專利名稱：一種檢測微藻含油量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)脂微藻，具體地說是一種檢測微藻含油量的方法。
背景技術(shù)：
作為一種重要的可再生資源，藻類具有分布廣泛、生物量大、光合作用效率高、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、生長周期短、產(chǎn)量高等突出特點(diǎn)，藻類尤其是微型藻類的進(jìn)一步開發(fā)利用， 將提供新的資源來源。微藻作為能源原料的潛力巨大，其細(xì)胞中含獨(dú)特的初級(jí)或次級(jí)代謝產(chǎn)物，化學(xué)成分復(fù)雜，太陽能轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到3. 5%，是生產(chǎn)藥品、精細(xì)化學(xué)品和新型燃料的潛在資源。從微藻中得到的脂肪酸可轉(zhuǎn)化成脂肪酸甲酯，即生物柴油；在沸石催化劑的作用下，微藻通過熱化學(xué)轉(zhuǎn)化可生產(chǎn)出汽油型燃料；生長在海水中的綠藻，能積累大量游離的甘油以平衡環(huán)境中的鹽濃度，其甘油的含量可占自身干重的85 %。另外，隨著全球石油能源短缺問題日益突出，微藻因具有光合作用效率高、含油量高、生長周期短、可減排CO2、可利用有機(jī)廢水、不與人爭糧地水等獨(dú)特優(yōu)勢，而被認(rèn)為是發(fā)展?jié)摿薮?、最有可能替代石油的生物能源原料，微藻生物柴油開發(fā)方興未艾。微藻已經(jīng)成為能源等領(lǐng)域研究開發(fā)的熱點(diǎn)，而研究開發(fā)的首要問題是獲得產(chǎn)脂性狀穩(wěn)定、適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)的高效產(chǎn)脂微藻良種。盡管已有一些微藻藻株用于研究和中試規(guī)模生產(chǎn)，但仍存在產(chǎn)脂量不穩(wěn)定、易污染、適應(yīng)環(huán)境能力差等問題，難以用于規(guī)?；a(chǎn)。因此，通過探索創(chuàng)新相關(guān)的技術(shù)和方法，建立產(chǎn)脂微藻的優(yōu)良品系高效篩選技術(shù)體系，通過對(duì)自然界藻種及現(xiàn)有種質(zhì)庫藻種進(jìn)行篩選和遺傳改良，獲得遺傳性狀穩(wěn)定、生長速度快、抗逆性強(qiáng)、適合于規(guī)?；囵B(yǎng)的高產(chǎn)脂微藻良種，已成為產(chǎn)脂微藻高效開發(fā)利用的迫切需求。目前產(chǎn)油微藻篩選主要指標(biāo)是微藻的含油量和生物量，而檢測微藻含油量的方法主要有1)傳統(tǒng)的抽提法；幻染色熒光比色法；；3)氣相色譜法等。其中，傳統(tǒng)抽提法和色譜法都費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且對(duì)儀器設(shè)備要求較高；染色比色法比較省時(shí)，但是只能測定微藻油脂的相對(duì)含量。因此，目前急需一種快速、簡潔而且可以估算油脂含量的微藻油脂測定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的活體檢測微藻油脂的含量，使培養(yǎng)過程和油脂檢測融為為一體，過程簡單方便，是簡單高效的定量檢測方法。一種檢測微藻含油量的方法，1)取進(jìn)行微藻培養(yǎng)的藻液，計(jì)算藻液中微藻細(xì)胞的數(shù)量濃度C(個(gè)cell/ml)；2)微藻油脂觀察采用BODIPY 505/515染色熒光記錄法；使用有機(jī)溶劑二甲亞砜溶解BODIPY 505/515染料并配制成10 20mM的母液；染料使用液濃度為1 2mM，染色 1 aiiin后，使用激發(fā)波長488nm激發(fā)光，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄單細(xì)胞油脂積累變化情況；根據(jù)照片記錄單細(xì)胞油滴顆粒數(shù)目(η)，并測定油滴直徑(d)，按照球體積公式計(jì)算每個(gè)油滴體積，每個(gè)細(xì)胞油脂含量為所有油滴體積的加和；
根據(jù)微藻數(shù)量濃度C和單個(gè)細(xì)胞油脂含量計(jì)算單位體積藻液油脂含量Vt = CV, C 為扁藻細(xì)胞濃度，V為單細(xì)胞油脂體積，Vt單位體積油脂含量。細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算微藻細(xì)胞的數(shù)量；采用魯哥氏液固定微藻的方法；在光學(xué)顯微鏡下利用血球計(jì)數(shù)儀記錄各個(gè)時(shí)期微藻的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)而計(jì)算藻液濃度。藻細(xì)胞染色后在488nm激發(fā)波長下，使用激光掃描共聚焦顯微鏡每隔 0. 01-0. 5 μ m對(duì)藻細(xì)胞斷層掃描并拍照記錄，后經(jīng)3D合成軟件重建油滴3D圖片表明油滴近似正球體；采用顯微鏡照相軟件測定油滴顆粒直徑。1)以藻液中微藻細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以藻液中微藻細(xì)胞的數(shù)量濃度C為縱坐標(biāo)，建立微藻生長動(dòng)力學(xué)曲線；2)根據(jù)微藻生長曲線和不同時(shí)期單細(xì)胞油脂體積，按上述試驗(yàn)方法計(jì)算各個(gè)培養(yǎng)時(shí)期單位體積藻液油脂含量Vt的變化，進(jìn)而確定最佳產(chǎn)油時(shí)期，為實(shí)際生產(chǎn)提供一種簡單、便捷、高效、低廉的檢測油脂含量的方法。實(shí)驗(yàn)操作1、微藻培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長期、活力旺盛的微藻作為實(shí)驗(yàn)藻種。設(shè)置一定的生長培養(yǎng)條件(溫度、鹽度、營養(yǎng)鹽濃度等等)或培養(yǎng)方式(自養(yǎng)、異養(yǎng)等等)，研究并繪制微藻生長動(dòng)力學(xué)曲線。本實(shí)驗(yàn)主要研究了亞心型扁藻在一個(gè)生長周期中油脂積累的情況。2、細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算微藻細(xì)胞的數(shù)量。采用魯哥氏液固定微藻的方法。在光學(xué)顯微鏡下利用血球計(jì)數(shù)儀記錄各個(gè)時(shí)期微藻的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)而計(jì)算藻液濃度。3、微藻油脂觀察采用BODIPY 505/515染色熒光記錄法。使用有機(jī)溶劑二甲亞砜溶解BODIPY 505/515染料并配制成IOmM的母液。染料使用液濃度為ImM，染色I(xiàn)min后，使用488nm激發(fā)波長，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄單細(xì)胞油脂積累變化情況。4、測量并記錄單細(xì)胞油滴顆粒數(shù)目(η)和直徑(d)，采用球體積公式計(jì)算單細(xì)胞油脂體積戶π of/6 + π《/6 +…π f/6。從而結(jié)合微藻生長曲線計(jì)算單位培養(yǎng)液中油脂的總量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠快速、清晰地檢測單細(xì)胞油滴積累情況，包括油滴體積大小和數(shù)目多少的變化。同時(shí)結(jié)合微藻生長曲線，通過簡單的數(shù)學(xué)運(yùn)算即可計(jì)算出各個(gè)培養(yǎng)時(shí)期單位體積培養(yǎng)液中油脂含量的變化。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.檢測快速簡單。本發(fā)明將微藻培養(yǎng)與檢測方法融為一體，過程簡單方便，即通過活體檢測測定微藻油脂含量。需要時(shí)間較常規(guī)方法明顯減少，單個(gè)樣品檢測只需要2分鐘。2.可以近似定量檢測單位體積油脂的含量。熒光顯微鏡觀察并測定油滴數(shù)目(η) 和油滴直徑(d)后，采用戶π ￠^/6 + π d^/6 +…π c/n3/6計(jì)算單個(gè)微藻的油滴體積， 從而通過生長曲線計(jì)算單位培養(yǎng)液中油脂的總量。3.成本低。檢測過程不需要高端的儀器設(shè)備和耗材，因此較常規(guī)方法成本低廉。4.應(yīng)用效果好。實(shí)驗(yàn)證明，BODIPY 505/515較尼羅紅更能清晰的反應(yīng)出油滴的輪
廓和數(shù)量。


圖1為扁藻可見光㈧與熒光染色(B)圖片對(duì)比；圖2為扁藻生長曲線；圖3為單細(xì)胞油脂體積變化；圖4為單位體積藻液油脂含量變化。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例材料與方法1)實(shí)驗(yàn)藻種實(shí)驗(yàn)用藻種亞心型扁藻(Platymonas subcordiformis)，取自中國水產(chǎn)科學(xué)院-黃海水產(chǎn)研究所微藻培養(yǎng)室。2)培養(yǎng)條件實(shí)驗(yàn)用基本培養(yǎng)液配方為NaNO3 (120mg/L)，KH2PO4 (4mg/L)， FeC6H5O7 (5mg/L)，維生素B1 (200 μ g/L)，維生素B12 (200 μ g/L)。微藻培養(yǎng)采用室內(nèi)恒溫培養(yǎng)法，在光化培養(yǎng)箱(G)CZ智能型，寧波江南儀器廠)中進(jìn)行。設(shè)置光照強(qiáng)度為 120 μ mo 1 · πΓ2 · S、溫度 20 士 1°C，光周期 12h (L) 12h (D)。3)實(shí)驗(yàn)方法3. 1)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在上述培養(yǎng)條件下，取對(duì)數(shù)生長期藻種作為實(shí)驗(yàn)材料接種至上述培養(yǎng)液中，初始接種密度為2. 375士0. 916(X104cell/ml)。設(shè)置3個(gè)平行樣，測定扁藻生長曲線和油脂積累情況。3. 2)生長測定每隔2d從各實(shí)驗(yàn)組中取ImL藻液，加1 2滴魯哥氏液固定藻細(xì)胞，以血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)藻細(xì)胞。每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次，3次的計(jì)數(shù)結(jié)果相比較標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過20%，否則要進(jìn)行第4次計(jì)數(shù)。3. 3)熒光染色親脂性熒光染料BODIPY 505/515溶解于有機(jī)溶劑(二甲亞砜)配制10mM/L的母液。使用時(shí)，取0. 1 μ L母液注入ImL藻液中染色I(xiàn)min左右。使用熒光顯微鏡(Nikon Eclipse 80i)在藍(lán)色激發(fā)光G88nm)下隨機(jī)選取6個(gè)視野觀察并拍照記錄細(xì)胞內(nèi)油脂顆粒分布情況。3. 4)油脂含量測定藻細(xì)胞染色后在488nm激發(fā)波長下，使用激光掃描共聚焦顯微鏡(Nikon ECLIPSE TE 2000-U)每隔0. 5 μ m對(duì)藻細(xì)胞斷層掃描并拍照記錄，后經(jīng)尼康 EZ-Cl軟件處理系統(tǒng)，重建油滴3D圖片表明油滴近似正球體。采用尼康NIS-elements BR 軟件測定油滴顆粒直徑，根據(jù)球體積公式計(jì)算每個(gè)油滴體積，每個(gè)細(xì)胞油脂含量為所有油滴體積的加和戶π + π這3/6 +…π義/6 (其中d為油滴直徑，η為單細(xì)胞油滴數(shù))。根據(jù)扁藻生長曲線和單個(gè)細(xì)胞油脂含量計(jì)算單位體積藻液油脂含量Vt = CV (C為扁藻細(xì)胞濃度，V為單細(xì)胞油脂體積，Vt單位體積油脂含量)。4)數(shù)據(jù)方法實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(mean士 SD)，采用SPSS 17. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因子方差分析(One-Way AN0VA)和組間多重比較分析(LSD AN0VA)，P <0. 05為差異顯著水平。試驗(yàn)結(jié)果1)扁藻可見光與熒光染色對(duì)比經(jīng)親脂性熒光染料BODIPY 505/515染色后，在488nm激發(fā)波長下扁藻細(xì)胞內(nèi)油脂顆?？杀磺逦鷺?biāo)記出來。使用激光掃描共聚焦顯微鏡每隔0.5μπι對(duì)藻細(xì)胞斷層掃描并拍照記錄，后經(jīng)尼康EZ-Cl軟件處理系統(tǒng)，重建油滴3D圖片表明油滴近似正球體。采用尼康NIS-elements BR軟件測定圖IB中油滴顆粒直徑，波動(dòng)范圍為0. 758士0. 079
1.598 士0. 206 μ m,根據(jù)球體積公式計(jì)算每個(gè)油滴體積，波動(dòng)范圍為0. 066 士0. 011 μ m3
2.866 士 0. 868 μ m3·2)扁藻生長曲線取對(duì)數(shù)生長期的扁藻接種于上述(3. 1)培養(yǎng)基中，初始接種濃度為 2. 375士0. 916(X104cell/ml)。隨著培養(yǎng)時(shí)間，扁藻細(xì)胞經(jīng)過短暫的延遲期至第4天進(jìn)入對(duì)數(shù)期，細(xì)胞濃度迅速增加，至22天達(dá)到最大值之后進(jìn)入平臺(tái)期。在各時(shí)間點(diǎn)，取培養(yǎng)藻液 lml，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞密度并繪制生長曲線如表1和圖2所示。表1扁藻細(xì)胞濃度
權(quán)利要求
1.一種檢測微藻含油量的方法，其特征在于1)取進(jìn)行微藻培養(yǎng)的藻液，計(jì)算藻液中微藻細(xì)胞的數(shù)量濃度C(個(gè)cell/ml)；2)微藻油脂觀察采用BODIPY505/515染色熒光記錄法；染料使用液濃度為1 2mM， 染色1 aiiin后，使用激發(fā)波長488nm激發(fā)光，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄單細(xì)胞油脂積累變化情況；根據(jù)照片記錄單細(xì)胞油滴顆粒數(shù)目(η)，并測定油滴直徑(d)，按照球體積公式計(jì)算每個(gè)油滴體積，每個(gè)細(xì)胞油脂含量為所有油滴體積的加和；根據(jù)微藻數(shù)量濃度C和單個(gè)細(xì)胞油脂含量計(jì)算單位體積藻液油脂含量Vt = CN, C為扁藻細(xì)胞濃度，V為單細(xì)胞油脂體積，Vt單位體積油脂含量。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于使用有機(jī)溶劑二甲亞砜溶解BODIPY 505/515染料并配制成10 20mM的母液。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算微藻細(xì)胞的數(shù)量；采用魯哥氏液固定微藻的方法；在光學(xué)顯微鏡下利用血球計(jì)數(shù)儀記錄各個(gè)時(shí)期微藻的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)而計(jì)算藻液濃度。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于藻細(xì)胞染色后在488nm激發(fā)波長下，使用激光掃描共聚焦顯微鏡每隔0. 01-0. 5 μ m對(duì)藻細(xì)胞斷層掃描并拍照記錄，后經(jīng)3D圖像合成軟件重建油滴3D圖片，表明油滴近似正球體；采用顯微鏡照相軟件測定油滴顆粒直徑。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于1)以藻液中微藻細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以藻液中微藻細(xì)胞的數(shù)量濃度C為縱坐標(biāo)，建立微藻生長動(dòng)力學(xué)曲線；2)根據(jù)微藻生長曲線和不同時(shí)期單細(xì)胞油脂體積，按權(quán)利要求1所述方法計(jì)算各個(gè)培養(yǎng)時(shí)期單位體積藻液油脂含量Vt的變化。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)脂微藻，具體地說是一種檢測微藻含油量的方法，1)取進(jìn)行微藻培養(yǎng)的藻液，計(jì)算微藻細(xì)胞的數(shù)量濃度C；2)微藻油脂觀察采用BODIPY 505/515染色熒光記錄法；染料使用液濃度為1～2mM，染色1～2min后，使用激發(fā)波長488nm激發(fā)光，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄單細(xì)胞油脂積累變化情況；根據(jù)照片記錄單細(xì)胞油滴顆粒數(shù)目(n)，并測定油滴直徑(d)，按照球體積公式計(jì)算每個(gè)油滴體積，每個(gè)細(xì)胞油脂含量為所有油滴體積的加和；根據(jù)微藻數(shù)量濃度C和單個(gè)細(xì)胞油脂含量計(jì)算單位體積藻液油脂含量Vt＝CV，C為扁藻細(xì)胞濃度，V為單細(xì)胞油脂體積，Vt單位體積油脂含量。
文檔編號(hào)G01N15/10GK102565012SQ201010620678
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者葉乃好, 張曉雯, 徐東 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所