專利名稱:一種快速評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蚜效果的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物安全評(píng)價(jià)技術(shù),尤其是一種快速評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲 棉抗蚜效果的方法。
背景技術(shù):
目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲效果評(píng)價(jià)的技術(shù)主要有以下幾種(1)籠罩接蚜試驗(yàn)法 把棉蚜接種在籠罩網(wǎng)內(nèi)的棉花上,觀察棉蚜為害棉花造成的蚜害指數(shù)和蚜害指數(shù)減退率;蚜重測定法將棉蚜接在棉花上,經(jīng)過一段時(shí)間飼養(yǎng)后,稱重棉蚜的體重,求得平均單蚜體重,以此為指標(biāo)評(píng)價(jià)棉花對(duì)棉蚜生長發(fā)育的影響;(3)室內(nèi)生命表法采用棉花或者棉葉飼喂棉蚜,按照生命表方法統(tǒng)計(jì)若蚜死亡率、若蚜歷期、成蚜歷期、繁殖力、世代凈生殖率、 世代生長周期和種群內(nèi)稟增長力;(4)蜜露法根據(jù)棉蚜在棉花上的取食量與其所排泄蜜露多少成正相關(guān)的特點(diǎn)及蜜露與溴甲酚綠呈色反應(yīng)生成深藍(lán)色斑點(diǎn)的原理,以量度色斑面積間接判斷棉蚜拒食的程度。上述評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蚜效果的方法主要存在以下缺點(diǎn)(1)需要大量的蚜蟲來進(jìn)行測定,一般需要上百頭或者上千頭蚜蟲;(2)測定周期過長,一般需要數(shù)十天或者數(shù)月之久。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種快速、無污染且方法簡單的快速評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蚜效果的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采取以下技術(shù)方案
該快速評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蚜效果的方法,包括以下步驟
(1)設(shè)備和待測材料的準(zhǔn)備
檢測儀器為昆蟲直流刺吸電位儀(electrical penetration graph)。棉花生育期為苗期4-5片真葉期。用水溶性導(dǎo)電銀膠將棉蚜的背板和金絲電極相連,放置棉蚜于待測棉苗葉背上適應(yīng)1-3小時(shí)后,金絲電極的另外一端連接刺吸電位儀放大器;
(2)檢測和記錄
檢測開始,棉蚜刺吸取食行為產(chǎn)生的電信號(hào)經(jīng)昆蟲刺吸電位儀放大處理后通過采集軟件和模擬一數(shù)字轉(zhuǎn)化卡記錄在電腦硬盤上,記錄一段時(shí)間后結(jié)束;
(3)信號(hào)分析和計(jì)算
利用分析軟件分析每頭棉蚜在測定時(shí)間內(nèi)口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的次數(shù)和每次出現(xiàn)持續(xù)的時(shí)間,計(jì)算①棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形每次出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間的平均值;②棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占測定時(shí)間的百分比;
(4)判斷轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)棉蚜的抗蟲效果
①抗蚜轉(zhuǎn)基因棉判斷標(biāo)準(zhǔn)棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形每次出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間的平均值小于10分鐘,且棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占測定時(shí)間的百分比小于12%,則該品系轉(zhuǎn)基因棉對(duì)棉蚜有較高的抗性,棉蚜不喜歡取食該棉花;
②非抗蚜轉(zhuǎn)基因棉判斷標(biāo)準(zhǔn)棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形每次出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間的平均值大于14分鐘,且棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占總測定時(shí)間的百分比大于27%,則該品系轉(zhuǎn)基因棉對(duì)棉蚜沒有抗性,棉蚜喜歡取食該品系棉花。與現(xiàn)有同類檢 測方法或技術(shù)相比,本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
(1)評(píng)價(jià)時(shí)間短,方法簡單一臺(tái)八通道刺吸電位系統(tǒng)2天的時(shí)間就可以測定20頭棉蚜的刺吸行為,這些數(shù)據(jù)就可以用來評(píng)價(jià)一個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花品系對(duì)棉蚜的抗性效果。而生命表法和籠罩飼養(yǎng)等方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力,需要每天花費(fèi)大量精力觀察昆蟲的取食情況和測量昆蟲的生長發(fā)育指標(biāo)。本發(fā)明可以直接測定棉花植株,不用對(duì)植株進(jìn)行其他處理;
(2)評(píng)價(jià)方法精確本方法可以從不同指標(biāo)描述棉花對(duì)棉蚜的抗性,不但能夠分析棉蚜是否喜好取食該棉花品系,而且能夠分析棉蚜喜歡取食或者不喜歡取食的行為生理基礎(chǔ), 這是其他評(píng)價(jià)方法所不能比擬的;
(3)評(píng)價(jià)不需要大量的昆蟲,準(zhǔn)確性高,重復(fù)性好檢測了多個(gè)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉,準(zhǔn)確率達(dá)到 100%。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述,這些描述并非是對(duì)本發(fā)明內(nèi)容的限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解,對(duì)本發(fā)明內(nèi)容所作的等同替換,或相應(yīng)變化,仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1
(1)設(shè)備和待測材料的準(zhǔn)備
檢測儀器為4通道昆蟲直流刺吸電位儀(electrical penetration graph)。待測2個(gè)棉花品系為Al和A2,生育期為苗期4片真葉期。用水溶性導(dǎo)電銀膠將棉蚜的背板和金絲相連,放在棉苗葉片上適應(yīng)1小時(shí)后,金絲電極另外一端連接刺吸電位儀放大器。每株待測棉苗上只能放置一頭棉蚜無翅成蚜,吸電位儀放大器每個(gè)通道只能連接一頭棉蚜,棉苗和棉蚜均使用一次;
(2)檢測和記錄
刺吸電位儀記錄開始。輸出信號(hào)使用WinDaq Lite采集軟件(Dataq instruments, Inc.),通過模擬一數(shù)字轉(zhuǎn)化卡(DI-720,Dataq instruments, Inc.)記錄在電腦硬盤上。 記錄6小時(shí)后結(jié)束。Al和A2品系棉花分別獲得20株棉苗上棉蚜有效的數(shù)據(jù);
(3)信號(hào)分析和計(jì)算
利用分析軟件WinDaq Lite采集軟件(Dataq instruments, Inc.)分析在測定時(shí)間內(nèi)棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的次數(shù)和每次出現(xiàn)持續(xù)的時(shí)間。計(jì)算①棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形每次出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間的平均值;②棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占測定時(shí)間的百分比;上述①和②棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形分為唾液分泌對(duì)應(yīng)的El波和被動(dòng)吸食植物汁液對(duì)應(yīng)的E2波; ⑷結(jié)果及評(píng)價(jià)棉花對(duì)棉蚜的抗性效果
對(duì)于棉花Al和A2品系,棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形每次出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間的平均值分別為5. 47分鐘和19. 06分鐘,而棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占測定時(shí)間的百分比平均值分別為9. 93%和30. 9% ;
按照評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),對(duì)于Al品系,棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形每次出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間的平均值為5. 47分鐘,小于10分鐘,且棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食產(chǎn)生波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占總測定時(shí)間的百分比平均值為9. 93%,小于12%,則該轉(zhuǎn)基因棉對(duì)棉蚜有較高的抗性, 棉蚜不喜歡取食該棉花汁液;
對(duì)于A2品系,棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形每次出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間的平均值為 19. 06分鐘,大于14分鐘,且蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占總測定時(shí)間的百分比平均值為30. 9%,大于27%,則該品系轉(zhuǎn)基因棉對(duì)棉蚜沒有抗性,棉蚜喜歡取食該棉花。測定品系A(chǔ)l是轉(zhuǎn)基因抗蚜轉(zhuǎn)基因棉花,A2為其親本非抗蚜棉花,系非轉(zhuǎn)基因常規(guī)棉。因此本發(fā)明的測定結(jié)果與實(shí)際相符。實(shí)施例2:
與實(shí)施例1的操作條件相同,所不同的是待測棉花品系分別為Bl和B2。檢測結(jié)果表明對(duì)于Bl和B2棉花品系,棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形每次出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間的平均值分別為7. 99分鐘和22. 99分鐘,而棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占測定時(shí)間的百分比分別為9. 93%和40. 45% ;
按照評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),對(duì)于Bl品系,棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形每次出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間的平均值為7. 99分鐘,小于10分鐘,且棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占總測定時(shí)間的百分比平均值為9. 93%,小于12%,則該轉(zhuǎn)基因棉對(duì)棉蚜有較高的抗性, 棉蚜不喜歡取食該棉花汁液;
對(duì)于B2品系,棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形每次出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間的平均值為 22. 99分鐘,大于14分鐘,且蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占總測定時(shí)間的百分比平均值為40. 45%,大于27%,則該轉(zhuǎn)基因棉品系對(duì)棉蚜沒有抗性,棉蚜喜歡取食該棉花品系。測定品系Bl是轉(zhuǎn)基因抗蚜轉(zhuǎn)基因棉花,B2為其親本常規(guī)棉花,系非轉(zhuǎn)基因常規(guī)棉。因此本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際相符。實(shí)施例3:
與實(shí)施例1的操作條件相同,所不同的是待測棉花品系為抗蟲轉(zhuǎn)基因棉SGK321。檢測結(jié)果表明棉蚜口針在SGK321棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形每次出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間的平均值為 31. 68分鐘,棉蚜口針在SGK321棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占測定時(shí)間的百分比平均值為30. 16% ;
按照評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),對(duì)于SGK321棉花品系,棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形每次出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間的平均值為31. 68分鐘,大于14分鐘,且棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占總測定時(shí)間的百分比平均值為30. 16%,大于27%,則SGK321轉(zhuǎn)基因棉對(duì)棉蚜沒有抗性,棉蚜喜歡取食該棉花品系。測定棉花品系SGK321是轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲棉花,系非抗蚜轉(zhuǎn)基因棉花品系。因此本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際相符。
權(quán)利要求
1.一種快速評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蚜效果的方法,包括以下步驟(1)設(shè)備和待測材料的準(zhǔn)備檢測儀器為昆蟲直流刺吸電位儀(electrical penetration graph, EPG),棉花生育期為苗期4-5片真葉期,用水溶性導(dǎo)電銀膠將棉蚜的背板和金絲電極相連,放置棉蚜于待測棉苗葉背上適應(yīng)1-3小時(shí)后,金絲電極的另外一端連接刺吸電位儀;(2)檢測和記錄檢測開始,棉蚜在轉(zhuǎn)基因棉花上的刺吸取食行為產(chǎn)生的一系列電信號(hào)經(jīng)昆蟲刺吸電位儀放大處理后,通過信號(hào)采集軟件和模擬一數(shù)字轉(zhuǎn)化卡記錄在電腦硬盤上,記錄一段時(shí)間后結(jié)束;(3)信號(hào)分析和計(jì)算利用分析軟件分析每頭棉蚜在測定時(shí)間內(nèi)口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的次數(shù)和每次出現(xiàn)持續(xù)的時(shí)間,計(jì)算①棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形每次出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間的平均值;②棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占測定時(shí)間的百分比;(4)判斷轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)棉蚜的抗蟲效果①抗蚜轉(zhuǎn)基因棉判斷標(biāo)準(zhǔn)棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形每次出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間的平均值小于10分鐘,且棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占測定時(shí)間的百分比小于12%,則該品系轉(zhuǎn)基因棉對(duì)棉蚜有較高的抗性,棉蚜不喜歡取食該棉花;②非抗蚜轉(zhuǎn)基因棉判斷標(biāo)準(zhǔn)棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形每次出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間的平均值大于14分鐘,且棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占總測定時(shí)間的百分比大于27%,則該品系轉(zhuǎn)基因棉對(duì)棉蚜沒有抗性,棉蚜喜歡取食該品系棉花。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蚜效果的方法,其特征在于所述步驟⑴中的測定儀器昆蟲直流刺吸電位儀(electrical penetration graph)系荷蘭 Wageningen University生產(chǎn),為4通道(Giga4型號(hào))或者8通道(Giga8型號(hào))。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蚜效果的方法,其特征在于所述步驟⑴中每株待測棉苗上只能放置一頭棉蚜無翅成蚜,刺吸電位儀放大器每個(gè)通道只能連接一頭棉蚜,每株棉苗和每頭棉蚜只能使用一次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蚜效果的方法,其特征在于每個(gè)品系的待測棉花至少成功測定20株棉苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蚜效果的方法,其特征在于所述步驟⑵測定時(shí)間為4-6小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蚜效果的方法,其特征在于所述步驟⑶棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形分為唾液分泌對(duì)應(yīng)的El波和被動(dòng)吸食植物汁液對(duì)應(yīng)的E2波。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測轉(zhuǎn)基因抗蚜棉的方法,其特征在于所述步驟⑶中① 棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形每次出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間的平均值為所有測定棉蚜吸食汁液對(duì)應(yīng)波形持續(xù)時(shí)間的平均值,②棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占測定時(shí)間的百分比為所有測定棉蚜該值的平均值。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蚜效果的方法。檢測儀器為昆蟲刺吸電位儀。步驟包括連接棉蚜和金絲電極;檢測和記錄棉蚜在待測棉花上刺吸取食時(shí)產(chǎn)生的電信號(hào);記錄一段時(shí)間后結(jié)束,分析棉蚜在測定棉花上刺吸取食產(chǎn)生的波形;評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)棉蚜的抗蟲效果棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)的波形每次出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間的平均值小于10分鐘,且棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占測定時(shí)間的百分比小于12%,則該品系轉(zhuǎn)基因棉對(duì)棉蚜有較高的抗性;棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形每次出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間的平均值大于14分鐘,且棉蚜口針在棉葉韌皮部吸食對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占總測定時(shí)間的百分比大于27%,該轉(zhuǎn)基因棉品系對(duì)棉蚜沒有抗性。與現(xiàn)有同類檢測方法相比,本發(fā)明檢測速度快,方法簡單,成本低,重復(fù)性好,準(zhǔn)確率高。
文檔編號(hào)G01N27/00GK102331442SQ20101061100
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者周琳, 崔金杰, 湯清波, 蔣金煒, 賈述娟, 郭線茹, 閆鳳鳴, 雒珺瑜, 馬英, 高佳 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)