專利名稱：Cyp450酶亞型生物質(zhì)譜絕對(duì)定量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種同時(shí)測定人的4種CYP450酶亞型生物質(zhì)譜絕對(duì)定量方法。
背景技術(shù)：
P450酶是體內(nèi)重要的藥物代謝酶。P450酶對(duì)藥物進(jìn)行代謝的同時(shí)，藥物也可對(duì) P450酶產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用。其中CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5四種P450酶參與了約 85%左右藥物體內(nèi)代謝過程。P450酶定性和定量分析對(duì)于評(píng)價(jià)藥物的代謝過程和藥物相互作用具有重要的參考價(jià)值和意義?，F(xiàn)有P450酶定量分析方法主要有探針?biāo)幬锓?，Western Blot法，以及mRNA檢測法等。然而上述方法專屬性差，靈敏度低，只能給出P450酶相對(duì)量， 并不能給出P450酶絕對(duì)含量，無法滿足藥物對(duì)P450酶作用評(píng)價(jià)的要求。第一，P450酶超家族多屬于同工酶，其底物常常具有交叉現(xiàn)象，很難找到P450酶絕對(duì)專一的探針?biāo)幬?，至今只有極少數(shù)P450酶底物的專一性得到了全面的驗(yàn)證。第二，P450酶特別是亞家族內(nèi)同工酶序列存在高度同源性，這為Western Blot法中所需特異性抗體的制備和純化提出了很高的要求。第三，蛋白質(zhì)的表達(dá)受到多種機(jī)制的調(diào)控，利用mRNA表達(dá)的水平代表其對(duì)應(yīng)的蛋白含量并不十分可靠。因此，建立一種P450酶亞型絕對(duì)定量方法是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，建立一種可以同時(shí)測定人的4種CYP450酶亞型生物質(zhì)譜絕對(duì)定量方法。涉及的4種CYP450酶亞型是CYP1A2，CYP2B6, CYP3A4, CYP3A5。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是，選取經(jīng)胰酶水解CYP450酶獲得的特異性肽段，其中特異性是指肽段是產(chǎn)生此肽段的酶所特有的，其他蛋白質(zhì)經(jīng)胰酶水解并不能產(chǎn)生該肽段?；谝合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS/MS)，利用多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式對(duì)特異性肽段及其穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段進(jìn)行掃描分析，建立特異性肽段穩(wěn)定、可靠的LC/MS/MS定量方法。鑒于同種元素不同穩(wěn)定同位素之間質(zhì)譜響應(yīng)相同，因此可利用對(duì)于蛋白樣品中添加的穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段作為標(biāo)準(zhǔn)肽段進(jìn)行定量分析建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而實(shí)現(xiàn)特異性肽段的定量。每種酶亞型選取3種特異性肽段代表其本身濃度水平，即將肽段濃度取平均值得到相應(yīng)CYP450酶亞型濃度，經(jīng)由蛋白濃度校正獲得CYP450酶亞型絕對(duì)含量。采取上述方法即可實(shí)現(xiàn)利用正常肽段定量CYP450酶亞型水平。正常肽段即是待測肽段。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下所述。一種CYP450酶亞型生物質(zhì)譜絕對(duì)定量方法，涉及4種CYP450酶亞型CYP1A2、 CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5 ；具體步驟如下A、蛋白樣品預(yù)處理(1)蛋白樣品的還原，①于聚乙烯管中加入100μ 1蛋白樣品，②加入5 μ 1變性劑，渦流混勻，
③加入10 μ 1還原劑，渦流混勻，④60°C孵育1小時(shí)，得到反應(yīng)液；(2)半胱氨酸的封閉，于反應(yīng)液中加入5 μ 1半胱氨酸封閉劑，渦流混勻；室溫孵育IOmin ；(3)蛋白樣品的胰酶消化，經(jīng)半胱氨酸封閉的反應(yīng)液中加入100 μ 1消化緩沖液，再加入10 μ 1胰酶溶液，渦流混合，37°C孵育12 16小時(shí)得到蛋白樣品反應(yīng)液；B、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備①利用肽段稀釋液將穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段標(biāo)準(zhǔn)品溶解至500fmol/ μ 1，得到穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段儲(chǔ)備液；②利用蛋白樣品反應(yīng)液將穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段儲(chǔ)備液分別稀釋至5、10、30、100、 300fmol/y 1 ；③取10 μ 1進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，記錄色譜圖，以穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段濃度為橫坐標(biāo)，穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段峰面積為縱坐標(biāo)，用加權(quán)W = 1/χ2最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線；C、蛋白樣品中CYP450酶亞型含量測定取經(jīng)由A步驟處理后的蛋白樣品反應(yīng)液10 μ 1進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，記錄色譜圖，將肽段峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得肽段濃度，此肽段是指選取的3種胰酶水解 CYP450酶亞型得到的肽段；將3種肽段濃度取平均值，即為對(duì)應(yīng)CYP450酶亞型濃度；經(jīng)樣品蛋白濃度校正，即將CYP450酶亞型濃度除以蛋白濃度，得到蛋白樣品中CYP450酶亞型含量；所述的B步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及C步驟蛋白樣品中CYP450酶亞型含量測定，色譜條件為=Agilent 1100型液相色譜系統(tǒng)；色譜柱ρ印tide C18柱， 50mmX2. Imm I. D. ,5 μ m粒徑；流動(dòng)相含體積百分?jǐn)?shù)占0. 1 %甲酸的水和含體積百分?jǐn)?shù)占 0. 甲酸的乙腈，梯度洗脫；柱溫30°C ；流速0. 7ml/min;進(jìn)樣量10 μ 1 ；質(zhì)譜條件為ΑΡΙ 4000型三重四極桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子化源和Analyst 1. 3數(shù)據(jù)處理軟件；離子源電噴霧離子化源；正離子方式檢測；離子噴射電壓4000V ；溫度550°C ；源內(nèi)氣體1 氮?dú)鈮毫?5psi ；氣體2 氮?dú)鈮毫?0psi ；氣簾氣體氮?dú)鈮毫?5psi ；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測；各肽段離子對(duì)及其相應(yīng)DP、CE以及CXP值見表 1 ；表1肽段多重反應(yīng)監(jiān)測設(shè)定值
權(quán)利要求
1. 一種CYP450酶亞型生物質(zhì)譜絕對(duì)定量方法，涉及4種CYP450酶亞型CYP1A2、 CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5 ；具體步驟如下A、蛋白樣品預(yù)處理(1)蛋白樣品的還原，①于聚乙烯管中加入100μ 1蛋白樣品，②加入5μ 1變性劑，渦流混勻，③加入10μ 1還原劑，渦流混勻，④60°C孵育1小時(shí)，得到反應(yīng)液；(2)半胱氨酸的封閉，于反應(yīng)液中加入5μ 1半胱氨酸封閉劑，渦流混勻；室溫孵育IOmin ；(3)蛋白樣品的胰酶消化，經(jīng)半胱氨酸封閉的反應(yīng)液中加入100 μ 1消化緩沖液，再加入10 μ 1胰酶溶液，渦流混合，37°C孵育12 16小時(shí)得到蛋白樣品反應(yīng)液；B、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備①利用肽段稀釋液將穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段標(biāo)準(zhǔn)品溶解至500fmol/y1，得到穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段儲(chǔ)備液；②利用蛋白樣品反應(yīng)液將穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段儲(chǔ)備液分別稀釋至5、10、30、100、 300fmol/y d ；③取10μ 1進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，記錄色譜圖，以穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段濃度為橫坐標(biāo)，穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段峰面積為縱坐標(biāo)，用加權(quán)W = 1/χ2最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算， 求得的直線回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線；C、蛋白樣品中CYP450酶亞型含量測定取經(jīng)由A步驟處理后的蛋白樣品反應(yīng)液10 μ 1進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，記錄色譜圖，將肽段峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得肽段濃度，此肽段是指選取的3種胰酶水解CYP450 酶亞型得到的肽段；將3種肽段濃度取平均值，即為對(duì)應(yīng)CYP450酶亞型濃度；經(jīng)樣品蛋白濃度校正，即將CYP450酶亞型濃度除以蛋白濃度，得到蛋白樣品中CYP450酶亞型含量；所述的B步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及C步驟蛋白樣品中CYP450酶亞型含量測定，色譜條件為Agilent 1100型液相色譜系統(tǒng)；色譜柱p印tide C18柱，50mmX2. Imm I.D.，5 μ m粒徑；流動(dòng)相含體積百分?jǐn)?shù)占0. 甲酸的水和含體積百分?jǐn)?shù)占0. 甲酸的乙腈，梯度洗脫；柱溫300C ；流速0. 7ml/min ；進(jìn)樣量10 μ 1 ；質(zhì)譜條件為ΑΡΙ 4000型三重四極桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子化源和Analyst 1. 3數(shù)據(jù)處理軟件；離子源電噴霧離子化源；正離子方式檢測；離子噴射電壓 4000V ；溫度550°C ；源內(nèi)氣體1 氮?dú)鈮毫?5psi ；氣體2 氮?dú)鈮毫?0psi ；氣簾氣體氮?dú)鈮毫?5psi ；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測；各肽段離子對(duì)及其相應(yīng)DP、CE以及CXP值見表1 ；表1肽段多重反應(yīng)監(jiān)測設(shè)定值
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP450酶亞型生物質(zhì)譜絕對(duì)定量方法，其特征在于，所述的變性劑，是重量體積比為20%的正-辛基谷氨酸溶液；所述的還原劑，是50mM的三(2-甲酰乙基)膦溶液；所述的半胱氨酸封閉劑，是200mM的甲基甲烷硫代磺酸鹽溶液；所述的消化緩沖液，是0. IM的三羥甲基氨基甲烷與4mM氯化鈣的混合溶液；所述的胰酶溶液，是5mg/ ml的胰酶溶液；所述的肽段稀釋液，是按體積百分?jǐn)?shù)20%乙腈與0. 三氟乙酸的混和溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的CYP450酶亞型生物質(zhì)譜絕對(duì)定量方法，其特征在于，所述的色譜條件中梯度洗脫，程序見表2，表2梯度洗脫程序
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP450酶亞型生物質(zhì)譜絕對(duì)定量方法，其特征在于，樣品測定期間利用質(zhì)量控制樣品對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證；所述的質(zhì)量控制樣品按照如下步驟制備①利用肽段稀釋液將穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段標(biāo)準(zhǔn)品溶解至500fmol/y1，得到穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段儲(chǔ)備液；②利用蛋白樣品反應(yīng)液將穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段儲(chǔ)備液分別稀釋至10、100、300fmol/μ ；③標(biāo)準(zhǔn)肽段每濃度取三個(gè)樣本，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)肽段濃度，計(jì)算質(zhì)量控制樣品準(zhǔn)確度。
全文摘要
本發(fā)明的CYP450酶亞型生物質(zhì)譜絕對(duì)定量方法，屬于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明基于LC/MS/MS，利用CYP450經(jīng)胰酶水解產(chǎn)生的特異性肽段定量酶的策略，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)肝微粒體等體系中4種CYP450酶亞型CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5的絕對(duì)定量。本發(fā)明主要包括如下步驟蛋白樣品預(yù)處理、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備、蛋白樣品的測定以及質(zhì)控樣品的制備。本發(fā)明的方法線性關(guān)系良好、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好而且靈敏、精密、可靠，可用于藥物代謝及藥物相互作用的評(píng)價(jià)。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102175804SQ20101061366
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者何群, 史美云, 孫嚴(yán)彤, 張蕓輝, 曾蘇, 楊艷, 蔣惠娣, 顧景凱 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)