專(zhuān)利名稱(chēng)：一種魚(yú)類(lèi)早期生命階段的高通量急性毒性測(cè)試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種專(zhuān)門(mén)針對(duì)魚(yú)類(lèi)早期生命階段的高通量急性毒性測(cè)試方法，屬于環(huán)境檢測(cè)和評(píng)價(jià)技術(shù)范疇。
背景技術(shù)：
隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)的日益加劇，越來(lái)越多的化學(xué)品被生產(chǎn)和使用，據(jù)報(bào)道，目前已登記的化學(xué)品數(shù)量超過(guò)數(shù)千萬(wàn)種之多，日常生活和生產(chǎn)中使用的化學(xué)品數(shù)量超過(guò)10萬(wàn)種。這些化學(xué)品在生產(chǎn)和使用過(guò)程中可能通過(guò)多種途徑進(jìn)入環(huán)境或殘留在人體、生物體中，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成嚴(yán)重威脅。為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)化學(xué)品以及環(huán)境樣品的安全性，生物毒性效應(yīng)是必不可少且最為重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
當(dāng)前普遍采用的生物毒性測(cè)試方法已有數(shù)十種之多，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)組織(ISO)、經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(0E⑶)、美國(guó)環(huán)保署(USEPA)、歐盟(EU)等國(guó)際組織和機(jī)構(gòu)已經(jīng)對(duì)部分生物毒性測(cè)試的方法制定了規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)近年也陸續(xù)頒布實(shí)施了數(shù)項(xiàng)生物毒性測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)方法，《水質(zhì)物質(zhì)對(duì)淡水魚(yú)(斑馬魚(yú))急性毒性測(cè)定方法GB/T13^7-1991》就是其中之一， 和ISO等國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)組織推薦的方法具有一定的可比性，在國(guó)內(nèi)毒性測(cè)試領(lǐng)域廣泛使用。但是，目前有關(guān)魚(yú)類(lèi)急性毒性測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)方法中，大多推薦使用成魚(yú)作為受試生物，在實(shí)際操作中存在諸多不足。比如，由于每個(gè)樣品的毒性測(cè)試都需要大量的受試魚(yú)，成魚(yú)的喂養(yǎng)相對(duì)較難，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高；喂養(yǎng)大量的實(shí)驗(yàn)用魚(yú)需要高額的實(shí)驗(yàn)室建設(shè)費(fèi)用、日常維護(hù)費(fèi)用和人員投入；測(cè)試用成魚(yú)體型較大，暴露容器也相應(yīng)較大，不方便操作，另外，需要的樣品體積也比較大，若采用流水式實(shí)驗(yàn)，所需樣品體積更大，不利于微量樣品的測(cè)試；由于成魚(yú)個(gè)體之間的差異較大，所測(cè)得的結(jié)果往往存在一定的差異性，為降低個(gè)體誤差往往需要進(jìn)行多個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，卻又增加了實(shí)驗(yàn)用魚(yú)的數(shù)量、樣品體積、實(shí)驗(yàn)費(fèi)用；傳統(tǒng)的成魚(yú)毒性測(cè)試實(shí)驗(yàn)暴露時(shí)間一般不低于96小時(shí)，所需時(shí)間較長(zhǎng)，不利于大批量樣品的快速測(cè)試； 成魚(yú)對(duì)化學(xué)污染物的敏感性相對(duì)較低，測(cè)定半數(shù)致死濃度往往需要較大量的樣品。因此，開(kāi)發(fā)一種快速、靈敏、高通量的魚(yú)類(lèi)急性毒性測(cè)試方法十分迫切。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服傳統(tǒng)成魚(yú)急性毒性測(cè)試中受試生物個(gè)體大、數(shù)量少、個(gè)體差異大、測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)、重現(xiàn)性低等不足，提供一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速、高通量的急性毒性測(cè)試方法，為有毒化學(xué)污染物和環(huán)境樣品的急性毒性測(cè)試提供技術(shù)保障。
本發(fā)明的目的通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)針對(duì)毒性測(cè)試中的受試生物魚(yú)類(lèi)，開(kāi)發(fā)出一種專(zhuān)門(mén)的重組稀釋溶液，培養(yǎng)新生的仔魚(yú)并用于急性毒性測(cè)試；同時(shí)，通過(guò)選擇早期生命階段的仔魚(yú)、采用微孔板作為毒性暴露容器，進(jìn)行急性毒性測(cè)試，實(shí)現(xiàn)了魚(yú)類(lèi)急性毒性的高通量測(cè)試。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面(1)開(kāi)發(fā)了一種專(zhuān)門(mén)針對(duì)魚(yú)類(lèi)培養(yǎng)的重組稀釋溶液，用于快速、穩(wěn)定培養(yǎng)早期生命階段的受試仔魚(yú)；( 通過(guò)比較、選擇了處于早期生命階段的仔魚(yú)作為受試生物開(kāi)展急性毒性測(cè)試，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法中采用成魚(yú)進(jìn)行毒性測(cè)試的諸多不足(如個(gè)體差異大、重現(xiàn)性差、靈敏度低、成本高、技術(shù)要求高等)；C3)采用微孔板作為毒性暴露的容器，既降低了實(shí)驗(yàn)待測(cè)樣品的體積，也實(shí)現(xiàn)了毒性測(cè)試的高通量；(4)采用該方法既節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，也降低了實(shí)驗(yàn)成本，實(shí)驗(yàn)結(jié)果比傳統(tǒng)方法有所提高；(5)本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，降低了對(duì)操作人員技術(shù)水平的要求，也便于方法的推廣普及。
綜上所述，本發(fā)明通過(guò)開(kāi)發(fā)一種專(zhuān)門(mén)針對(duì)魚(yú)類(lèi)培養(yǎng)和毒性測(cè)試的重組稀釋溶液， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)早期生命階段受試魚(yú)類(lèi)的快速、穩(wěn)定培養(yǎng)；通過(guò)比較不同生命階段受試魚(yú)類(lèi)對(duì)毒性污染物的敏感性，確定采用處于早期生命階段的魚(yú)類(lèi)作為受試生物，既實(shí)現(xiàn)了急性毒性測(cè)試的靈敏性和穩(wěn)定性，又縮短了毒性測(cè)試時(shí)間，也降低了成本；采用微孔板作為毒性測(cè)試的暴露容器，降低了待測(cè)樣品的體積，實(shí)現(xiàn)了測(cè)試的高通量，一定程度上提高了檢測(cè)的靈敏度。運(yùn)用該方法，保證了化學(xué)污染物、環(huán)境樣品急性毒性的簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速、高通量檢測(cè)。


圖1.仔魚(yú)微孔板方法與成魚(yú)傳統(tǒng)方法急性毒性測(cè)試結(jié)果的比較
圖中實(shí)心柱代表用仔魚(yú)的微孔板高通量方法測(cè)定鋅離子所得半數(shù)致死濃度，空心柱代表用成魚(yú)的傳統(tǒng)方法測(cè)定鋅離子所得半數(shù)致死濃度。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例
將采集的日本青鏘魚(yú)卵經(jīng)過(guò)精心挑選后，置于配制的重組稀釋溶液中，放入40°C 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、孵化。收集孵化出的仔魚(yú)，繼續(xù)放入稀釋溶液中培養(yǎng)6小時(shí)，作為受試生物。在6孔板的每個(gè)孔中盛放待測(cè)污染物的溶液5毫升，每孔中放入5條受試仔魚(yú)，之后放入25°C恒溫培養(yǎng)箱中暴露12小時(shí)，記錄死亡的仔魚(yú)數(shù)目，計(jì)算污染物的半數(shù)致死率。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一種專(zhuān)門(mén)針對(duì)魚(yú)類(lèi)早期生命階段的高通量急性毒性測(cè)試方法，屬于環(huán)境檢測(cè)和評(píng)價(jià)技術(shù)范疇。通過(guò)開(kāi)發(fā)毒性測(cè)試的重組稀釋溶液，探討處于不同生命階段的魚(yú)對(duì)毒性污染物的敏感性，以及不同數(shù)量的受試生物、不同暴露容器等條件對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響， 實(shí)現(xiàn)了仔魚(yú)急性毒性測(cè)試的高通量。該方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)水平要求不高，便于推廣應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1所述的一種魚(yú)類(lèi)早期生命階段的高通量急性毒性測(cè)試方法，其特征在于受試魚(yú)類(lèi)包括斑馬魚(yú)、日本青鏘、稀有鉤鯽等多種小型魚(yú)種。
3.權(quán)利要求1所述的一種魚(yú)類(lèi)早期生命階段的高通量急性毒性測(cè)試方法，其特征還在于受試魚(yú)類(lèi)應(yīng)為出生0-240小時(shí)之間的仔魚(yú)。
4.權(quán)利要求1所述的一種魚(yú)類(lèi)早期生命階段的高通量急性毒性測(cè)試方法，其特征還在于培養(yǎng)仔魚(yú)的重組稀釋溶液的組成，包括無(wú)機(jī)組分(如氯化鈉、氯化鈣、碳酸氫鈉、氯化鎂、氯化鉀等)，有機(jī)組分(包括氨基酸、甘油、維生素、葡萄糖等)。
5.權(quán)利要求1所述的一種魚(yú)類(lèi)早期生命階段的高通量急性毒性測(cè)試方法，其特征還在于毒性測(cè)試的暴露容器可以是6孔板、12孔板、M孔板、48孔板、96孔板等。
6.權(quán)利要求1所述的一種魚(yú)類(lèi)早期生命階段的高通量急性毒性測(cè)試方法，其特征還在于急性毒性測(cè)試的暴露溫度可以在5°C -40°C之間。
7.權(quán)利要求1所述的一種魚(yú)類(lèi)早期生命階段的高通量急性毒性測(cè)試方法，其特征還在于毒性測(cè)試的暴露時(shí)間可以在6-120小時(shí)之間。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種專(zhuān)門(mén)針對(duì)魚(yú)類(lèi)早期生命階段的高通量急性毒性測(cè)試方法，屬于環(huán)境檢測(cè)和評(píng)價(jià)技術(shù)范疇。通過(guò)開(kāi)發(fā)毒性測(cè)試的重組稀釋溶液，探討處于不同生命階段的魚(yú)對(duì)毒性污染物的敏感性，以及不同數(shù)量的受試生物、不同暴露容器等條件對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，實(shí)現(xiàn)了仔魚(yú)急性毒性測(cè)試的高通量。該方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速、靈敏，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)水平要求不高，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/00GK102539640SQ20101060851
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者杜宇國(guó), 譚卓威, 魏東斌 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心