配體蛋白上的氨基酸決定簇，細胞免疫熒光進一步鑒定噬菌體陽性克隆的靶向 性結(jié)果提示噬菌體陽性克隆能夠特異性結(jié)合Caco-2細胞，篩選獲得的結(jié)腸癌Caco-2細胞 特異性多肽為結(jié)直腸癌的早期診斷、抗腫瘤藥物的靶向運輸及靶向短肽藥物的研發(fā)提供初 步的實驗依據(jù)。


圖1是本發(fā)明的具體技術(shù)路線圖；圖2是隨機十二肽pill融合蛋白的N末端序列；圖3是精簡遺傳密碼表；圖4是10個噬菌體陽性克隆與Caco-2細胞親和力的ELISA鑒定；圖5A、B、C、D分別是四條噬菌體多肽的氨基酸疏水性圖；圖6A X分別是噬菌體陽性克隆靶向Caco-2細胞的免疫熒光檢測(X200)圖， 其中A，B，C，D:Caco-2 cells(A and B) and HEK293 cells(C and D)incubated with Q23 positive clone thatdisplays CCSPl peptide under the light microscope and the fluorescent microscope ；Ε, F, G, H :Caco-2 cells(E and F)and HEK293 cells(G and H)incubated with Q24 positive clone thatdisplays CCSP2 peptide under the light microscope and the fluorescent microscope ；I, J, K, L :Caco-2 cells(I and J)and HEK293 cells(K and L) incubated with Q29 positive clone thatdisplays CCSP3 peptide under the light microscope and the fluorescent microscope ；Μ, N, 0， P Caco-2 cells(Μ and N)and HEK293 cells(0 and P)incubated withQ28 positive clone thatdisplays CCSP4 peptide under the light microscope and the fluorescent microscope ；Q, R, S, T :Caco-2cells(Q and R)and HEK293(S and T)cells incubated with unrelated phages under thelight microscope and the fluorescent microscope ；U, V, W, X :Caco-2cells(U and V)and HEK293 cells(W and X)incubated with PBS under the lightmicroscope and the fluorescent microscope.以下結(jié)合附圖和實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式一、技術(shù)路線本發(fā)明采用噬菌體多肽展示技術(shù)，以人結(jié)腸癌Caco-2細胞系為靶細胞，以人胚腎 HEK293細胞為陰性吸附細胞進行4輪消減篩選，從噬菌體12肽庫中篩選能特異性結(jié)合結(jié)腸 癌Caco-2細胞的多肽基序，檢索其可能識別的細胞表面受體，為結(jié)直腸癌早期診斷和靶向 治療的進一步研究提供良好的實驗依據(jù)，具體技術(shù)路線如圖1所示。二、材料與方法2. 1主要實驗材料2. 11細胞、噬菌體多肽庫、宿主菌(1)細胞株人結(jié)直腸癌細胞株Caco-2，人胚腎細胞株HEK293，購于美國 ATCC(Rockville，美國)。 (2)噬菌體肽庫隨機十二肽噬菌體展示文庫(Ph. D. -12TM Phage Display Peptide Library Kit)購自 New England Biolabs，USA，滴度 1· 5X 1013pfu/ml，貯存于含 50%甘油的TBS溶液中。復雜度 2. 7X109個轉(zhuǎn)化子，于M13噬菌體cPIII蛋白的Kpn-I 和Eag-I位點之間插入外源序列。_96gIII測序引物序列為5，-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3，。(3)宿主菌大腸桿菌 E. coli ER2738 :F，Iaclq Δ (IacZ) M15proA+B+zzf:TnlO(TetR)/fhuA2supEthi Δ (lac-proAB) Δ (hsdMS-mcrB) 5 (rk-mk-McrBC-)。該菌株以含50%甘油的菌體培養(yǎng)物形式貯存于_80°C 非感受態(tài)細胞，購自New England Biolabs, USA02. 1.2主要試劑及耗材(1) RPMI 1640 培養(yǎng)基購自 Gibco 公司。(2) DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。(3)胎牛血清購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司。(4)青霉素、鏈霉素、慶大霉素及胰蛋白酶購自Amresco公司。(5) DMS0、臺盼藍購自Sigma公司。(6)PEG8000 購自北京索萊寶科技有限公司。(7) IPTG、BSA 購自西安沃爾森生物技術(shù)有限公司。(8) Xgal> DMF> NaN3>Tween-20> Agar 03 g Amresco 公司。(9) D-Glucose 購自上海生工生物工程公司。(lO)Bacto-Tryptone、酵母提取物購自 0X0ID，England。
(Il)Agarose 購自美國 Invitrogen 公司。(12)山羊抗 M13 多克隆抗體購自 Santa Cruz Biotechnology, Inc 公司。(13)辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗山羊IgG 購自北京博奧森生物技術(shù)有限 公司。(14)多聚甲醛購自Sigma公司。(15) TMB 購自 Boston Biomedica, Inc. (BBI)公司。(16)FITC標記兔抗山羊IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。(17)常規(guī)生物化學試劑購自西安沃爾森生物技術(shù)有限公司。2. 1.3主要試劑的配制(1)四環(huán)素貯液以20mg/ml的濃度溶于無水乙醇中，封裝至1. 5ml無菌離心管 中，Iml/管，_40°C避光保存，用前混勻。(2)5XM9 鹽溶液稱取 Na2HP04 · 12H20 42. 74g, KH2P047. 5g, NaCl 1. 25g, NH4C12. 5g，溶于400ml三蒸水中，磁力攪拌至完全溶解，三蒸水定容至500ml，高壓蒸汽滅
菌，室溫保存。(3)20% Glucose 稱取 20g Glucose，溶于 100ml 三蒸水，用 0.22 μ m 過濾器過濾
除菌，4 °C貯存。(4)含四環(huán)素抗性的1XM9基本培養(yǎng)基取5 XM9鹽溶液100ml，稱取瓊脂粉7. 5g， 調(diào)節(jié)pH至7. 0，三蒸水定容至500ml，高壓蒸汽滅菌，冷卻至低于70°C時，加入無菌的20% Glucose 10ml，及四環(huán)素貯液625μ 1(終濃度50μ g/ml)，混勻倒平板。平板4°C避光保存。(5)含四環(huán)素抗性的LB medium (pH 7.4)稱取胰蛋白胨5g，酵母提取物2. 5g， NaCl 2. 5g，溶解于400ml三蒸水中，磁力攪拌至完全溶解。用IM的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 0， 三蒸水定容至500ml。高壓蒸汽滅菌30min，冷卻至低于50°C時，加入四環(huán)素貯液1. 25ml (終 濃度50 μ g/ml)，4°C避光保存。(6) TBS :50mM Tris-HCl (pH7. 5), 150mM NaCl，高壓滅菌，室溫保存。(7)PEG/NaCl 20% (w/v)PEG8000, 2. 5M NaCl，高壓滅菌，室溫保存。(8) IPTG/Xgal 將 1. 25g IPTG 和 Ig Xgal 溶于 25ml DMF 中，充分混勻，錫箔紙包 裹，-20°C保存。(9) LB/IPTG/Xgal 平板IL LB medium,加入 15g 瓊脂粉，高壓滅菌 30min，室溫冷 卻至低于70°C時，加入Iml IPTG/Xgal，混勻倒平板。平板4°C避光保存。(10)頂層瓊月旨糖(Top Agarose)稱取 Bacto-Tryptone :lg，yeast extract 0. 5g, NaCl 0. 5g, MgCl · 6H20 :0. lg, Agarose :0. 7g,高壓滅菌 30min,封裝至無菌 50ml 離 心管中，室溫保存，用時微波爐融化。(Il)PBS 磷酸鹽緩沖液稱取 NaCl 8g，KCl 0. 2g，Na2HP04 · 12H20 :1· 44g，KH2PO4 0. 24g，溶于900ml三蒸水中，磁力攪拌充分溶解，用10N HCl調(diào)節(jié)pH值至7. 4，三蒸水定容
至1L。高壓滅菌，室溫保存。(12)Blocking buffer 3% BSA 溶于 PBS(ρΗ7· 4)，0. 22 μ m 濾器過濾除菌，4°C保存。(13) TBST :50mM Tris—HCl (pH7. 5)，150mMNaCl，不同濃度(ν/ν)的 Tween-20 (0. 1%,0. 2%,0. 3%,0. 5% )，高壓滅菌，室溫保存。
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(H)RPMI 1640完全培養(yǎng)基取RPMI 1640培養(yǎng)基干粉3包，溶于2L超純?nèi)羲?并用三蒸水清洗包裝袋2 3次(洗液一并加入培養(yǎng)基中)，加入NaHC03 :6g，F(xiàn)BS :300ml, 抗生素各30ml (青霉素/鏈霉素終濃度為100U/ml，慶大霉素終濃度為100 μ g/ml)，磁力攪 拌至完全溶解，ION HCl調(diào)節(jié)pH值至7. 2左右(過濾后pH值會升高0. 2 0. 3)，超純?nèi)?水定容至3L。0. 22 μ m過濾器過濾除菌，分裝于500ml滅菌試劑瓶，4°C保存。(15) DMEM完全培養(yǎng)基取DMEM培養(yǎng)基干粉3包，溶于2L超純?nèi)羲?，并用三蒸?清洗包裝袋2 3次(洗液一并加入培養(yǎng)基中)，加入NaHC037. 2g，F(xiàn)BS 300ml，抗生素各 30ml (青霉素/鏈霉素終濃度為100U/ml，慶大霉素終濃度為100 μ g/ml)，磁力攪拌至完全 溶解，ION HCl調(diào)節(jié)pH值至7. 2左右，超純?nèi)羲ㄈ葜?L。0. 22 μ m過濾器過濾除菌，分 裝于500ml滅菌試劑瓶，4°C保存。(16)0. 25% Trypsin-O. 02% EDTA 稱取 0. 25g胰蛋白酶 Trypsin 粉劑，溶于 IOOml 0. IMPBS中，加入IM EDTA 54 μ 1，磁棒慢速攪拌5 6小時，0. 22 μ m過濾器過濾除菌，4°C保存。(17)4%臺盼藍母液稱取4g臺盼藍，加入少量三蒸水研磨，加三蒸水定容至 100ml，用濾紙過濾，4°C保存，使用時用PBS稀釋母液至0. 4%使用液。(18) 4%多聚甲醛固定液稱取4g多聚甲醛粉末，溶于100ml PBS (pH7. 2)，磁力攪 拌溶解，稍許加熱至60°C，加入幾滴IM NaOH助溶完全，0. 22 μ m濾器過濾，4°C保存。(19)TMB底物貯液稱取IOmg TMB粉末，溶于5ml DMSO中，錫箔紙包裹，4°C保存。(20) TMB 底物緩沖液(ρΗ5· 5)溶液 A 檸檬酸(C6H807 · Η20) 0. lmol/L ；溶 液B 磷酸氫二鈉(Na2HP04 · 12H20) 0. 2mol/L ；將溶液Α、溶液B和三蒸水按體積比 24.3 25. 7 50的比例混合，高壓滅菌，4°C保存。(21) TMB工作液依次取TMB底物緩沖液9. 5ml,0. 75% H202 42 μ 1，TMB底物貯液 0. 5ml，于IOml滅菌離心管中充分混勻，避光操作，現(xiàn)用現(xiàn)配。(22)顯色終止液2M H2S04。(23)碘化物緩沖液:10mM Tris-HCl (pH 8. 0)，ImM EDTA，4M NaI。室溫避光保存。2. 2實驗方法2. 2. 1細胞培養(yǎng)2. 2. 1. 1 細胞復蘇用酒精棉球擦拭超凈工作臺臺面，紫外線照射30min以上，37 °C水浴預(yù)熱 RPMI1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基，從液氮罐中取出凍存的Caco-2細胞凍存管，迅速將凍存 管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。約1 2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，移入超凈臺內(nèi)，無菌條件下 將細胞懸液轉(zhuǎn)入IOml離心管中，加入5ml RPMI1640培養(yǎng)基，用托架天平平衡后800rpm低 速離心3min，棄上清。加入RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞，轉(zhuǎn)入10cm2培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶移 至37°C、飽和濕度、5% C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。重復同樣操作復蘇HEK293細胞。2. 2. 1. 2細胞傳代培養(yǎng)次日更換培養(yǎng)液一次，待細胞長至90 %融合時，小心吸棄去舊培養(yǎng)基，用預(yù)熱的 PBS輕輕洗滌細胞，加入適量胰蛋白酶消化液37°C消化3 5min，倒置顯微鏡下觀察，待細 胞胞質(zhì)回縮變圓、細胞不再粘連成片時，吸棄消化液，加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基，用滴管輕柔吹打已消化細胞成細胞懸液，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至IOml離心管，平衡后將離心管放入 臺式離心機，800rpm，離心5min，小心吸棄上清，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細胞懸 液，封裝于2 3個培養(yǎng)瓶，補足培養(yǎng)基后旋緊瓶蓋。倒置顯微鏡下觀察細胞數(shù)量，傳代細 胞密度不應(yīng)少于lX105cellS/ml，置于37°C、飽和濕度、5% C02孵箱，擰松瓶蓋培養(yǎng)。2 3日待細胞鋪滿瓶底繼續(xù)傳代。2. 2. 1.3 細胞凍存凍存前24h進行細胞換液，取培養(yǎng)2 3天對數(shù)生長期的細胞，按細胞傳代方法收 集細胞并計數(shù)，以1 5X 106cells/ml細胞濃度懸浮于含10% DMSO的RPMI 1640完全培 養(yǎng)基中，輕輕反復吹打均勻，Iml/管分裝于凍存管中，置于凍存杯中室溫放置2h，于-80°C 超低溫冰箱中過夜，次日置于液氮罐中長期保存并做好凍存記錄。2. 2. 2 宿主菌 E. coli ER2738 的活化(1)復蘇取250 μ 1 LB-Tet液體培養(yǎng)基于1. 5ml無菌離心管中，以無菌技術(shù)從 E. coliER2738的甘油凍存物中取出2 3 μ 1菌液與之充分混勻，滴加至M9_Tet平板，用滅 菌玻璃珠涂布2 3min，倒出玻璃珠，平板室溫放置5min，標記后置于37°C細菌培養(yǎng)箱倒置 培養(yǎng)過夜。次日長出克隆后封口膜封口，4°C避光保存?zhèn)溆谩?2)培養(yǎng)取3ml LB-Tet液體培養(yǎng)基置于IOml滅菌離心管中，用無菌槍頭以無 菌技術(shù)挑取單克隆置于其中，標記后置于恒溫搖床37°C，300rpm振蕩培養(yǎng)過夜。細菌擴 增液于4°C保存?zhèn)溆茫∫还芗毦c滅菌甘油1 1混合，分裝于1.5ml無菌離心管，每管 lml, -80°C超低溫冰箱保存。2. 2. 3噬菌體展示十二肽庫的消減篩選以人胚腎HEK293細胞為陰性吸附細胞，結(jié)腸癌Caco-2細胞為靶細胞，參照隨 機十二肽噬菌體展示文庫(Ph. D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit)使用 說明書，優(yōu)化改良篩選方法，進行4輪消減篩選，保持每一輪篩選投入噬菌體量不少于 1. 5 X 1010PFU。第一輪篩選程序如下(1)細胞準備將生長狀態(tài)良好的人結(jié)腸癌細胞Caco-2和人胚腎HEK293細胞，分 別傳代，接種于10cm2細胞培養(yǎng)瓶，置于37°C、飽和濕度、5% C02孵箱培養(yǎng)24h后換液，培養(yǎng) 至細胞貼壁，生長狀態(tài)良好，待融合度為90%以上，匯合成單層細胞時進行篩選。(2)細菌活化將過夜振蕩培養(yǎng)的ER2738以1 100稀釋于20ml LB-Tet液體培 養(yǎng)基中，370C，225rpm,緩慢振搖2 3h至對數(shù)前期，于紫外分光光度計上測0D600 0. 5。(3)封閉取融合度為90%以上的HEK293細胞，吸棄培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌 兩次，加無血清培養(yǎng)基，37°C、5% C02培養(yǎng)lh，吸去培養(yǎng)液，加入Blocking buffer (3% BSA+PBS)，37°C封閉2h ；重復同樣操作，封閉結(jié)腸癌細胞Caco-2細胞。(4)洗滌吸棄封閉液，用0. 1 % TBST輕柔地洗滌6次，操作要避免細胞脫落。(5)陰性細胞吸附將10μ1噬菌體庫(第2輪至第4輪篩選取擴增庫 1. 5X1010PFU)與lml TBS混合，與ΗΕΚ293細胞孵育，37°C，孵育lh，孵育期間每隔15min 放脫色搖床上微搖。(6)取上清用吸管緩慢吸取上清，轉(zhuǎn)移至2ml滅菌離心管，lOOOrpm，離心5min，轉(zhuǎn)
移上清至新離心管，再離心一次以去除上清中可能含有的細胞。(7)結(jié)合迅速將上清與已封閉、洗滌好的結(jié)腸癌Caco-2細胞孵育，37°C，孵育2h。
(8)洗滌小心吸棄上清，消化收集細胞于離心管，IOOOrpm,離心5min，吸棄上清， 用0. 1 % TBST反復吹打洗滌Caco-2細胞20次，IOOOrpm,離心5min，重復洗滌4次，棄盡上 清獲得細胞沉淀，用無菌濾紙條吸盡剩余液滴。(9)擴增將細胞沉淀加入已搖至對數(shù)前期的ER2738菌液中，置于恒溫搖床， 370C，225rpm,振蕩培養(yǎng) 4. 5h。(10)噬菌體純化①將噬菌體擴增菌液分裝于滅菌的1.5ml離心管，每管1ml，13000rpm，離心 IOmin,上清轉(zhuǎn)入新離心管中，再離心，取上清上部80%轉(zhuǎn)入新離心管中。②加入1/6體積的PEG/NaCl (167 μ 1/tube)，反復vertex混勻，4°C沉淀噬菌體過夜。③次日，4°C，13000rpm，離心過夜沉淀物15min。④倒掉上清，再次短暫離心，用微量移液器吸盡殘留上清液。⑤每管加入1ml TBS重懸沉淀，反復vertex混勻，懸液轉(zhuǎn)移至滅菌1.5ml離心管 中，4°C，13000rpm，離心5min，以去除殘余細胞。⑥上清轉(zhuǎn)入另一無菌微量離心管中，用l/6PEG/NaCl (170 μ Ι/tube)，反復vertex 混勻，再次沉淀，冰上孵育60min，4°C，13000rpm,離心lOmin。⑦棄上清，再次短暫離心，用微量移液器吸去殘余上清。⑧每管加入200μ 1 TBS/0. 02% NaN3，反復vertex混勻，短暫離心lmin，沉淀任何 殘余不溶物，上清轉(zhuǎn)入新1.5ml離心管中，此即為擴增后的一級庫，標記，以1 1加入滅菌 甘油，-20°C保存。(11)噬菌體滴定①取2 3μ1 Ε. coli ER2738宿主菌，涂布M9_Tet平板，置于恒溫培養(yǎng)箱37°C倒 置培養(yǎng)過夜。②菌操作挑取分離良好的單克隆于3ml LB-Tet液體培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床 37°C，300rpm，振蕩培養(yǎng)16 18小時。③將過夜ER2738培養(yǎng)物1 100稀釋于3ml LB-Tet培養(yǎng)基中，225rpm，振蕩培養(yǎng) 1. 5h 2h，至 0D600 0. 5。④準備5個LB/IPTG/Xgal平板于37°C恒溫培養(yǎng)箱預(yù)熱(每個噬菌體稀釋度對應(yīng) 一個平板)。⑤預(yù)先準備45°C水浴，微波爐中融化Top Agarose，分裝于IOml離心管中，3ml/ tube，置于水浴中備用。⑥將ER2738 (0D600 0. 5)分裝于1. 5ml滅菌離心管中(每個噬菌體稀釋度對應(yīng) 一管)，200 μ 1/tube，4°C保存?zhèn)溆谩＂咴贚B中準備10倍系列稀釋的噬菌體擴增庫，稀釋范圍為102 1011。⑧取107 1011不同噬菌體稀釋度，每管10 μ 1，分別與200 μ 1宿主菌混合，快速 振蕩混勻，室溫溫育5min。⑨將感染的細菌快速加入45°C預(yù)溫的Top Agarose中，每次一管，快速vortex混 勻，立即傾注于37°C預(yù)熱的LB/IPTG/Xgal平板上，快速旋轉(zhuǎn)傾斜平版使之均勻鋪展開來。 室溫冷卻5min，置于恒溫培養(yǎng)箱中，37°C倒置培養(yǎng)過夜。
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⑩次日，待平板長出藍斑，選擇密度合適( 100個藍斑)的平板計數(shù)，計算擴增 噬菌體庫的滴度。計算方法如下擴增噬菌體庫的滴度=(藍斑數(shù)目X對應(yīng)噬菌體稀釋倍 數(shù))/10μ Kpfu/μ 1)。(12)下一輪篩選將滴定后的次級庫再次與ΗΕΚ293細胞和結(jié)腸癌Caco-2細胞孵 育，篩選過程如上述，分別用上一輪結(jié)合、擴增、滴定的噬菌體次級庫，進行3輪篩選，每輪 篩選投入的噬菌體量均為1. 5X 1010PFU，逐輪增加篩選強度與陰性細胞HEK293細胞孵育 時間增加至1. 25h、l. 5h、2h ；與靶細胞Caco-2細胞孵育時間每輪篩選減少為1. 5h、l. 25h、 Ih ；TBST洗滌次數(shù)相應(yīng)增加為6次、8次、10次；洗滌液中Tween-20濃度依次增加為0. 2%、 0. 3%,0. 5%。2. 2. 4細胞ELISA初步鑒定噬菌體陽性克隆2. 2. 4. 1噬菌體單克隆的制備(1)經(jīng)過第4輪篩選獲得的噬菌體不經(jīng)過擴增，直接感染宿主菌E. coli ER2738， 滴定鋪制LB/IPTG/Xgal平板，37°C倒置培養(yǎng)過夜。(2)將過夜培養(yǎng)的宿主菌按1 100比例稀釋于LB-Tet液體培養(yǎng)基，分裝于30個 IOml離心管，每管3ml。(3)無菌操作，從長出藍斑數(shù)目 100的平板上，隨機挑取30個噬菌體克隆，接種 到分裝好的離心管中，于37°C恒溫搖床，225rpm，緩慢振搖4. 5h。(4)將每個噬菌體單克隆擴增液分裝于滅菌1. 5ml離心管中，按照上述“噬菌體純 化”方法純化每個單克隆。(5)滴定每一個噬菌體單克隆。(6)以同樣方法滴定原始噬菌體肽庫，從滴定平板上隨機提取一個克隆擴增、滴 定，以作為陰性噬菌體克隆對照。2. 2. 4. 2 ELISA法鑒定噬菌體單克隆與結(jié)腸癌細胞結(jié)合的特異性以人胚腎細胞系HEK293細胞為陰性對照細胞，人源結(jié)腸癌細胞系Caco-2細胞為 靶細胞，用全細胞酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)鑒定隨機挑取的30個噬菌體克隆結(jié)合特異性 和親和力，以排除假陽性和非特異性克隆，同時設(shè)立PBS對照及原始噬菌體肽庫單克隆對 照(無關(guān)克隆對照)。具體操作方法如下(1)取生長狀態(tài)良好的結(jié)腸癌細胞Caco-2和HEK293細胞，傳代消化，細胞計數(shù)，接 種96孔細胞培養(yǎng)板，密度4X 105cellS/ml，每孔200 μ 1，每組設(shè)兩個復孔，置于37°C，5% C02細胞培養(yǎng)箱中孵育24 36h，待細胞貼壁長滿單層進行下步實驗。(2)吸棄培養(yǎng)基，用預(yù)熱的PBS洗滌2次，每孔加入200 μ 1無血清培養(yǎng)基，置細胞 培養(yǎng)箱孵育Ih。(3)吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，加入4%多聚甲醛，100μ 1/孔，室溫固定30min。(4)吸棄固定液，在吸水紙上輕輕拍干，PBS洗滌5minX3次。(5)在吸水紙上輕輕拍干，滴加3% H2O2，100 μ 1/孔，室溫孵育20min，以阻斷內(nèi)源 性過氧化物酶活性。(6)棄H2O2，在吸水紙上輕輕拍干，PBS洗滌5minX3次。(7)加入 Blocking buffer (3% BSAin 0· 5% TBST)，250 μ 1/孔，室溫封閉 2h。(8)吸去封閉液，0. TBST洗滌5次，分別加入噬菌體單克隆，1X1010PFU，100 μ 1/孔(稀釋于0.2% TBST)，設(shè)PBS對照和原始噬菌體肽庫單克隆對照，37°C孵育 1. 5h，間隔20min置脫色搖床緩慢振搖。(9)吸去噬菌體克隆，在吸水紙上輕輕拍干，PBS振蕩洗滌5minX5次。(10)加入山羊抗 M13 多克隆抗體(1 2000 稀釋于 Blocking buffer), 100 μ 1/ 孔，37°C孵育lh，并間隔15min放脫色搖床上緩慢振搖。(11)吸棄一抗，在吸水紙上輕輕拍干，PBS振蕩洗滌5minX5次。(12)加入 HRP 標記兔抗山羊 IgG(l 8000 稀釋于 Blocking buffer), 100 μ 1/ 孔，37°C孵育lh，并間隔15min放脫色搖床上緩慢振搖。(13)吸棄二抗，在吸水紙上輕輕拍干，PBS振蕩洗滌5minX5次。(14)在吸水紙上輕輕拍干，加入現(xiàn)配TMB顯色工作液，100 μ 1/孔，37°C孵育10 30min,肉眼觀察(白色背景)，陽性孔應(yīng)為藍色或深藍色，陰性孔和對照孔應(yīng)無色或淡藍 色。(15)加入顯色終止液(2M H2S04)終止反應(yīng)，50 μ 1/孔，立即用酶標儀于450nm波 長下測OD值，記錄數(shù)據(jù)。(16)判定結(jié)果，分析酶標測定儀取λ = 450nm, Ρ/η彡2. 1時陽性，Ρ/η彡1. 5陰 性，1. 5 ^ P/n ^ 2. 1可疑陽性。重復上述步驟3次，3次ELISA檢測Ρ/η彡2. 1的克隆為 陽性克隆。Ρ/η =結(jié)腸癌Caco-2細胞孔0. D值/人胚腎HEK293細胞孔0. D值(用空白孔 校 T = 100% )。(17)接種結(jié)腸癌Caco-2細胞于96孔細胞培養(yǎng)板，重復以上ELISA實驗步驟，進 一步鑒定陽性克隆與結(jié)腸癌Caco-2細胞的結(jié)合活性，排除假陽性克隆，比較陽性克隆與 Caco-2細胞親和力，每個克隆設(shè)8個復孔，同時設(shè)PBS對照和無關(guān)克隆對照。2. 2. 5陽性噬菌體克隆單鏈DNA快速純化(1)按上述噬菌體擴增方法，擴增陽性克隆，在第一步離心后，將500 μ 1含噬菌體 上清轉(zhuǎn)入新無菌1. 5ml離心管中。(2)加入200 μ 1 PEG/NaCl，反復顛倒混勻，室溫放置IOmin。(3)4°C，12000rpm，離心15min，去上清，再次短暫離心，小心吸去殘余上清。(4)沉淀物徹底重懸于100 μ 1碘化物緩沖液中，加入250 μ 1無水乙醇。室溫溫育 IOmin0短時間的室溫溫育使ssDNA沉淀而大多數(shù)噬菌體蛋白保持在溶液中。(5)41，10000印111，離心101^11，棄上清。用70%乙醇洗沉淀，短暫真空干燥。(6)沉淀重懸于 30 μ 1 TEdOmM Tris-HCl (ρΗ 8. 0), ImM EDTA)中。2. 2. 6噬菌體單鏈DNA測序取5μ 1噬菌體陽性克隆、噬菌體原庫無關(guān)克隆對照和陰性克隆單鏈DNA作為模 板，稀釋_96gIII測序引物5'-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3，，送南京金絲瑞生物工 程公司全自動測序。根據(jù)噬菌體展示試劑盒說明書讀序圖，利用DNAStar軟件找到Egal I 酶切位點CGGCCG和Kpn I酶切位點GGTACC，十二肽序列即插入這兩個酶切位點之間，找出 編碼Gly-Gly-Gly的堿基序列(GGT GGA GGT或CCA CCT CCA)其上游36個堿基為編碼十二 肽的密碼子，按照十二肽庫的設(shè)計原則，每個密碼子的第三位均為G或T，驗證找到的堿基 序列是否正確，利用軟件得出模板鏈的堿基序列，按照試劑盒說明書提供的三聯(lián)密碼子圖 翻譯成多肽序列(參見圖2)。
融合蛋白表達時N端有一段信號肽前導序列，蛋白分泌后前導序列被切除，使隨 機肽直接位于成熟蛋白的N末端，下箭頭指示前導序列的切割位點。-28和-96引物的互補 位置也在圖中標出。參見圖3，文庫的隨機序列區(qū)域僅用32個密碼子編碼所有20種氨基酸。這使單密 碼子氨基酸的出現(xiàn)頻率相對較高，同時排除了三個終止密碼子中的兩個。在構(gòu)建該文庫的 菌株中，琥珀終止子TAG*可被Gln抑制。2. 2. 7陽性克隆氨基酸序列的同源性和特征分析將翻譯的氨基酸序列通過NCBI/BLAST軟件同數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行 同源性分析，將出現(xiàn)頻率較高的序列用ExPASY提供的軟件ProtParam tools來分析12肽 片段的組成及特點，利用FASTA工具來分析多肽序列的疏水性。2. 2. 8細胞免疫熒光法鑒定陽性噬菌體克隆的靶向性(1)細胞爬片的準備①將24mmX 24mm蓋玻片浸泡，洗潔精清洗，自來水沖洗，稀鹽酸浸泡8h，流水沖 洗，鉻酸浸泡過夜，流水沖洗，蒸餾水、三蒸水沖洗三次，置于玻璃培養(yǎng)皿中高壓滅菌，烘干②在6孔細胞培養(yǎng)板中滴加少量細胞培養(yǎng)基，用無菌操作，夾取蓋玻片，放入培養(yǎng) 板孔中，使其貼附到孔底；③取生長狀態(tài)良好的結(jié)腸癌Caco-2細胞和人胚腎HEK293細胞，PBS沖洗一遍， 胰蛋白酶消化收集細胞，細胞計數(shù)，接種至6孔細胞培養(yǎng)板孔中的蓋玻片上，4X105cells/ ml，lml/well，置于37°C,5% C02細胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。(2)免疫熒光檢測陽性噬菌體克隆的靶向性①待Caco-2細胞和HEK293細胞培養(yǎng)至長滿單層，吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，吸 盡殘留液體，4%多聚甲醛室溫固定細胞，30min ；②用PBS 洗滌 5min X 3 次；③滴加3 % BSA室溫封閉2h ；④棄封閉液，分別將展示CCSPl 4多肽的噬菌體陽性克隆滴加至細胞表面 (1X1010PFU)，37°C孵育 2h ；⑤PBS 洗滌 5minX5 次；⑥滴加抗Ml3多克隆抗體(工作濃度1 500)，37°C孵育2h ；⑦PBS 洗滌 5minX5 次；⑧滴加FITC標記兔抗山羊IgG (工作濃度1 100)，37°C孵育Ih ；⑨PBS洗滌5minX3次，90%緩沖甘油封片，尼康Ti-S倒置顯微鏡鏡檢并拍照記錄。2. 2. 9統(tǒng)計學方法采用SPSS 16. O-GLM中的Univariate分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均以士 SD表示，組間多重比 較采用Duncan檢驗處理。P < 0. 01為差異極顯著，P < 0. 05為差異顯著，P > 0. 05為無 統(tǒng)計學意義。三、實驗結(jié)果3. 1噬菌體十二肽庫4輪消減篩選
本發(fā)明是從噬菌體隨機十二肽庫中篩選出與人結(jié)直腸癌細胞親和力較高的噬菌 體多肽，以人源結(jié)腸癌Caco-2細胞為靶細胞，以人胚腎細胞HEK293細胞為陰性吸附細胞， 完成對噬菌體十二肽庫4輪消減篩選，回收與結(jié)腸癌Caco-2細胞結(jié)合的噬菌體，重復對陰 性細胞的消減篩選以排除非特異克隆。在篩選過程中，嚴格控制每輪篩選中加入噬菌體的 數(shù)量，以保證篩選結(jié)果的穩(wěn)定性。噬菌體原庫的效價為1.5X1013pfu/ml，第一輪篩選投入 噬菌體為1. 5 X IO11Pfu,回收噬菌體滴定后每輪盡量保證投入噬菌體量在1. 5 X IO10Pfu以 上(如表3-1和圖4所示)，通過4輪消減篩選，特異性克隆得到大量富集和擴增，為進一步 挑取陽性克隆奠定良好的實驗基礎(chǔ)，提高了獲得具有高親和力噬菌體十二肽的可能性。表3-1四輪消減篩選中投入噬菌體量和回收噬菌體滴度
權(quán)利要求
1.Caco-2細胞表面特異性結(jié)合的多肽，其特征在于，利用噬菌體展示隨機十二肽庫篩 選得到4條多肽片段，其氨基酸序列分別為SPSIDTRYSRLG ；CVSVGMKPSPRP ；SVSVGMKPSPRP ；MVSMDSSPRDRL。
2.如權(quán)利要求1所述的Caco-2細胞表面特異性結(jié)合的多肽，其特征在于，所述的4條 多肽片段的氨基酸序列具有一定的同源性，含有共有序列XXSXXXXXXXRXX。
3.如權(quán)利要求1所述的Caco-2細胞表面特異性結(jié)合的多肽，其特征在于，所述的4條 多肽片段均為親水性多肽。
4.如權(quán)利要求1所述的Caco-2細胞表面特異性結(jié)合的多肽，其特征在于，所述的4條 多肽片段富含絲氨酸、脯氨酸、精氨酸、纈氨酸和天冬氨酸。
5.如權(quán)利要求1所述的Caco-2細胞表面特異性結(jié)合的多肽，其特征在于，所述的4條 多肽片段能夠特異性結(jié)合Caco-2細胞，而不識別人胚腎HEK293細胞。
6.權(quán)利要求1所述的Caco-2細胞表面特異性結(jié)合的多肽的篩選方法，其特征在于，該 方法利用噬菌體隨機十二肽庫，以體外培養(yǎng)的結(jié)直腸癌Caco-2細胞系為靶細胞，以人胚腎 細胞HEK293細胞系為吸附細胞，進行4輪全細胞消減篩選，隨機挑取30個噬菌體克隆擴增 并滴定，利用酶聯(lián)免疫吸附實驗鑒定陽性克隆，比較陽性克隆與Caco-2細胞的親和力，排 除假陽性克隆，提取陽性噬菌體克隆單鏈DNA測序，分析多肽的氨基酸序列的基本特征，多 肽同源性比較，檢索出現(xiàn)頻率高的多肽基序，BLAST檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，檢測多肽基序同源 性較高的蛋白質(zhì)，及可能結(jié)合的細胞表面受體和配體；細胞免疫熒光法檢測噬菌體多肽克 隆的靶向性，進一步鑒定陽性克隆的特異性。
全文摘要
本發(fā)明公開了Caco-2細胞表面特異性結(jié)合的多肽，利用噬菌體展示隨機十二肽庫篩選得到4條多肽片段，其氨基酸序列分別為SPSIDTRYSRLG，CVSVGMKPSPRP，SVSVGMKPSPRP和MVSMDSSPRDRL。本發(fā)明利用噬菌體多肽展示技術(shù)篩選結(jié)直腸癌Caco-2細胞結(jié)合的多肽序列，ELISA鑒定噬菌體克隆與結(jié)直腸癌細胞的親和力，獲得10個噬菌體克隆，測序獲得4條多肽序列，其共有氨基酸序列為XXSXXXXXXXRXX，同源性分析表明多肽基序可能為腫瘤細胞表面受體結(jié)合的配體蛋白上的氨基酸決定簇，細胞免疫熒光進一步鑒定噬菌體陽性克隆的靶向性結(jié)果提示噬菌體陽性克隆能夠特異性結(jié)合Caco-2細胞，篩選獲得的結(jié)腸癌Caco-2細胞特異性多肽為結(jié)直腸癌的早期診斷、抗腫瘤藥物的靶向運輸及靶向短肽藥物的研發(fā)提供初步的實驗依據(jù)。
文檔編號G01N33/50GK102127153SQ20101059185
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者侯穎春, 強榮兵, 王瀚 申請人:陜西師范大學