專利名稱：一種快速磁分離法主導(dǎo)的肝癌甲胎蛋白變異體檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米材料應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種快速磁分離法主導(dǎo)的肝癌甲胎蛋白 變異體(AFP-U)檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
在世界范圍內(nèi)，乙肝病毒和丙肝病毒肝炎及肝硬化是肝細(xì)胞肝癌(HCC)的重要危 險(xiǎn)因素，90%以上的HCC患者被檢出乙肝病毒。我國(guó)是肝癌高發(fā)國(guó)家，每年約11萬(wàn)患者死 于HCC，這相當(dāng)于整個(gè)世界死于HCC患者的45%。臨床肝癌發(fā)現(xiàn)時(shí)多已晚期，治療難度大， 手術(shù)并發(fā)癥多，療效通常不好，生存期短，一般發(fā)病后生存時(shí)間僅為6個(gè)月到一年。所以，在 肝癌防治中，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療就顯得尤為重要。甲胎蛋白(AFP)作為HCC的診斷及療效隨訪觀察指標(biāo)已應(yīng)用多年，由于AFP不夠 特異從而限制了 HCC早期診斷的價(jià)值，但AFP對(duì)HCC可疑患者(指高危人群中)的篩選還 是有效的。上世紀(jì)八十年代，上海市腫瘤研究所許凱黎研究員等最早采用扁豆凝集素(LCA) 親和放射免疫電泳方法，檢測(cè)HCC病人血清中AFP-L3。發(fā)現(xiàn)良性肝病時(shí)肝細(xì)胞壞死后再 生時(shí)產(chǎn)生的AFP糖鏈結(jié)構(gòu)，與HCC時(shí)產(chǎn)生的AFP糖鏈結(jié)構(gòu)上有明顯差異。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) AFP-L3在兩支鏈復(fù)合型糖鏈的還原末端側(cè)的N-乙酰葡萄糖胺上結(jié)合著α _1_6_巖藻聚糖， 該糖鏈結(jié)構(gòu)能特異性結(jié)合LCA。研究人員將AFP分為L(zhǎng)CA非結(jié)合型AFP_L1主要存在于良 性肝病中、AFP-L2來(lái)自孕婦，LCA結(jié)合型AFP_L3為HCC所特有，揭示了 AFP-L3是HCC惡性 程度的一個(gè)重要標(biāo)志。在HCC的早期診斷中檢測(cè)AFP-L3是非常有效的。據(jù)報(bào)道，AFP-L3 在小肝癌(< 2cm)可以有35%的陽(yáng)性率，AFP-L3比影像學(xué)檢查可以提前9_12個(gè)月發(fā)現(xiàn) HCC的存在。對(duì)良性肝病特異性> 95%。AFP-L3的敏感性與HCC的臨床分期相關(guān)AFP_L3 用于檢測(cè)HCC的總的敏感性大約在60%左右之間。在直徑小于2cm肝癌中，其敏感性只有 35-45%。隨著HCC的增大，AFP-L3的敏感性也隨之升高。當(dāng)HCC的直徑彡5cm時(shí)，AFP-L3 的敏感性可高達(dá)80-90%。AFP-L3陽(yáng)性的HCC存在早期血管浸潤(rùn)和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的傾向。如果 α -連環(huán)蛋白缺失，那么HCC常常有肝外的轉(zhuǎn)移。影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn)AFP-L3陽(yáng)性的HCC通常 有豐富的肝動(dòng)脈血液供給，腫瘤的倍增時(shí)間較短。這就提示了 AFP-L3陽(yáng)性的HCC生長(zhǎng)的非 ?？觳⑶胰菀装l(fā)生早期轉(zhuǎn)移。AFP-L3對(duì)肝癌的診斷具有很高的準(zhǔn)確率。HCC的早期發(fā)現(xiàn)可 以為患者提供更多的治療機(jī)會(huì)，如肝癌治療最有效的外科切除術(shù)，介入治療等。目前，我國(guó)政府正式將AFP-L3檢測(cè)納入醫(yī)保項(xiàng)目，人們期待操作簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定 性好、重復(fù)性好的AFP-L3檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種磁分離法主導(dǎo)的快速肝癌甲胎蛋白變異體(AFP-U)檢測(cè)試 劑盒，本發(fā)明還提供一種上述磁分離法主導(dǎo)的快速肝癌甲胎蛋白變異體(AFP-U)檢測(cè) 試劑盒的制備方法。
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本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種上述磁分離法主導(dǎo)的快速肝癌甲胎蛋白變異 體(AFP-L3)檢測(cè)試劑盒的用途。本發(fā)明的磁分離法主導(dǎo)的快速肝癌甲胎蛋白變異體(AFP-U)檢測(cè)試劑盒含有如 下的物質(zhì)含有凝集素修飾的磁珠作為固相載的緩沖液、清洗緩沖液和洗脫緩沖液。進(jìn)一 步的描述如下一種磁分離法主導(dǎo)的快速肝癌甲胎蛋白變異體的檢測(cè)試劑盒，其特征在于， 所述試劑盒含有如下物質(zhì)(1) 一種含有0. 5% -10%重量的凝集素修飾的磁珠作為固相載 體的PH為7. 1-7. 9的緩沖液，其中凝集素修飾的磁珠和其上所含的凝集素的重量百分比為 4-200 1 ；所述的緩沖液含有25mM的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-Hcl)、25mM的氯化鈉 (NaCl)、2mM的氯化鎂(MgCl2)和2mM的氯化鈣(CaCl2)的水溶液；(2) 一種pH為7. 1-7. 9 的清洗緩沖液，上述的清洗緩沖液含有50mM的Tris-Hcl、50mM的NaCl、2mM的MgCl2和2mM 的CaCl2的水溶液；(3)和一種pH為6. 5-7. 0的洗脫緩沖液；上述的洗脫緩沖液含有0. 25M 的甲基-a-D-甘露糖(Ethy 1-a-Mannopyranoside)、50mM 的 Tris-Hcl 和 0. 5M 的 NaCl 的水 溶液。所含有的成分及應(yīng)用方法為使用凝集素修飾的磁珠作為固相載體在結(jié)合緩沖 液中與待測(cè)樣品中的AFP-L3結(jié)合；在清洗緩沖液中將AFP-L3與凝集素修飾的磁珠分離； 在洗脫緩沖液中將凝集素修飾的磁珠上結(jié)合的AFP-L3洗脫下來(lái)；最后利用檢測(cè)系統(tǒng)對(duì) AFP-L3進(jìn)行定性或定量的檢測(cè)。本發(fā)明所提供試劑盒中凝集素修飾的磁珠具有超順磁和相應(yīng)的磁場(chǎng)響應(yīng)性，凝集 素修飾的磁珠可穩(wěn)定的在水溶液中或水與乙醇的混合溶液(乙醇的重量為1-40% )中存在 和保存，磁珠粒徑在I-IOOOOOnm之間，其中優(yōu)選為300-30000nm，磁珠和凝集素的重量百分 比為200-4 1，優(yōu)選為40-4 1。所述的凝集素包括扁豆凝集素、大豆凝集素、花生凝集素、刀豆素A、麥胚素、蓖麻 凝集素、豌豆凝集素、菜豆凝集素、荊豆凝集素、雙花扁豆凝集素或槐凝集素等，是從相應(yīng)的 植物種子中提取的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白。一種凝集素具有對(duì)某一種特異性糖基專一性結(jié) 合的能力，如扁豆與D-甘露糖、D-葡萄糖，大豆與D-半乳糖，花生與D-半乳糖、Gal (1 — 3)， 刀豆與D-葡萄糖、D-甘露糖，豌豆與D-甘露糖，荊豆與L-巖藻糖結(jié)合等。其中，優(yōu)選為扁 豆凝集素。本發(fā)明所述的試劑盒，其中所述凝集素修飾的磁珠的制備方法包括吸附、偶聯(lián)或 包裹。其中的優(yōu)選方法為將含有氨基或羧基的固含量為0. 5% -30%磁珠與凝集素混合， 加入縮合劑反應(yīng)0.5-48小時(shí)，磁分離洗滌；所述的磁珠與縮合劑的質(zhì)量比是1-5 1-20 ； 所述的磁珠與親和吸附劑混合的質(zhì)量比是1-15 1-5;所述的磁珠與縮合劑的質(zhì)量比是 1-5 1-20;所述的縮合劑是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N，N”-羰基 二咪唑、二環(huán)己基碳二亞胺、4- 二甲氨基吡啶或N-羥基琥珀酰亞胺中的一種或兩種。本發(fā)明所述的試劑盒可用于檢測(cè)相當(dāng)一部分肝細(xì)胞肝癌(HCC)病人特有的 AFP-L3。本發(fā)明所述試劑盒的使用步驟如下(1)取500 μ I-Iml凝集素修飾的磁珠，磁分離2_5分鐘后，棄上清液；(2)在磁珠中加入500ul_lml結(jié)合緩沖液平衡反應(yīng)系統(tǒng)，磁分離2_5分鐘后，棄上
清液；
(3)在磁珠中加入475 μ l-900ul的結(jié)合緩沖液，得混合液A ；將50ul_100ul病人 血清或肝腹水加入到混合液A中，混合均勻，靜置5-10分鐘；磁分離，棄上清；(4)在磁珠中加入500ul_lml的Tris-Hcl清洗緩沖液清洗5 6次(旋轉(zhuǎn)清洗)， 磁分離，棄上清；(5)在磁珠中加入500 μ I-Iml的含甲基_a_D_甘露糖的Tris-Hcl洗脫緩沖液，充 分混勻，室溫靜置5-10分鐘，磁分離，收集上清，為AFP-L3分離液；用酶標(biāo)法或化學(xué)發(fā)光法 定性或定量檢測(cè)AFP-L3分離液。本發(fā)明所述試劑盒中的結(jié)合緩沖液的配置方法為稱取3. Og三羥甲基氨基甲烷、 1. 45g氯化鈉、0. 4g氯化鎂、0. 22g氯化鈣溶解于950ml蒸餾水中，加入少量濃鹽酸，調(diào)節(jié)pH 值在7. 1-7. 9之間；再加蒸餾水終體積至1000ml，最終各物質(zhì)的濃度為25mM的Tris-Hcl、 25mM的NaCl、2mM的MgCl2、2mM的CaCl2、。該緩沖液起平衡反應(yīng)系統(tǒng)，加強(qiáng)凝集素修飾的磁 珠與AFP-L3糖基結(jié)合作用。本發(fā)明所述試劑盒中的清洗緩沖液的配置方法為稱取6. 05g三羥甲基氨基甲 烷、2. 9g氯化鈉、0. 4g氯化鎂、、、0. 22g氯化鈣溶解于950ml蒸餾水中，加入少量濃鹽酸， 調(diào)節(jié)PH值在7. 1-7. 9之間；再加蒸餾水終體積至1000ml，最終各物質(zhì)的濃度為5OmM的 Tris-Hcl,50mM 的 NaCl、2mM 的 MgCl2、2mM 的 CaCl2、。該緩沖液起清洗作用。本發(fā)明所述試劑盒中的洗脫緩沖液的配置方法為稱取6. 05g三羥甲基氨基 甲烷、29g NaCl,48. 5g甲基_a_D_甘露糖溶解于950ml蒸餾水中，加入少量濃鹽酸，調(diào) 節(jié)pH值在6. 5-7. 0之間；再加蒸餾水終體積至1000ml，最終各物質(zhì)的濃度為0. 25M的 Ethyl-a-Mannopyranoside、50mM 的 Tris_Hcl、0. 5M 的 NaCl。該緩沖液能解離凝集素與 AFP-L3糖基的結(jié)合，起到分離AFP-L3的效果。本發(fā)明所述試劑盒中的檢測(cè)系統(tǒng)主要為對(duì)AFP-L3所進(jìn)行的定性或定量的檢測(cè)方 法，其中包括使(但不限于)用金標(biāo)試紙條對(duì)AFP-L3進(jìn)行定性或半定量檢測(cè)，使用(但不 限于)ELISA或化學(xué)發(fā)光法或螢光法等對(duì)AFP-L3進(jìn)行定量檢測(cè)。本發(fā)明應(yīng)用磁性微球快速分離AFP-L3，進(jìn)行定性/定量測(cè)定AFP-L3方法，具有操 作簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。經(jīng)檢測(cè)比較，本發(fā)明的AFP-L3檢測(cè)， 總體使用效果優(yōu)于目前已使用的AFP-L3凝集素雙向電泳法及親和吸附法等方法，還可的 作為自動(dòng)化分離及定量測(cè)定AFP-L3，有利普及推廣，更具有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。因此，本發(fā)明可發(fā) 展成為新一代快速檢測(cè)AFP變異體的試劑盒。為肝癌的預(yù)防、診斷、治療提供支持。為盡早 的發(fā)現(xiàn)肝癌患者，提高肝癌患者的生存率及延長(zhǎng)其生存期，發(fā)揮臨床應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但是不能限制本發(fā)明的內(nèi)容。本發(fā)明中采用的磁珠或者凝集素修飾的磁珠可以從上海奧潤(rùn)微納新材料科技有 限公司和陜西北美基因股份有限公司購(gòu)買得到，也可以通過(guò)實(shí)施例1-3獲得。實(shí)施例中采 用的正常人血清標(biāo)本110例來(lái)源于腫瘤研究所體檢血清；慢性乙肝300例及肝硬化200例 標(biāo)本來(lái)自上海市徐匯區(qū)大華醫(yī)院；肝癌標(biāo)本200份來(lái)自解放軍四五五醫(yī)院、上海市徐匯區(qū) 大華醫(yī)院、啟東肝癌防冶研究所、湖南湘西中醫(yī)醫(yī)院。孕婦血清20份來(lái)自上海市長(zhǎng)寧區(qū)婦 幼保健院。所有新鮮血清分離后置-20°C保存至檢測(cè)。
實(shí)施例1凝集素修飾的磁珠的制備取固含量為20%的氨基或羧基化磁珠(粒徑300nm)溶液ImL與含有2mg扁豆凝 集素的溶液ImL混合，加入5mg 1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽，混合均勻， 室溫?cái)嚢璺磻?yīng)48小時(shí)后，磁分離洗滌后備用，所制備的凝集素修飾的磁珠當(dāng)中磁珠與所含 的凝集素的重量百分比為25 1，其可放置在水與乙醇的混合溶液(乙醇的重量為20% ) 中保存。本實(shí)施例可擴(kuò)展為固含量為0. 5% -30%的氨基或羧基化磁珠。實(shí)施例2凝集素修飾的磁珠的制備取固含量為20%的氨基或羧基化磁珠(粒徑IOOOOnm)溶液ImL與含有2mg扁豆 凝集素的溶液ImL混合，加入5mg 二環(huán)己基碳二亞胺，混合均勻，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)M小時(shí)后， 磁分離洗滌后備用，所制備的凝集素修飾的磁珠當(dāng)中磁珠與所含的凝集素的重量百分比為 50 1，其可放置在水與乙醇的混合溶液(乙醇的重量為10%)中保存。本實(shí)施例可擴(kuò)展 為使用1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N, N” -羰基二咪唑、二環(huán)己基碳二 亞胺、4- 二甲氨基吡啶或N-羥基琥珀酰亞胺中的一種或兩種縮合劑。 實(shí)施例3凝集素修飾的磁珠的制備取固含量為20%的不含有氨基或羧基化磁珠(粒徑500nm)溶液lmL，先凍干后 再與含有2mg花生凝集素的溶液ImL混合，充分振蕩混合均勻，室溫孵化48小時(shí)后，磁分 離洗滌后備用，所制備的凝集素修飾的磁珠當(dāng)中磁珠與所含的凝集素的重量百分比為 200 1。本實(shí)施例可擴(kuò)展為使用扁豆凝集素、大豆凝集素、刀豆素A、麥胚素、蓖麻凝集素、 豌豆凝集素、菜豆凝集素、荊豆凝集素、雙花扁豆凝集素或槐凝集素中的一種或2-4種。實(shí)施例4凝集素修飾的磁珠的應(yīng)用1.測(cè)試方法主要過(guò)程500 μ I-Iml的凝集素修飾的磁珠，磁分離1_2分鐘后，棄上清液，加入 500ul-lml結(jié)合緩沖液平衡反應(yīng)系統(tǒng)，磁分離2-5分鐘后，棄上清液。加入450 μ 1 (結(jié)合緩沖 液)25mM Tris-Hcl、25mM NaCl，、2mM MnCl、2mM CaCl2, pH7. 1 pH7. 9，得混合液 Α。將病人 血清加入到混合液A中，混合均勻，靜置10分鐘；磁分離，棄上清，加入500 μ 1-1000 μ 1 (清 洗緩沖液)50mM Tris-Hcl,2mM MnCl2,2mM CaCl2, ρΗ7· 1_ρΗ7· 9，清洗 5-6 次，力口 入 250 μ 1-500 μ 1 (洗脫緩沖液液)0. 25ΜΕthy 1 -a-mannopyranoside>25mM Tris_Hcl、50mM NaCl,pH6. 5_pH7. 0，充分混勻，室溫靜置5分鐘。磁分離，收集上清，為AFP-L3分離液；化學(xué) 發(fā)光法定量檢測(cè)AFP-L3分離液(或用金標(biāo)試紙條進(jìn)行定性或半定量的檢測(cè))。注由于凝集素修飾的磁珠保存液含有20%乙醇，因此操作時(shí)，必須用結(jié)合緩沖 液清洗1-2次進(jìn)行平衡。2.凝集素修飾的磁珠分離AFP-L3定量測(cè)定部分病例結(jié)果的分析其中凝集素修飾的磁珠可從陜西北美基因股份有限公司購(gòu)買或采用實(shí)施例1的 方法制備。
權(quán)利要求
1.一種磁分離法主導(dǎo)的快速肝癌甲胎蛋白變異體的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試 劑盒含有如下物質(zhì)(1) 一種含有0.5%-10%重量的凝集素修飾的磁珠作為固相載體的PH 為7. 1-7. 9的結(jié)合緩沖液，其中，所述的凝集素為扁豆凝集素、大豆凝集素、花生凝集素、刀 豆素A、麥胚素、蓖麻凝集素、豌豆凝集素、菜豆凝集素、荊豆凝集素、雙花扁豆凝集素或槐凝 集素；凝集素修飾的磁珠和磁珠所含的凝集素的重量百分比為4-200 1;所述的緩沖液含 有25mM的Tris-Hcl、25mM的氯化鈉、2mM的氯化鎂和2mM的氯化鈣的水溶液；(2) —種pH 為7. 1-7. 9的清洗緩沖液，上述的清洗緩沖液含有50mM的1Tris-HcljOmM的氯化鈉、2mM的 MgCl2和2mM的CaCl2的水溶液；(3)和一種pH為6. 5-7. 0的洗脫緩沖液；上述的洗脫緩沖 液含有0. 25M的甲基-a-D-甘露糖、50mM的Tris-Hcl和0. 5M的氯化鈉的水溶液；所述的 Tris為三羥甲基氨基甲烷。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的凝集素修飾的磁珠粒徑在 I-IOOOOOnmo
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的凝集素修飾的磁珠粒徑為 300-30000nm。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的凝集素修飾的磁珠和凝集素的重 量百分比為4-200 1。
5.如權(quán)利要求1或4所述的試劑盒，其特征在于，所述的凝集素為扁豆凝集素.
6.一種如權(quán)利要求1所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，(1)所述凝集素修飾的磁珠的制備方法包括吸附、偶聯(lián)或包裹的方法，或者將含有或不 含有氨基或羧基的固含量為0. 5% -30%磁珠與凝集素混合，加入縮合劑反應(yīng)0. 5-48小時(shí)， 磁分離洗滌除去未反應(yīng)的縮合劑；所述的磁珠與縮合劑的質(zhì)量比是1-5 1-20;所述的磁 珠與親和吸附劑混合的質(zhì)量比是1-15 1-5;所述的縮合劑是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙 基碳二亞胺鹽酸鹽、N, N”-羰基二咪唑、二環(huán)己基碳二亞胺、4-二甲氨基吡啶或N-羥基琥 珀酰亞胺中的一種或兩種；所述的縮合劑如權(quán)利要求1所述；(2)所述的結(jié)合緩沖液的配置方法為稱取3.Og三羥甲基氨基甲烷、1.45g氯化鈉、 0. 4g氯化鎂、0. 22g氯化鈣溶解于950ml蒸餾水中，加入少量濃鹽酸，調(diào)節(jié)pH值在7. 1-7. 9 ； 再加蒸餾水終體積至1000ml、；(3)將(1)的凝集素修飾的磁珠和(2)的結(jié)合緩沖液配置成為有0.5% -10%重量的凝 集素修飾的磁珠作為固相載體的PH為7. 1-7. 9緩沖液；(4)所述的清洗緩沖液的配置方法為稱取6.05g三羥甲基氨基甲烷、2. 9g氯化 鈉、0. 4g氯化鎂、、、0. 22g氯化鈣溶解于950ml蒸餾水中，加入少量濃鹽酸，調(diào)節(jié)pH值在 7. 1-7. 9 ；再加蒸餾水終體積至IOOOml ；(5)所述的洗脫緩沖液的配置方法為稱取6.05g三羥甲基氨基甲烷、29g氯化鈉、 48. 5g甲基-a-D-甘露糖溶解于950ml蒸餾水中，加入少量濃鹽酸，調(diào)節(jié)pH值在6. 5-7. 0 ； 再加蒸餾水終體積至1000ml。
7.—種如權(quán)利要求1所述的試劑盒的用途，其特征在于，所述的試劑盒用于檢測(cè)肝癌 甲胎蛋白變異體。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒的用途，其特征在于，所述的試劑盒的使用是將凝集 素修飾的磁珠作為固相載體在結(jié)合緩沖液中與待測(cè)樣品中的AFP-L3結(jié)合；在清洗緩沖液中將AFP-L3與凝集素修飾的磁珠分離；在洗脫緩沖液中將凝集素修飾的磁珠上結(jié)合的 AFP-L3洗脫下來(lái)；利用檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)洗脫下來(lái)AFP-L3進(jìn)行定性或定量的檢測(cè)。
9.如權(quán)利要求5或8所述的試劑盒的用途，其特征在于，所述的試劑盒的使用(1)取 500 μ I-Iml含有0. 5% -10%重量的凝集素修飾的磁珠的ρΗ為7. 1-7. 9的緩沖液，在放置 磁鐵的磁架上靜置進(jìn)行磁分離2-5分鐘后，棄上清液獲得含有70% -99. 8%重量的凝集素 修飾的磁珠；(2)在(1)獲得的磁珠中加入500ul-lmlpH為7.1_7. 9的結(jié)合緩沖液，充分混勻平衡反 應(yīng)系統(tǒng)后，在放置磁鐵的磁架上靜置進(jìn)行磁分離2-5分鐘后，棄上清液；(3)在(2)獲得的磁珠中加入475μ l-900ul的ρΗ為7. 1-7. 9結(jié)合緩沖液，得混合液 A ；將25ul-100ul血清或肝腹水樣品加入到混合液A中，混合均勻，靜置5_10分鐘；在放置 磁鐵的磁架上靜置進(jìn)行磁分離2-5分鐘后，棄上清；(4)在(3)獲得的磁珠中加入500ul-lmlpH為7.1-7. 9的的Tris-Hcl清洗緩沖液清洗 5-6次(旋轉(zhuǎn)清洗)，在放置磁鐵的磁架上靜置進(jìn)行磁分離2-5分鐘后，棄上清；(5)在(4)獲得的磁珠中加入500μ I-Iml的含甲基_a_D_甘露糖的Tris-Hcl ρΗ為 6. 5-7. 0的洗脫緩沖液，充分混勻，室溫靜置5-10分鐘，在放置磁鐵的磁架上靜置進(jìn)行磁分 離2-5分鐘后，收集上清液，為含有肝癌甲胎蛋白變異體的分離液；(6)用金標(biāo)試紙條對(duì)( 獲得的肝癌甲胎蛋白變異體分離液進(jìn)行定性或半定量檢測(cè)， 或者用酶標(biāo)法、化學(xué)發(fā)光法或螢光法進(jìn)行定性或定量檢測(cè)(5)獲得的肝癌甲胎蛋白變異體 分離液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速磁分離法主導(dǎo)的肝癌甲胎蛋白變異體(AFP-L3)檢測(cè)試劑盒。制備方法和用途。所述試劑盒含有如下物質(zhì)(1)一種含有0.5％-10％重量的凝集素修飾的磁珠作為固相載體的pH為7.1-7.9的結(jié)合緩沖液；(2)一種pH為7.1-7.9的清洗緩沖液；(3)一種pH為6.5-7.0的洗脫緩沖液。該試劑盒可以簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)肝肝癌甲胎蛋白變異體。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102147415SQ20101061936
公開(kāi)日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者梁曉飛, 洪錦興, 王維林, 薛建祥, 許凱黎, 陳復(fù)華 申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所