專利名稱：梅毒特異性IgM與IgG抗體聯(lián)合檢測試劑條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種梅毒特異性抗體檢測試劑，尤其是涉及一種采用金標免疫層 析技術(shù)(immunochromatography)進行的梅毒特異性IgM與IgG抗體聯(lián)合快速檢測試劑條。
背景技術(shù)：
梅毒(Syphilis)是一種由梅毒螺旋體(Tr印onema pallidum, TP)引起的性傳播 性疾病，其病原體是梅毒螺旋體，屬螺旋體科。梅毒螺旋體主要通過性接觸、輸血、創(chuàng)口或 者胎盤等途徑傳播。梅毒螺旋體從感染區(qū)附近的淋巴結(jié)進入血液，播散全身，使機體幾乎 所有的組織及器官受累，臨床表現(xiàn)為全身性，可分為不同臨床階段，包括一期、二期、三期和 潛伏期。世界衛(wèi)生組織(WHO)曾樂觀地預(yù)言“由于有高敏度檢測方法和高效的治療方案， 梅毒是一種能夠通過公共衛(wèi)生措施得到成功控制的性傳播性疾病”。遺憾的是，至今梅毒 依然是世界范圍的公共衛(wèi)生問題，缺乏有效的行政控制措施，每年全球大約有1200萬的患 #，胃中 60 力■^女gii#。 ( :He￡ilth Protection Agency Centre for Infections. International Encyclopediaof Public Health-Syphilis[M]. London, UK :Health Protection Agency Centre，2008，289-297.)事實上，梅毒的感染現(xiàn)狀可能要比想象中的 更讓人悲觀。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，梅毒感染者已經(jīng)較廣泛地存在于普通人群中。梅毒螺旋體尚不能進行體外培養(yǎng)，梅毒診斷與流行病學調(diào)查主要依賴于血清學試 驗，包括特異性抗體和反應(yīng)素檢測兩大類型。梅毒特異性抗體IgM(TP-IgM)和IgG(TP-IgG) 抗體分別于2周和4周后產(chǎn)生，即使患者經(jīng)過足夠治療，其仍能長期存在，甚至終身不消失 (參見:Luis J F, Felipe U S, Santa G C, et al. Evaluation of a rapid strip and a particle agglutinationtests for syphilis diagnosis[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2007，59 :123_126)；而另一種抗體物質(zhì)反應(yīng)素產(chǎn)生較晚，一般 在受感染后5 7周產(chǎn)生(參見林月圓.TPPA和TRUST在梅毒診斷中的價值與臨床相關(guān) 問題[J].放射免疫學雜志，2009，22 (3) :295-297.)，而且晚期梅毒、梅毒治療后期以及潛 伏梅毒可能陰性。因此梅毒特異性抗體的陽性率、敏感性顯著高于反應(yīng)素。TP-IgM是梅 毒感染后，機體最先出現(xiàn)的特異性抗體。只要有活的梅毒螺旋體存在，其TP-IgM將會維持
胃白勺TfC。 Martina H^ ( #JAL :Martina H, Daan W N, Mart Μ, et al. Comparison of a Treponema pallidum IgM immunoblot with a 19S fluorescenttreponemal antibody absorption test for the diagnosis of congenital syphilis[J]. DiagnosticMicrobiology and Infectious Disease,2007, 59 :61_66.)認為 TP-IgM 是 梅毒早期感染并活動的一項血清學標志，李步榮等(參見李步榮，賀軍濤，張毅，等.梅 毒螺旋體IgM抗體檢測的臨床意義[J],第四軍醫(yī)大學學報，2007,28(16) 1495-1497) 認為TP-IgM與TP-DNA—樣，代表著梅毒傳染性指標。在排除近期抗梅毒治療的前提下， TP-IgM若不轉(zhuǎn)陰，提示體內(nèi)可能殘存梅毒螺旋體或治療不徹底。TP-IgM陰轉(zhuǎn)者隨訪時再轉(zhuǎn) 陽性，表明再次感染梅毒(參見Rawstron SA, Mehta S, Bromberg K, et al. Evaluationof a Treponema pallidum2specific IgMenzyme immunoassay and Treponema pallidum western blot antibody detection in the diagnosisofmaternal and congenital syphilis [J], Sex Transm Dis，2004，31 (2) : 123-126)。盡管 TP-IgM 陰性不能完全排除傳 染性，但TP-IgM陽性必定提示該患者具有傳染性。TP-IgG的出現(xiàn)要遲于IgM，能長期存在， 甚至終身不消失，因此，TP-IgG是梅毒診斷和流行病學調(diào)查的一項重要指標。早期的血清學方法使用完整梅毒螺旋體作為抗原，研究和診斷用的TP是以TP感 染兔睪丸獲得，這種方法花費大、獲得的TP量少、不純(混有宿主蛋白)，與其他病原體存 在交叉反應(yīng)，因此假陽性也時有發(fā)生。隨著分子生物學技術(shù)的普及及梅毒螺旋體抗原的相 繼克隆，將重組抗原應(yīng)用于梅毒實驗已經(jīng)越來越多。目前研究比較多的TP抗原有TPW7、 TPN47、TPNl5, TPN44. 5、TPN36、TP0453、TP0684 及 TPr 家族。采用重組 DNA 技術(shù)制備的重 組抗原可以克服完整TP抗原的缺點，能快速、經(jīng)濟地制備無限量特異重組TP抗原。梅毒特異性抗體檢測是梅毒確證試驗，包括TPHA，TPPA, ELISA，F(xiàn)TA-ABS及 Western-blot等，其特異性均較高。然而，面對嚴峻的防制形式，不但需要特異準確的檢測 手段，還需要一種更簡便快捷的試劑來篩查，以便為臨床和疾病防控提供對策。
發(fā)明內(nèi)容本實用新型的目的是提供一種梅毒特異性IgM與IgG抗體聯(lián)合檢測試劑條。本實用新型設(shè)有載體板、加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜(NC膜)、梅毒特異性IgG 抗體檢測線、梅毒特異性IgM抗體檢測線、對照線和吸收墊。加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜 和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設(shè)在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另 一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè)在硝酸纖維膜的另一端上，梅毒特異性IgG 抗體檢測線、梅毒特異性IgM抗體檢測線和對照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性 IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體，在梅毒特異性IgM抗體檢測 線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗梅毒抗原TPW7和 TPN47的IgG抗體。所述載體板可采用PVC板。本實用新型可采用以下方法制備1)制備梅毒重組抗原TPN17和TPN47 采用基因克隆技術(shù)，PCR擴增編碼梅毒螺旋 體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得梅毒重組抗原TPN17和TPN47。2)硝酸纖維素膜的點樣在硝酸纖維素膜上的梅毒特異性IgG抗體檢測線處包被 抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體，在硝酸纖維素膜上的梅毒特異性IgM抗體檢測線處 包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在硝酸纖維素膜上的對照線處包被羊抗梅毒抗 原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47的IgG抗體，晾干；所述抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體、抗人IgM 特異性片段μ鏈單克隆抗體的濃度為1 4mg/mL，羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗 體由抗TPm7-IgG抗體與抗TPN47-IgG抗體按體積比1 1混合，其終濃度為1 4mg/mL ； 三者點樣量為1 μ L/cm。3)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取氯金酸ImL加 入到IOOmL去離子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0.01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱 至沸騰，磁力加熱攪拌下加入檸檬酸三鈉水溶液2. OmL，繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4°C冰箱保存?zhèn)溆?，所述檸檬酸三鈉的濃度可為2%。4)膠體金與梅毒特異性抗原TPW7、TPN47的標記膠體金與梅毒特異性抗原TPW7的標記取膠體金10ml，用0. Imol/LNaOH調(diào)至 ρΗ5· 4，加 100 μ g 丁卩附7，混勻，放置51^11，加入5%85八 Iml 混勻，4°C、10000r/min 離心 lh, 棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10ml，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用TBS稀 釋至1ml，得膠體金標記的TPN17抗原；膠體金與梅毒特異性抗原TPN47的標記同上操作，得膠體金標記的TPN47抗原；將膠體金標記的TPN17抗原和膠體金標記的TPN47抗原混合后，均勻地涂于玻璃 纖維膜上，烘干，制備成膠體金墊，所述將膠體金標記的TPN17抗原和膠體金標記的TPN47 抗原混合，最好膠體金標記的TPN17抗原和膠體金標記的TPN47抗原以體積比1 (0. 2 5)混合；所述烘干的溫度可為37°C。5)制備梅毒特異性IgM與IgG抗體聯(lián)合檢測試劑條將加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一 端設(shè)在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè) 在硝酸纖維膜的另一端上，梅毒特異性IgG抗體檢測線、梅毒特異性IgM抗體檢測線和對照 線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段γ鏈 單克隆抗體，在梅毒特異性IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體， 在對照線處包被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47的IgG抗體，用切條機切成條狀，得梅毒特異 性IgM與IgG抗體聯(lián)合檢測試劑條。本實用新型采用梅毒特異性重組蛋白作為梅毒特異性IgM與IgG抗體聯(lián)合檢測 試劑條的抗原，設(shè)定熒光密螺旋體抗體吸收試驗(FTA-ABS)(德國歐蒙公司)和梅毒螺旋 體特異性抗體明膠凝集試驗(TPPA)(日本富士株式會社)為參照，建立梅毒特異性IgM與 IgG抗體膠體金免疫層析技術(shù)聯(lián)合快速檢測試劑，實現(xiàn)了特異性IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測， 不僅具有簡便快速、特異性強、靈敏度高、準確可靠、成本低等優(yōu)點，而且檢測所需標本量極 小，不需要特殊儀器，可肉眼直接判讀結(jié)果的，對梅毒診斷和防治具有非常重要的社會和經(jīng) 濟價值。梅毒特異性IgM與IgG抗體聯(lián)合檢測試劑條可用于全血、血清、血漿及腦脊液等標 本中梅毒特異性IgM和IgG抗體的檢測。

圖1為本實用新型實施例的結(jié)構(gòu)組成示意圖。圖2為實驗結(jié)果模式示意圖。在圖2中，A為使用前的示意圖，B為無效試驗(產(chǎn) 品質(zhì)量問題)，C為陰性結(jié)果，D為TP-IgG陽性結(jié)果，E為TP-IgM陽性結(jié)果，F(xiàn)為TP-IgG和 TP-IgM均陽性結(jié)果；5為梅毒特異性IgG抗體檢測線，6為梅毒特異性IgM抗體檢測線，7為 對照線。
具體實施方式
如圖1所示，本實用新型實施例設(shè)有載體板1、加樣墊2、膠體金墊3、硝酸纖維膜 (NC膜)4、梅毒特異性IgG抗體檢測線5、梅毒特異性IgM抗體檢測線6、對照線7、吸收墊8。加樣墊2、膠體金墊3、硝酸纖維膜(NC膜)4和吸收墊8依次粘貼在載體板1上表面，加 樣墊2的一端設(shè)在膠體金墊3的一端上，膠體金墊3的另一端設(shè)在硝酸纖維膜(NC膜)4的 一端上，吸收墊8的一端設(shè)在硝酸纖維膜(NC膜)4的另一端上，梅毒特異性IgG抗體檢測 線5、梅毒特異性IgM抗體檢測線6和對照線7從膠體金墊3開始依次設(shè)在硝酸纖維膜(NC 膜)4上。在梅毒特異性IgG抗體檢測線5上包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體， 在梅毒特異性IgM抗體檢測線6上包被抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體，在對照線7 上包被羊抗梅毒抗原(ΤΡΝ17和ΤΡΝ47) IgG抗體。所述載體板采用PVC板，載體板的長度為6 10cm，載體板的寬度為2 4mm，載 體板的厚度為1 2mm。加樣墊的材料為玻璃纖維，膠體金墊的材料是涂布膠體金結(jié)合物的 玻璃纖維，所述吸收墊的長度為1 2cm，吸收墊可采用吸液紙。實施例1本實用新型的制備方法，包括以下步驟1)制備梅毒重組抗原TPN17和TPN47 采用基因克隆技術(shù)，PCR擴增編碼梅毒螺旋 體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得梅毒重組抗原TPN17和TPN47。2)硝酸纖維素膜的點樣在硝酸纖維素膜(NC膜)上的梅毒特異性IgG抗體檢測 線處包被抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體，在硝酸纖維素膜(NC膜)上的梅毒特異性 IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在硝酸纖維素膜(NC膜)上 的對照線處包被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47的IgG抗體，室溫晾干，密封室溫保存?zhèn)溆茫?所述抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體、抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體的濃度為 1 4mg/mL，羊抗梅毒抗原(TPN17和TPN47) IgG抗體由抗TPm7_IgG抗體與抗TPN47_IgG 抗體按體積比1 1混合，其終濃度為1 4mg/mL;三者點樣量為lyL/cm。3)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取1 %氯金酸ImL加 入到IOOmL去離子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0.01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱 至沸騰，磁力加熱攪拌下加入檸檬酸三鈉水溶液2. OmL，繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色 為止，冷卻后置于棕色瓶中4°C冰箱保存?zhèn)溆?；所述檸檬酸三鈉的濃度可為2%。 4)膠體金與梅毒特異性抗原TPW7、TPN47的標記膠體金與梅毒特異性抗原TPW7的標記取膠體金10ml，用0. lmol/L NaOH調(diào)至 ρΗ5· 4，加 100 μ g TPNl7,混勻，放置 5min,加入 5 % BSA Iml 混勻，4°C、10000r/min 離心 Ih, 棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10ml，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用TBS稀 釋至1ml，得膠體金標記的TPN17抗原；膠體金與梅毒特異性抗原TPN47的標記同上操作，得膠體金標記的TPN47抗原；將膠體金標記的TPW7抗原和膠體金標記的TPN47抗原以體積比(0 5) (0 5)混合后，均勻地涂于玻璃纖維膜上，在37°C烘干，制備成膠體金墊，密封備用。5)制備梅毒特異性IgM與IgG抗體聯(lián)合檢測試劑條將加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜(NC膜)和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加 樣墊的一端設(shè)在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜(NC膜)的一端上， 吸收墊的一端設(shè)在硝酸纖維膜(NC膜)的另一端上，梅毒特異性IgG抗體檢測線、梅毒特異 性IgM抗體檢測線和對照線依次設(shè)在硝酸纖維膜(NC膜)上；在梅毒特異性IgG抗體檢測 線處包被抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體，在梅毒特異性IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗梅毒抗原TPW7和ΤΡΝ47的IgG抗 體，用切條機切成條狀，得梅毒特異性IgM與IgG抗體聯(lián)合檢測試劑條。取待檢標本血清10 μ 1，加樣于免疫層析檢測條加樣區(qū)，同時滴加100 μ 1生理鹽 水，靜置20min觀察結(jié)果。只在檢測條對照區(qū)有一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陰性；在檢測區(qū) 及對照區(qū)均有一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陽性；加樣檢測后，檢測區(qū)和對照區(qū)均不出現(xiàn)紫紅 色條帶，為無效結(jié)果(見圖2)。實施例2與實施例1相似，區(qū)別在于金結(jié)合物墊僅由TPW7組成，不含有TPN47。結(jié)果判斷 與實施例1相同。實施例3與實施例1相似，區(qū)別在于金結(jié)合物墊僅由TPN47組成，不含有TPW7。結(jié)果判斷 與實施例1相同。實施例4與實施例1相似，區(qū)別在于待檢標本為腦脊液標本，結(jié)果判斷與實施例1相同。實施例5性能驗證試驗按實施例1的方案制備梅毒特異性IgM與IgG抗體聯(lián)合快速檢測 試劑，然后進行性能驗證。1)外觀檢查白色包被反應(yīng)膜平整、干凈無污染斑點、無裂縫，膠帶無開膠，試劑 條寬度在3 士 0. 1mm，無切斜現(xiàn)象。2)陽性標本符合率50份經(jīng)FTA-ABS(德國歐蒙公司)檢測確定的TP-IgM陽 性參比血清，采用發(fā)明的試劑條檢出TP-IgM陽性50份，陽性標本符合率100% ；而50份 經(jīng)FTA-ABS(德國歐蒙公司)檢測確定的TP-IgG陽性參比血清，采用發(fā)明的試劑條檢出 TP-IgG陽性49份，陽性標本符合率98%。3)陰性標本符合率50份梅毒螺旋體特異性抗體明膠凝集試驗(TPPA)(日本 富士株式會社)陰性參比血清，采用發(fā)明的試劑條檢測未檢出陽性標本，陰性標本符合率 100%。4)靈敏度檢測用衛(wèi)生部室內(nèi)質(zhì)控血清(批號200902001)檢測，最低檢出限度 4NCU/mL。5)批內(nèi)差異同一批次試劑條，用特征性陽性血清(FTA_ABS(德國歐蒙公司)檢 測確定的臨床標本陽性TP-IgG、TP-IgM參比高、中、低血清)檢測，相同滴度檢測結(jié)果顯示 色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結(jié)果陰性。6)批間差異不同批次試劑條，用特征性陽性血清(FTA_ABS(德國歐蒙公司)檢 測確定的臨床標本陽性TP-IgG、TP-IgM參比高、中、低血清)檢測，相同滴度檢測結(jié)果顯示 色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結(jié)果陰性。7)干擾試驗檢測結(jié)果不受標本溶血(η = 50)、脂血(η = 50)和黃疸(η = 50) 的干擾。8)交叉反應(yīng)采用本試劑條，進行系統(tǒng)性紅斑狼瘡(η = 30)、類風濕病(η = 38)、 免疫性肝炎(η = 40)等自身免疫系統(tǒng)疾病的檢測，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。9)穩(wěn)定性檢測將試劑條放置37°C 20天后檢測，以上各項指標無顯著變化。
權(quán)利要求梅毒特異性IgM與IgG抗體聯(lián)合檢測試劑條，其特征在于設(shè)有載體板、加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜、梅毒特異性IgG抗體檢測線、梅毒特異性IgM抗體檢測線、對照線和吸收墊；加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設(shè)在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè)在硝酸纖維膜的另一端上，梅毒特異性IgG抗體檢測線、梅毒特異性IgM抗體檢測線和對照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體，在梅毒特異性IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的梅毒特異性IgM與IgG抗體聯(lián)合檢測試劑條，其特征在于所述 載體板為PVC板。
專利摘要梅毒特異性IgM與IgG抗體聯(lián)合檢測試劑條，涉及一種梅毒特異性抗體檢測試劑。設(shè)有載體板、加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜、梅毒特異性IgG抗體檢測線、梅毒特異性IgM抗體檢測線、對照線和吸收墊。加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊一端設(shè)在膠體金墊一端上，膠體金墊另一端設(shè)在硝酸纖維膜一端上，吸收墊一端設(shè)在硝酸纖維膜另一端上，兩條檢測線和對照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體，在梅毒特異性IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗體。
文檔編號G01N33/571GK201697918SQ20102019882
公開日2011年1月5日 申請日期2010年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月19日
發(fā)明者張忠英, 張長弓, 楊天賜, 林麗蓉 申請人:廈門大學附屬中山醫(yī)院