專利名稱：一種華支睪吸蟲病elisa診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明描述了ー種華支睪吸蟲病ELISA診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
華支睪吸蟲病是ー種人獸共患寄生蟲病，成蟲寄生在肝膽管內(nèi)，成蟲會破壞膽道上皮和粘膜下血管，并產(chǎn)生分泌排泄抗原，引起膽管和膽管周圍的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致膽管局限性擴(kuò)張和膽管上皮細(xì)胞增生。ー些抗原成分還能夠通過膽管上皮細(xì)胞進(jìn)入肝組織，引起炎癥反應(yīng)和肝功能損傷。長期的嚴(yán)重感染會導(dǎo)致纖維組織增生和肝細(xì)胞的萎縮變性，甚至引起癌變、腹水和肝硬化。肝吸蟲阻塞膽管，使膽汁流出不暢，易合并細(xì)菌感染和出現(xiàn)膽石癥。肝吸蟲病的防治主要依靠綜合防治措施。在流行區(qū)強(qiáng)化對人群的普查普治，并加強(qiáng)疫苗的研制，以減少傳染源和保護(hù)易感人群。目前，肝吸蟲病防治研究的重點(diǎn)集中在診斷和疫苗候選抗原、藥物靶標(biāo)、致病的分子機(jī)理研究。轉(zhuǎn)移酶類是催化底物之間進(jìn)行某些基團(tuán)的轉(zhuǎn)移或交換的酶類，是生物體內(nèi)肝細(xì)胞結(jié)合反應(yīng)(屬第二相反應(yīng))中重要的催化劑之一。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST) (EC2. 5. 1. 18)是廣泛存在于各種生物體內(nèi)的由多個(gè)基因編碼的、多功能的同エ酶，是催化谷胱甘肽與多種親電子化合物連接的酶家族，構(gòu)成酶的亞單位至少有7 個(gè)，大部分酶存在于細(xì)胞質(zhì)中以同ニ聚體或異ニ聚體形式存在。GSTs在生物體中的重要功能之ー是對內(nèi)、外源性毒物的解毒作用。包括人在內(nèi)的生物體都暴露在大量外源化合物存在的環(huán)境中，ー些化合物在代謝活化后有親電子反應(yīng)性，導(dǎo)致與內(nèi)源性分子共價(jià)結(jié)合，蛋白質(zhì)是重要的生物大分子，外源分子與其結(jié)合后經(jīng)常改變其功能。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶主要通過酶催化作用促使谷胱甘肽與有害異物結(jié)合，或以非酶結(jié)合方式將體內(nèi)各種具有潛在毒性的化學(xué)物質(zhì)、染料、致癌物從體內(nèi)排出，從而達(dá)到解毒目的，近年來發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶對于研究肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸和預(yù)防有重要意義。 其催化反應(yīng)特性決定了其在防止脂質(zhì)過氧化損傷擴(kuò)大、抵御及修復(fù)DNA損傷以降低腫瘤發(fā)生以及癌細(xì)胞耐藥性形成等方面的重要作用。GSTs是抗惡性瘧原蟲潛在的藥物靶標(biāo)，蠕蟲的GSTs參與對由蟲體代謝和宿主免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物和細(xì)胞毒性的羰基的解毒，也被認(rèn)為是免疫療法和化學(xué)療法的ー個(gè)潛在的靶標(biāo)。其中，主要定位于成蟲實(shí)質(zhì)的血吸蟲GST-沈和GST-28，是WHO提出的 6個(gè)最具潛力的候選疫苗分子之一。在大腸桿菌中表達(dá)惡性瘧原蟲的重組GST有催化活性。 華支睪吸蟲的^KDa GST和^kDa GST的編碼基因在原核表達(dá)也有催化活性，并且重組的 26kDaGST可用于檢測IgG和IgE抗體。因而，原核表達(dá)有活性的重組GST是可行的.并且易于得到大量的重組蛋白質(zhì)以用于功能研究。本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，從華支睪吸蟲中分離了編碼谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶 2DNA，并表達(dá)純化了谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2，并進(jìn)一歩掲示了基于此多核苷酸與多肽的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在提供分離的華支睪吸蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2及其制備與應(yīng)用的基礎(chǔ)上，提供一種華支睪吸蟲病ELISA診斷試劑盒。本發(fā)明公開了ー種分離的華支睪吸蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2，它是具有SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含華支睪吸蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2編碼 DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技木、DNA 合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的Iac或trp啟動子；入噬菌體PL 啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晩期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRS和其他ー些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的ニ氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗?，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞大腸桿菌BL21/DE3 ；或是低等真核細(xì)胞， 如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CH0， COs. 293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞等。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另ー種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。前述分離的華支睪吸蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2的制備方法，一般來說有以下步驟(1) 用編碼本發(fā)明的華支睪吸蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；( 在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞； (3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)) 誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例列舉的，一個(gè)恰當(dāng)?shù)闹苽淙A支睪吸蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2的方法為1)將華支睪吸蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2的編碼基因克隆入原核表達(dá)載體 pET-30a(+)；2)將重組的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21/DE3感受態(tài)細(xì)胞后篩選陽性克?。?)大腸桿菌BL21/DE3的誘導(dǎo)表達(dá)；4)收集大腸桿菌BL21/DE3的誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)液上清，經(jīng)親和層析獲得純化的蛋白。上述華支睪吸蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2可用于制備華支睪吸蟲病診斷試劑盒。華支睪吸蟲病的診斷除了常規(guī)的病原生物學(xué)檢查，主要的方法是使用免疫學(xué)診斷試劑盒。主要有兩類酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA)和快速免疫膠體金試劑盒(ICT)。華支睪吸蟲病的診斷即可通過檢測血清或尿液中的循環(huán)抗原判斷現(xiàn)癥感染，也可通過檢測血清或唾液中的特異性抗體來快速篩查。由于華支睪吸蟲主要是寄生在組織外，所產(chǎn)生的抗原成分絕大部分隨著膽汁排入腸道，只有感染度高，蟲體對膽管阻塞嚴(yán)重，引起膽管上皮嚴(yán)重破損時(shí)，其分泌排泄物才能進(jìn)入肝臟和外周血中。進(jìn)入外周血中的循環(huán)抗原大部分被抗體所中和，只有少量游離的循環(huán)抗原可被檢測到。因此，檢測循環(huán)抗原的方法雖然能反映現(xiàn)癥感染，但是敏感性較低。目前，臨床用于輔助診斷的主要是抗體檢測試劑盒。檢測抗體的方法分為兩種，ー是用標(biāo)記ニ抗作為檢測試劑與被包被在反應(yīng)板或反應(yīng)膜上的抗原所捕獲的抗體相結(jié)合，一種是用標(biāo)記的抗原作為檢測試劑。ニ抗作為檢測試劑，一般只能檢測ー種抗體，而且非特異性結(jié)合比較高；標(biāo)記抗原作為檢測試劑，能檢測多種抗體，特異性更高。本發(fā)明公開了ー種華支睪吸蟲病ELISA診斷試劑盒，包括ELISA反應(yīng)板、陰性對照、陽性對照、酶標(biāo)記物、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、底物A液、底物B液和終止液，其中， ELISA反應(yīng)板上包被有上述華支睪吸蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2，所述酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgG4 ニ抗。所述華支睪吸蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2為基因工程重組表達(dá)的華支睪吸蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2。較佳的，樣品稀釋液的配方為0. 1 % BSA (0. lg/100ml) +0. 05 %吐溫-20 (ν/ v)+PBS(PH7. 2)。進(jìn)ー步的，樣品稀釋液中還含有防腐劑如硫柳汞0. 01% (0. 01g/100ml)。 濃縮洗滌液的配方為PH7. 8的Tris-HCl緩沖液。陰性對照可以為華支睪吸蟲病非流行區(qū)，無吃魚生史，經(jīng)驗(yàn)證未患華支睪吸蟲病的正常人血清；陽性對照可以為華支睪吸蟲病流行區(qū)，有吃魚生史，經(jīng)驗(yàn)證患華支睪吸蟲病的病人血清。本發(fā)明的華支睪吸蟲病診斷試劑盒的使用方法，包括下列步驟1).配液將濃縮洗滌液稀釋配制成洗滌液；2).加樣分別在ELISA反應(yīng)板的相應(yīng)孔中加入待測樣品或明、陽性對照并用樣品稀釋液稀釋；3).孵育用封板膜封板后置37°C孵育30分鐘；4).用洗滌液洗滌后每孔加入酶標(biāo)記物；5).孵育用封板膜封板后置37°C孵育30分鐘；6).用洗滌液洗滌，拍干后每孔加入底物A、B液混勻后，37°C避光顯色；7).測定每孔加入終止液混勻后測定各孔OD值。
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本發(fā)明的華支睪吸蟲病診斷試劑盒以谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2作為診斷抗原，采用酶聯(lián)免疫吸附法(間接法)檢測華支睪吸蟲病人血清中的IgG4抗體，其ー抗血清和ニ抗酶標(biāo)記物的孵育時(shí)間各需30分鐘。


圖-1重組蛋白GST2的催化活性檢測中加入不同體積重組GST2的產(chǎn)物-時(shí)間曲線
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實(shí)例并非用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2的克隆用NCBI的ORF FINDER程序?qū)ふ襏nigene中完整的開放閱讀框(ORF)，用BLASTx 程序判定是否為全長基因，其中的全長基因是已知基因還是新基因，編號為C003el0a的最大的ORF為639bp，我們將它簡稱為GST2.1)華支睪吸蟲基因組的提取從貓肝中收集10條華支睪吸蟲成蟲，PBS洗浄后，離心去上清。勻漿后加入10倍體積的裂解緩沖液(STE，含2%SDS，0. 2mg/ml，蛋白酶K)，混勻，37°C水浴過夜。次日，將溶液放至室溫，加入等體積平衡酚，上、下輕輕顛倒約lOmin，室溫IOOOOrpm離心15min，取上層水相，重復(fù)抽提2次，取上層水相，加入0. 1倍體積的3mol/L醋酸鈉(pH5. 2)和2倍體積的無水乙醇，混勻，12000rpm離心lOmin，棄上清，70%乙醇洗兩次，12000rpm離心5min，棄上清，待乙醇揮發(fā)盡后，加 30 μ 1 TE(10mmol/LTris-HCI,lmmol/L EDTA，pH8. 0)溶解，取5ul 用瓊脂糖凝膠分析，余下樣品-20°C保存?zhèn)溆谩?)感受態(tài)細(xì)胞的制備從培養(yǎng)板上挑取BL21/DE3單菌落入5ml LB培養(yǎng)液中，37°C 250轉(zhuǎn)/分(rpm)振搖過夜。次日取150ul加至:3ml LB培養(yǎng)液中，37°C 250rpm振搖至A_ = 0. 6。取出菌液， 冰浴30min，4°C，4000rpm離心5min，棄上清，加入0. lmol/L的氯化鈣750 μ 1，冰浴30min， 4°C，4000rpm離心5min，棄上清，加入0. lmol/L的氯化鈣400 μ 1，分裝100 μ 1/管，4°C保存 Mh內(nèi)用或每管加入30 %滅菌甘油混勻后-70°C保存，3個(gè)月內(nèi)使用。3)GST2基因的擴(kuò)增與克隆1. 1基因的擴(kuò)增、原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定分別以文庫質(zhì)粒cDNA和基因組DNA為模板，上游引物Pl 為 5 ‘ GCGAATTCCACATGAAACACAGACACTGTG3 ‘，引入了兩個(gè)保護(hù)性堿基和EcoR I酶切位點(diǎn)；下游引物P2為5' CGGTCGACGTTAATCGTCGCCACAGTC3‘，引入了兩個(gè)保護(hù)性堿基和 Sal I酶切位點(diǎn)。用TaKaRa Ex Taq 酶擴(kuò)增該基因的反應(yīng)條件如下95°C預(yù)變性;3min，94°C變性 lmin，6rC退火50sec，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸8min。PCR產(chǎn)物用12g/ L的瓊脂糖凝膠電泳分析驗(yàn)證，獲得分子量為639bp的片段。PCR產(chǎn)物回收，進(jìn)行EcoR I和Sal I雙酶切，與進(jìn)行同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pET-30a(+)按物質(zhì)量比3_4 :1用T4DNA連接酶于16°C連接18h。取100 μ 1 BL21/DE3感受態(tài)細(xì)胞，加入上述連接產(chǎn)物，輕輕混勻后冰浴lh，42°C水浴90sec，冰浴5min，加入LB培養(yǎng)液400 μ 1，混勻后放入37°C水浴2min，37°C 150rpm搖lh。所有菌液鋪至經(jīng)預(yù)熱的含卡那霉素的LB平板中，在37°C溫箱倒置培養(yǎng)12-1他。含陽性質(zhì)粒的菌液用30%滅菌甘油-70°C凍存?zhèn)溆?。鑒定測序結(jié)果表明，克隆入pET_30a(+)的華支睪吸蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2的基因序列為 SEQ ID NO. 2。AATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCGAATTCCACATGAAACACAGACACTGTGCGCTATTCTATTTCAACGTCCGTGGCAGAGCTGAGGCGATTAGGATGGTACTGCACGCTAACGATGTTTCGTTTGAGGATGTGCGTTTCGATAAGGACCAATGGTCTGAACGCAAACACGAGTTTCCGGGTGGTAAATTACCGCTTCTCCAAGTAAGAGAAGAGGGATCACAAGAGAAGAAGACTTATACAGAGAGCATGGCGATCGCCCGAGTGCTCGCAAAACACTACAGTATGATGGGCGATTCTGAAGAGGAATATTACAAGATTGAACGAATGATTGGGCAGTGTGCCGATTTGGATAAGGAGTTTGTCAATGTCTTTTTCGCACGAGAAGACCAAAAGAAAGAAGTACTTGAGAAAGCAATGGGTGGAGAGGTGCCGAGACTACTGGAACTTATTTGCAAATCACTCTCTGAATCTGGTGGCAAGTTCGTCGCTGGTAACAAAGTAACTCTTGGAGACATATGCCTTATGGCATCCATGGAAAATGTACGGAGAGCGGACCCTCAGCTTTTGAAAACGAAATATTCGACATTATTGGCCCTCGAGGCGGAGGTGTTCAAGGTCCTGCCGAAACTTGCGGACTACGTCAAAACACGACCAGAAACCGTCCTGTGAAGCAGACTGTGGCGACGATTAACGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGT1. 2CsGST2基因在大腸桿菌BL21/DE3的誘導(dǎo)表達(dá)以含空質(zhì)粒pET_30a(+)的BL21/DE3為陰性對照。含重組質(zhì)粒的pET-30a(+)-CsGST2的BL21/DE3接種于含有卡那霉素的培養(yǎng)基，37°C，250rpm，振蕩培養(yǎng)過夜后按10ml/L轉(zhuǎn)接，在37°C，250rpm，振蕩培養(yǎng)至々_ = 0. 6，取出Iml作為誘導(dǎo)前樣品，其余菌液加入IPTG(終濃度為lmmol/L)誘導(dǎo)培養(yǎng)4- ，取出Iml作為誘導(dǎo)后樣品。所有樣品4°C，8000rpm, 15min離心后收集菌體，少許沉淀加5 μ 1 DTT, 95 μ 1 IX SDS, 30 μ 1上清加2 μ 1 DTT,8y 1 4\503，重懸混勻，沸水浴511^11，沉淀13000印111離心11^11，上清稍點(diǎn)動即可，取上層液10μ 1行SDS-PAGE (分離膠150g/L，濃縮膠50g/L)，用考馬斯亮藍(lán)染色，觀察有表達(dá)后，蛋白在上清內(nèi)有表達(dá)，沉淀內(nèi)無表達(dá)，進(jìn)行大量表達(dá)及純化。1. 3CsGST2基因在大腸桿菌BL21/DE3的大量誘導(dǎo)表達(dá)37°C，250rpm，振蕩培養(yǎng)過夜的菌液按20ml/L的比例轉(zhuǎn)接至1000ml LB培養(yǎng)液中，37°C，250rpm，振蕩培養(yǎng)至A6tltl = 0. 6，加入IPTG (終濃度為lmmol/L)誘導(dǎo)培養(yǎng)4_5h，用4°C，8000rpm, 15min離心后棄盡上清培養(yǎng)液，收集菌體，加入1 X結(jié)合緩沖液(5mM咪唑+0. 5MNaCl+20mM Tris-HCl, PH7. 9) 12_15ml重懸混勻完全，收集，存于_20°C，次日超聲裂解細(xì)菌(功率 150W,持續(xù) Isec,停 2sec，共 15min)，4°C，13000rpm, 15min,收集上清，0. 45 μ m 微孔濾膜過濾。1.4親和層析純化蛋白Ni-NTA 樹脂，梯度濃度咪唑 20mM、30mM、40mM、60mM、200mM 及 400mM 咪唑?qū)⑾疵摮鰜淼腉ST2蛋白行SDS-PAGE驗(yàn)證為目的蛋白，取純度高、量大的收集在一起，裝入透析袋(透析液為1 X PBS, PH7. 4)，4°C透析24h (換液2_3次)。透析后的溶液用0. 22 μ m微孔濾膜過濾，分裝，_80°C保存?zhèn)溆?。鑒定蛋白測序結(jié)果表明，純化獲得蛋白(重組蛋白GST2)的序列為SEQ ID NO. 1。MKHRHCALFYFNVRGRAEAIRMVLHANDVSFEDVRFDKDQWSERKHEFPGGKLPLLQVREEGSQEKKTYTESMAIARVLAKHYSMMGDSEEEYYKIERMIGQCADLDKEFVNVFFAREDQKKEVLEKAMGGEVPRLLELICKSLSESGGKFVAGNKVTL⑶ICLMASMENVRRADPQLLKTKYSTLLALEAEVFKVLPKLADYVKTRPETVL。1. 5谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2活性測定重組蛋白催化活性研究1).重組蛋白GST2的定量用Bradford法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)(參見Bradford MM. A rapid andsensitivemethod for the quantitation of protein utilizing the principle ofprotein-dye binding. AnalytBiochem, 1976, 72 :248-254)。2).試劑的配制CDNB用無水乙醇配制成20mmol/L溶液。GSH用水配制成20mmol/L溶液。3).反應(yīng)體系為0. lmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6. 5)，GSH, CDNB,重組蛋白，反應(yīng)體積為3ml,反應(yīng)溫度為25°C (在加入無水乙醇配制的試劑時(shí)，應(yīng)注意無水乙醇的體積不超過反應(yīng)總體積
) ( Habig WH, Pabst MJ, Jacoby WB. Glutathione S-transferase :thefirstenzymatic mercapturic acid formation. J Biol Chem, 1974, 249 :7130-7139.)?？瞻讓φ沼?. lmol/L磷酸鈉緩沖液，所有孵育反應(yīng)做三管，取平均值。測最大反應(yīng)速度時(shí)，以僅不加重組蛋白的反應(yīng)體系作陰性對照，以華支睪吸蟲成蟲粗酶作陽性對照。用先加有緩沖液、GSH和⑶NB的反應(yīng)體系(GSH和⑶NB的終濃度均為lmmol/L)在25°C水浴中孵育5min，加入不同體積重組蛋白啟動反應(yīng)，測定l-5min的A34tl。選定合適的重組蛋白量后，用僅不加CDNB的反應(yīng)體系作陰性對照，將加有GSH(終濃度lmmol/L)、重組蛋白和緩沖液的反應(yīng)體系在25°C水浴中孵育5min，加入不同濃度⑶NB啟動反應(yīng)，測在25V反應(yīng)5min的A34tl,根據(jù)產(chǎn)物S-O，4-二硝基苯)谷膚甘肽⑵的毫摩爾消光系數(shù)Ae = 9. 6L.mmo F1-Cm-1,計(jì)算酶的活性單位(參見Habig WH, Pabst MJjJacoby WB. GlutathioneS-transferase :thefirst enzymatic mercapturic acid formation. J Biol Chem,1974,249 :7130-7139.)。米氏常數(shù)Km根據(jù)米氏方程用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13. O以底物濃度的倒數(shù)作為自變量、速度的倒數(shù)作為應(yīng)變量進(jìn)行線性回歸計(jì)算獲得。4).重組蛋白GST2的催化活性在l-5min內(nèi)，加入1、5、10μ 1的重組蛋白GST2，生成產(chǎn)物量不同，如圖_1所示，當(dāng)加入5 μ 1或10 μ 1 GST2反應(yīng)5min，產(chǎn)物的量不再隨時(shí)間的延長而增加，GST2的活性單位為 22. 76 士 0. 096 μ mol .mg-1 .InirT1tj 5μ 1 GST2 在 25°C 催化不同濃度 CDNB 反應(yīng) 5min A340的上升值見表-1，同上處理數(shù)據(jù)得到GST2的平均Km為111 μ mol。 5 μ 1 GST2催化不同濃度CDNB的A340
權(quán)利要求
1.一種華支睪吸蟲病診斷試劑盒，包括ELISA反應(yīng)板、陰性對照、陽性對照、底物A液、 底物B液、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和終止液，其特征在干，所述ELISA反應(yīng)板上包被有華支睪吸蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2，所述華支睪吸蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2是具有SEQ IDN0. 1的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽，所述酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgG4 ニ杭。
2.如權(quán)利要求1所述華支睪吸蟲病診斷試劑盒，其特征在干，所述樣品稀釋液由重量體積百分比為0. 1% BSA、體積百分比為0. 05%吐溫-20和pH7. 2的PBS混合配制而成。
3.如權(quán)利要求2所述華支睪吸蟲病診斷試劑盒，其特征在干，所述樣品稀釋液中還含有防腐剤。
4.如權(quán)利要求1所述華支睪吸蟲病診斷試劑盒，其特征在干，所述濃縮洗滌液為PH7.8 的Tris-HCl緩沖液。
5.如權(quán)利要求1-4任一所述華支睪吸蟲病診斷試劑盒，其特征在干，所述華支睪吸蟲病診斷試劑盒中還包括封板膜及說明書。
6.如權(quán)利要求1-5任一所述華支睪吸蟲病診斷試劑盒的使用方法，包括下列步驟1).將濃縮洗滌液稀釋配制洗滌液；2).分別在ELISA反應(yīng)板的相應(yīng)孔中加入待測樣品或明、陽性對照并用樣品稀釋液稀釋；3).用封板膜封板后置37°C孵育；4).用洗滌液洗滌ELISA反應(yīng)板后每孔加入酶標(biāo)記物；5).用封板膜封板后置37°C孵育；6).用洗滌液洗滌ELISA反應(yīng)板后每孔加入底物A、B液混勻，37°C避光顯色；7).每孔加入終止液混勻后測定各孔OD值。
7.如權(quán)利要求6所述華支睪吸蟲病診斷試劑盒的使用方法，其特征在干，步驟3和5中的孵育時(shí)間僅需30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種華支睪吸蟲病ELISA診斷試劑盒，包括ELISA反應(yīng)板、陰性對照、陽性對照、底物A液、底物B液、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和終止液，所述ELISA反應(yīng)板上包被有華支睪吸蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2，所述華支睪吸蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2是具有SEQIDNO.1的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽，所述酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgG4二抗。本發(fā)明的華支睪吸蟲病診斷試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，可較好地運(yùn)用與華支睪吸蟲病的診斷,本試劑盒的主要試劑均采用工作液形式，可直接使用，較傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷方法有很大的優(yōu)勢操作準(zhǔn)確、簡便、結(jié)果可信。
文檔編號G01N33/573GK102565398SQ20101061949
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者伍忠鑾, 余新炳, 吳英松, 徐勁, 李來慶, 梁熾, 王征, 胡慧霞, 胡旭初, 董志寧, 趙俊紅, 鄧傳歡 申請人:中山大學(xué)