專利名稱：一種基于銀增強(qiáng)的甲羥孕酮的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種基于銀增強(qiáng)的甲羥孕酮的檢測方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
食品安全問題是關(guān)系國計(jì)民生的大問題。近年來，食品安全事件頻繁發(fā)生，對(duì)食品 安全檢測人員提出了更高的要求。ELISA以及金標(biāo)試紙條的出現(xiàn)，一定程度上極大地解決了 食品安全快速現(xiàn)場檢測的需求。然而，隨著科技的進(jìn)步，對(duì)于食品中超痕量的有毒有害物質(zhì) 的檢驗(yàn)，仍然沒有得到很好的解決。諸如液相色譜，氣相色譜能夠在一定程度上滿足超靈敏 檢測，但由于昂貴的價(jià)格及專業(yè)的操作要求，使得不能很好的滿足現(xiàn)場快速超靈敏檢測的 要求。納米技術(shù)的快速發(fā)展及在各個(gè)領(lǐng)域的廣泛運(yùn)用產(chǎn)生了很多交叉學(xué)科的新技術(shù)。美 國的Mirkin等人利用金納米粒子的獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，建立了基于金納米粒子的比色分析 法。國內(nèi)的樊春海等人利用金納米粒子的標(biāo)記作用，建立了基于金納米粒子的電化學(xué)檢測 方法。美國哈佛醫(yī)學(xué)院建立了基于磁性納米粒子的核磁共振免疫分析方法，實(shí)現(xiàn)了高通量 超靈敏檢測。到目前，仍未見將納米技術(shù)與ELISA技術(shù)結(jié)合的檢測方法。本發(fā)明報(bào)道了將 納米標(biāo)記技術(shù)與傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)相結(jié)合的超靈敏檢測方法的建立。研究結(jié)果表明基于金 納米粒子標(biāo)記及后續(xù)的銀沉積增強(qiáng)的研究，能夠很好地提高檢測靈敏度，從而為食品安全 檢測提供了行之有效的超靈敏檢測新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于納米金標(biāo)記及銀沉積增強(qiáng)的超靈敏食品安全檢測 方法。本發(fā)明的技術(shù)方案一種基于銀增強(qiáng)的甲羥孕酮的檢測方法，基于膠體金標(biāo)記及 銀沉積增強(qiáng)檢測信號(hào)的超靈敏檢測方法，共分5個(gè)步驟(1)膠體金的制備，(2)抗體的膠 體金標(biāo)記，(3)膠體金表面銀原位沉積、溶解及測定，(4)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，(5)實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品 中甲羥孕酮MPA的檢測；
(1)膠體金的制備
向處理過的干凈的三角燒瓶中加入50 mL質(zhì)量濃度為0. 01%的氯金酸溶液，攪拌，加 熱至沸騰，保持5min ；—次性加入質(zhì)量濃度1%的檸檬酸三鈉溶液2mL，邊加熱保持沸騰邊 攪拌，溶液顏色從淡黃色依次變成淺藍(lán)黑色，至深藍(lán)黑色最后變成酒紅色，當(dāng)顏色不再變化 后，繼續(xù)加熱沸騰15 min使反應(yīng)充分完全；最后，在攪拌的條件下，溶液冷卻至室溫，加蒸 餾水定容到50mL，得膠體金溶液，4°C保藏備用；
利用Frens法制備18nm左右的膠體金，此法簡便，粒徑均勻；
(2)抗體的膠體金標(biāo)記
用0. IM的1(20)3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值為9.0，然后向其中加入羊抗兔二抗抗體， 使羊抗兔二抗抗體的濃度為100 μ g/mL,并在室溫下反應(yīng)4h后，離心并重新分散于0. OlMPH7. 4的PBS緩沖溶液中，得50 μ g/mL的金標(biāo)羊抗兔二抗，4°C保存?zhèn)溆茫?br> (3)膠體金表面銀原位沉積、溶解及測定
用100 mL MPA-OVA的包被原包被96孔板，4°C過夜，用PBST溶液洗板去除未包被的包 被原；用含1% BSA的0. 01 M PBS封閉96孔板，在37°C孵育Ih，用PBST溶液洗板3次；向 96孔中加入不同濃度MPA的標(biāo)準(zhǔn)溶液或?qū)嶋H樣品溶液，加MPA的兔一抗，并在37°C孵育池； 用PBST溶液洗板5次后，每孔加入100 μ L的50 μ g/mL金標(biāo)羊抗兔二抗，在37°C條件下 孵育池；用PBST溶液3次洗板之后，每孔加入100 μ L的銀還原體系反應(yīng)30min，用PBST溶 液洗板5次后，向每孔加入200 μ L的濃硝酸，然后震蕩反應(yīng)池，提取每孔的銀溶液后，用原 子吸收光譜進(jìn)行定量分析；
所述銀還原體系由(a)質(zhì)量濃度洲的明膠溶液6mL，(b)質(zhì)量濃度5. 7%對(duì)苯二酚 3mL，(c) pH 3.5檸檬酸緩沖液lmL，和(d)質(zhì)量濃度洲AgNO3溶液200 μ L四種溶液組 成的銀還原體系；
(4)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)步驟(3)所述由原子吸收光譜測定的銀的濃度值，建立MPA的 濃度與銀的濃度值(吸光度值)之間的關(guān)系，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(5)實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中MPA的檢測步驟(3)中的由實(shí)際樣品溶液所測得的銀的濃度值 (吸光度值)與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，確定實(shí)際樣品中MPA的濃度。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明是在ELISA方法的基礎(chǔ)上，利用金標(biāo)記二抗代替?zhèn)鹘y(tǒng) 的酶標(biāo)二抗，然后再利用銀沉積在金納米粒子的表面增強(qiáng)最后的檢測信號(hào)，將沉積在金納 米粒子表面的銀溶解后，通過原子吸收光譜實(shí)現(xiàn)溶液中銀含量的定量檢測，從而實(shí)現(xiàn)樣品 中有毒有害物質(zhì)的超靈敏檢測。該方法在傳統(tǒng)的ELISA基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，基于快速超靈敏 等特點(diǎn)，在食品安全檢測等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力。


圖 1 15nm 金的 TEM 圖。圖2檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
(1)膠體金的制備
向處理過的干凈的三角燒瓶中加入50 mL濃度為0. 01%的氯金酸溶液，攪拌，加熱至沸 騰，保持5min，一次性加入1%的檸檬酸三鈉溶液2mL，邊加熱邊攪拌，溶液顏色從淡黃色依 次變成淺藍(lán)黑色，至深藍(lán)黑色最后變成酒紅色，當(dāng)顏色不再變化后，繼續(xù)加熱15 min使反應(yīng) 充分完全。最后，在攪拌的條件下，溶液冷卻至室溫，定容到50mL，4°C保藏備用。用TEM進(jìn) 行粒徑表征。(2)抗體的膠體金標(biāo)記
用0. IM的1(20)3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的PH值為9.0，然后向其中加入羊抗兔二抗抗體， 使羊抗兔二抗抗體的濃度為100 μ g/mL,并在室溫下反應(yīng)4h后，離心并重新分散于0. OlM PH7. 4的PBS緩沖溶液中，得50 μ g/mL的金標(biāo)羊抗兔二抗，4°C保存?zhèn)溆茫?br> (3)用100 mL MPA-OVA的包被原包被96孔板，4°C過夜，用PBST溶液洗板去除未包被的包被原。用含1% BSA的0. 01 M PBS封閉96孔板，在37°C孵育lh。用PBST溶液洗板3 次。向96孔中加入不同濃度MPA的標(biāo)準(zhǔn)溶液或?qū)嶋H樣品溶液，加MPA的兔一抗，并在37°C 孵育池。用PBST溶液洗板5次后，每孔加入100 μ L的50 μ g/mL金標(biāo)羊抗兔二抗，在37°C 條件下孵育池。用PBST溶液洗板3次洗板之后，每孔加入100 μ L由(a) 2% (m/v)明 膠 6mL，(b) 5. 7% (m/v)對(duì)苯二酚 3mL，(c) pH 3. 5 檸檬酸緩沖液 lmL，和(d) 2% (m/v) AgNO3,溶液200 μ L這四種溶液組成的銀還原體系，反應(yīng)30min。用PBST溶液洗板5次后， 向每孔加入200 μ L的濃硝酸，然后震蕩反應(yīng)池，提取每孔的銀溶液后，用原子吸收光譜進(jìn) 行定量分析。(4)根據(jù)原子吸收光譜測定的銀的濃度值，建立MPA的濃度與銀的濃度值(吸光度) 之間的關(guān)系，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。(5)用該方法實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中MPA的檢測步驟(3)中的由實(shí)際樣品溶液所測得的 吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，確定實(shí)際樣品中MPA的濃度。
權(quán)利要求
1. 一種基于銀增強(qiáng)的甲羥孕酮的檢測方法，其特征在于基于膠體金標(biāo)記及銀沉積增強(qiáng) 檢測信號(hào)的超靈敏檢測方法，共分5個(gè)步驟(1)膠體金的制備，(2)抗體的膠體金標(biāo)記，(3) 膠體金表面銀原位沉積、溶解及測定，(4)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，(5)實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中甲羥孕酮MPA 的檢測；(1)膠體金的制備向處理過的干凈的三角燒瓶中加入50 mL質(zhì)量濃度為0. 01%的氯金酸溶液，攪拌，加 熱至沸騰，保持5min ；—次性加入質(zhì)量濃度1%的檸檬酸三鈉溶液2mL，邊加熱保持沸騰邊 攪拌，溶液顏色從淡黃色依次變成淺藍(lán)黑色，至深藍(lán)黑色最后變成酒紅色，當(dāng)顏色不再變化 后，繼續(xù)加熱沸騰15 min使反應(yīng)充分完全；最后，在攪拌的條件下，溶液冷卻至室溫，加蒸 餾水定容到50mL，得膠體金溶液，4°C保藏備用；(2)抗體的膠體金標(biāo)記用0. IM的K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值為9. 0，然后向其中加入羊抗兔二抗抗體， 使羊抗兔二抗抗體的濃度為100 μ g/mL,并在室溫下反應(yīng)4h后，離心并重新分散于0. OlM PH7. 4的PBS緩沖溶液中，得50 μ g/mL的金標(biāo)羊抗兔二抗，4°C保存?zhèn)溆茫?3)膠體金表面銀原位沉積、溶解及測定用100 mL MPA-OVA的包被原包被96孔板，4°C過夜，用PBST溶液洗板去除未包被的包 被原；用含1% BSA的0. 01 M PBS封閉96孔板，在37°C孵育lh，用PBST溶液洗板3次；向 96孔中加入不同濃度MPA的標(biāo)準(zhǔn)溶液或?qū)嶋H樣品溶液，加MPA的兔一抗，并在37°C孵育池； 用PBST溶液洗板5次后，每孔加入100 μ L的50 μ g/mL金標(biāo)羊抗兔二抗，在37°C條件下孵 育池；用PBST溶液3次洗板之后，每孔加入100 μ L的銀還原體系反應(yīng)30min，用PBST溶液 洗板5次后，向每孔加入200 μ L的濃硝酸，然后震蕩反應(yīng)池，提取每孔的銀溶液后，用原子 吸收光譜進(jìn)行定量分析；所述銀還原體系由(a)質(zhì)量濃度洲的明膠溶液6mL，(b)質(zhì)量濃度5. 7%對(duì)苯二酚 3mL, (c) pH 3. 5檸檬酸緩沖液ImLjP (d)質(zhì)量濃度m AgNO3溶液200 μ L四種溶液組成 的銀還原體系；(4)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)步驟(3)所述由原子吸收光譜測定的銀的濃度值，建立MPA的 濃度與銀的濃度值之間的關(guān)系，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；(5)實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中MPA的檢測步驟(3)中的由實(shí)際樣品溶液所測得的銀的濃度值與 標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，確定實(shí)際樣品中MPA的濃度。
全文摘要
一種基于銀增強(qiáng)的甲羥孕酮的檢測方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明為基于膠體金標(biāo)記及銀沉積增強(qiáng)檢測信號(hào)的超靈敏檢測方法，共分5個(gè)步驟(1)膠體金的制備，(2)抗體的膠體金標(biāo)記，(3)膠體金表面銀原位沉積、溶解及測定，(4)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，(5)實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中甲羥孕酮MPA的檢測。主要內(nèi)容是在ELISA方法的基礎(chǔ)上，利用金標(biāo)記二抗代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酶標(biāo)二抗，然后再利用銀沉積在金納米粒子的表面增強(qiáng)最后的檢測信號(hào)，將沉積在金納米粒子表面的銀溶解后，通過原子吸收光譜實(shí)現(xiàn)溶液中銀含量的定量檢測，從而實(shí)現(xiàn)樣品中有毒有害物質(zhì)的超靈敏檢測。該方法在傳統(tǒng)的ELISA基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，基于快速超靈敏等特點(diǎn)，在食品安全檢測等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)G01N33/532GK102128931SQ201010597019
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者匡華, 孫鳳霞, 彭池方, 朱潁越, 王利兵, 胡擁明, 胥傳來, 陳偉 申請人:江南大學(xué)