專利名稱：一種基于多重上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)的霍亂檢測(cè)分型試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種基于多重上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)的霍亂檢測(cè)分型試
紙
發(fā)明領(lǐng)域本實(shí)用新型涉及一種基于多重上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)的試紙，特別涉及一種可 對(duì)霍亂弧菌01群與0139群進(jìn)行同步檢測(cè)與分型的基于多重上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)的試 紙。
背景技術(shù)：
霍亂(Cholera)是由01血清群和0139血清群霍亂弧菌(Vibrio cholerae)引起 的急性腸道傳染病，是以發(fā)病急、傳播快、波及范圍廣、能引起大流行為特征的國(guó)際檢疫傳 染病之一，也是《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定的甲類傳染病之一，《國(guó)內(nèi)交通衛(wèi)生檢 疫條例》也將其列為檢疫傳染病。它可以引起散發(fā)、流行、暴發(fā)、甚至世界性大流行，不僅危 害人民健康，而且影響人民正常生活、生產(chǎn)、旅游、經(jīng)貿(mào)、交通運(yùn)輸、甚至社會(huì)安定。根據(jù)菌體(0)抗原的不同，目前已將霍亂弧菌分出200個(gè)以上的0血清群0) serogroups)，但僅發(fā)現(xiàn)01和0139群霍亂弧菌能引發(fā)霍亂。1992年以前，僅01群霍亂弧菌 (V. cholerae 01)的兩個(gè)生物型，即古典生物型(Classical biotype)和埃爾托生物型(El Tor biotype)引發(fā)了七次霍亂世界大流行。而對(duì)01群以外的其他血清群，統(tǒng)稱為非01群 霍亂弧菌(V. cholerae non-01) 0非01群霍亂弧菌廣泛分布于自然界水體中，一般不致病 或僅引起散發(fā)性腹瀉病例和腸道外感染。但1992年10月，印度首次發(fā)生了由非01群霍亂 弧菌引起的霍亂大暴發(fā)，其病原被鑒定為0139血清群霍亂弧菌(V. cholerae 0139)。這個(gè) 新確認(rèn)的0139群與其他非01群霍亂弧菌最大的不同點(diǎn)在于，它能產(chǎn)生與01群霍亂弧菌相 同的霍亂毒素(Cholera toxin, CT)，所引起的霍亂在臨床和流行病學(xué)上也與01群霍亂弧 菌所致霍亂基本相同主要通過(guò)水引起暴發(fā)流行，人感染后，該菌在腸內(nèi)大量繁殖，造成腹 瀉、嘔吐、嚴(yán)重脫水，如不醫(yī)治會(huì)造成死亡。此外，0139群霍亂由于抗原發(fā)生了變異，人群對(duì) 其缺乏免疫力。發(fā)病以青壯年為主，男性病例明顯多于女性，無(wú)明顯季節(jié)性，冬春季也可引 起暴發(fā)流行。由此可見，霍亂弧菌的快速檢測(cè)，并在檢測(cè)中對(duì)血清型(01群還是0139群) 進(jìn)行同步的判斷，將對(duì)霍亂的預(yù)防以及霍亂發(fā)生后及時(shí)有效的控制處理具有重要的意義。目前所使用的常規(guī)的霍亂弧菌檢測(cè)分型技術(shù)包括診斷血清玻片凝集試驗(yàn)、PCR、 膠體金試紙等，這些方法有的只能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，無(wú)法在野外現(xiàn)場(chǎng)使用；有的操作流程較 為復(fù)雜歷時(shí)較長(zhǎng)；有的敏感性低、特異性差；有的一次操作只能對(duì)一種目標(biāo)被檢物進(jìn)行檢 測(cè)，無(wú)法檢測(cè)與分型同步進(jìn)行。因而急需操作簡(jiǎn)便、快速、敏感性高、特異性好、檢測(cè)分型同 步的現(xiàn)場(chǎng)技術(shù)。免疫層析技術(shù)是經(jīng)典的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)，操作簡(jiǎn)便、快速；上轉(zhuǎn)換發(fā)光材 料(Up-Converting Phosphor, UCP)是新型的稀土金屬晶體光學(xué)材料，其獨(dú)特的物理結(jié)構(gòu)以 及化學(xué)組成使其具有絕無(wú)僅有的上轉(zhuǎn)換發(fā)光現(xiàn)象，即UCP顆?？捎杉t外光激發(fā)、發(fā)射可見 光；上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)(Up-converting Phosphor Technology, UPT)促成了免疫層析技術(shù)與 上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的結(jié)合，即通過(guò)一系列表面修飾與活化后將UCP顆粒作為標(biāo)記物應(yīng)用于免 疫層析，在紅外光照射下以獨(dú)特的上轉(zhuǎn)換發(fā)光現(xiàn)象揭示生物活性分子之間高靈敏度特異性的識(shí)別，進(jìn)而光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)被檢物的準(zhǔn)確定量。若能建立多重上轉(zhuǎn)換發(fā) 光免疫層析技術(shù)(UPT-based later-flow assay,UPT-LF assay)則可在保證簡(jiǎn)便、快速、敏 感性、特異性、定量能力的同時(shí)實(shí)現(xiàn)01群與0139群霍亂弧菌的檢測(cè)與分型。

實(shí)用新型內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本實(shí)用新型公開一種基于多重上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫 層析技術(shù)(基于多重UPT-LF)的霍亂檢測(cè)分型試紙本實(shí)用新型的技術(shù)方案是一種霍亂檢測(cè)分型試紙，包括樣品墊[1]、結(jié)合墊 [2]、分析膜[3]、吸水墊[4]和粘性底襯[5](如附圖1所示)。其中，結(jié)合墊[2]中固定有 UCP結(jié)合物混合物[6]，UCP結(jié)合物混合物[6]中包括兩種檢測(cè)結(jié)合物和一種質(zhì)控結(jié)合物， 兩種檢測(cè)結(jié)合物為UCP-Ol群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7]和UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié) 合物[8]，一種質(zhì)控結(jié)合物為UCP-羊IgG結(jié)合物[9]；分析膜[3]上設(shè)置有檢測(cè)帶Tl [10]、 檢測(cè)帶T2[ll]和質(zhì)控帶C[12]；樣品墊[1]、結(jié)合墊[2]、分析膜[3]和吸水墊[4]依次粘貼 于粘性底襯[5]上，其中分析膜[3]貼于粘性底襯[5]的中間，吸水墊[4]貼于分析膜[3] 的一側(cè)，兩者重合部分為吸水墊[4]長(zhǎng)度的1/15-1/6 ；結(jié)合墊[2]貼于分析膜[3]的另一 側(cè)，兩者重合部分為結(jié)合墊[2]長(zhǎng)度的1/10-1/5 ；樣品墊[1]貼于結(jié)合墊[2]的另一側(cè)，兩 者重合部分為樣品墊[1]長(zhǎng)度的1/5-1/2。本實(shí)用新型霍亂檢測(cè)分型試紙的制備方法為A.結(jié)合墊[2]的制備將兩種檢測(cè)結(jié)合物(UCP-01群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7] 和UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8])和一種質(zhì)控結(jié)合物(UCP-羊IgG結(jié)合物[9]) 混合，得UCP結(jié)合物混合物[6]，用pH = 7. 2的0. 03M PB含5% BSA、5%海藻糖和5%蔗糖 的混合液作為結(jié)合物稀釋液將UCP結(jié)合物混合物[6]稀釋至終濃度為ang/ml，將UCP結(jié)合 物混合物[6]加于玻璃纖維、聚酯膜或無(wú)紡布上，于40°C下烘干1.證，得結(jié)合墊[2]，備用；B.分析膜[3]的制備將1. 5mg/ml 01群霍亂弧菌單抗B、l. 5mg/ml 0139群霍 亂弧菌單抗B和1. 5mg/ml兔抗羊IgG噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜或尼龍膜上分別作為檢測(cè)帶 Tl[10]、檢測(cè)帶T2[ll]和質(zhì)控帶C[12]，于37°C下烘干40分鐘，得分析膜[3]，備用；C.將樣品墊[1]、結(jié)合墊[2]、分析膜[3]和吸水墊[4]依次粘貼于粘性底襯[5] 上，確保相互之間的重疊關(guān)系(如附圖2所示)；將試紙剪切為4mm寬單獨(dú)可用的成品，得 本實(shí)用新型霍亂檢測(cè)分型試紙；成型的試紙可直接使用或置入塑料外殼中使用。使用本實(shí)用新型霍亂檢測(cè)分型試紙檢測(cè)分型霍亂弧菌的方法A.樣品預(yù)處理水樣、食品、糞便等樣品可直接檢測(cè)或用堿性蛋白胨水增菌4. 后再進(jìn)行檢測(cè)；B.樣品處理將1倍體積經(jīng)過(guò)預(yù)處理的樣品與1倍體積樣品處理液(0. 15M pH = 7. 2PB 含 0. 3M NaCl,0. 3% SDS)混合；C.添加樣品將處理后的液體樣品滴加至上述本實(shí)用新型霍亂檢測(cè)分型試紙的 樣品墊[1]上；D.層析反應(yīng)靜置數(shù)分鐘待層析反應(yīng)完成；E.結(jié)果判讀用上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器對(duì)試紙進(jìn)行掃描；定性檢測(cè)只有質(zhì)控帶C[12]有信號(hào)產(chǎn)生(如附圖3A所示)，則樣品為01群霍亂弧菌[13]與0139群霍亂弧菌[14]陰性；檢測(cè)帶Tl [10]與質(zhì)控帶C[12]有信號(hào)產(chǎn)生(如 附圖3B所示)，則樣品為01群霍亂弧菌[13]陽(yáng)性；檢測(cè)帶T2[ll]與質(zhì)控帶C[12]有信 號(hào)產(chǎn)生(如附圖3C所示)，則樣品為0139群霍亂弧菌[14]陽(yáng)性；檢測(cè)帶Tl [10]、檢測(cè)帶 T2[ll]、質(zhì)控帶C[12]均有信號(hào)產(chǎn)生(如附圖3D所示)，則樣品為01群霍亂弧菌[13]與 0139群霍亂弧菌[14]陽(yáng)性；檢測(cè)帶Tl[10]、檢測(cè)帶T2[ll]、質(zhì)控帶C[12]均無(wú)信號(hào)產(chǎn)生， 則層析系統(tǒng)異常檢測(cè)失敗，需進(jìn)行再次檢測(cè)；定量檢測(cè)將檢測(cè)帶Tl[10]、檢測(cè)帶T2[ll]、質(zhì)控帶C[12]的信號(hào)強(qiáng)度(即峰面 積)依次賦值于Tl、T2、C，T1/C為01群霍亂弧菌[13]的檢測(cè)值，T2/C為0139群霍亂弧 菌[14]的檢測(cè)值，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)濃度菌液標(biāo)定并繪制定量曲線后，通過(guò)任意樣品的檢測(cè)值即可獲 得該樣品中01群霍亂弧菌[13]與0139群霍亂弧菌[14]的有無(wú)及具體濃度，從而實(shí)現(xiàn)定
量檢測(cè)。本實(shí)用新型霍亂檢測(cè)分型試紙通過(guò)將UCP顆粒作為標(biāo)記物與免疫層析技術(shù)相結(jié) 合，并將傳統(tǒng)的單靶標(biāo)檢測(cè)免疫層析試紙拓展為多重檢測(cè)，最終所建立的基于多重UPT-LF 的霍亂檢測(cè)分型試紙，具有操作簡(jiǎn)便、快速、敏感性高、特異性好的特點(diǎn)，可在野外現(xiàn)場(chǎng)實(shí)現(xiàn) 樣品中01群與0139群霍亂弧菌的定量檢測(cè)與分型。

圖1 本實(shí)用新型霍亂檢測(cè)分型試紙結(jié)構(gòu)圖；圖2 本實(shí)用新型霍亂檢測(cè)分型試紙粘貼示意圖；圖3 本實(shí)用新型霍亂檢測(cè)分型試紙結(jié)果判讀示意圖。1、樣品墊、2、結(jié)合墊、3、分析膜、4、吸水墊、5、粘性底襯、6、UCP結(jié)合物混合物、7、 UCP-Ol群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物、8、UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物、9、UCP_羊IgG結(jié) 合物、10、檢測(cè)帶Tl、11、檢測(cè)帶T2、12、質(zhì)控帶、13、01群霍亂弧菌、14、0139群霍亂弧菌。a、檢測(cè)結(jié)合物、b、質(zhì)控結(jié)合物、c、UCP結(jié)合物混合物、d、液體樣品流動(dòng)方向、e、傳 感器掃描方向、χ、試紙條位置、y、檢測(cè)信號(hào)。A、01群與0139群陰性樣品、B、01群霍亂弧菌陽(yáng)性樣品(檢測(cè)帶Tl陽(yáng)性)、C、0139 群霍亂弧菌陽(yáng)性樣品(檢測(cè)帶T2陽(yáng)性)、D、01群與0139群霍亂弧菌陽(yáng)性樣品(檢測(cè)帶Tl 與檢測(cè)帶T2陽(yáng)性)。
以下結(jié)合附圖進(jìn)一步說(shuō)明本實(shí)用新型。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 本實(shí)用新型霍亂檢測(cè)分型試紙及其制備方法本實(shí)用新型霍亂檢測(cè)分型試紙的結(jié)構(gòu)組成為樣品墊[1]、結(jié)合墊[2]、分析膜 [3]、吸水墊[4]和粘性底襯[5](如附圖1所示)。其中，結(jié)合墊[2]中固定有UCP結(jié)合物混 合物[6]，UCP結(jié)合物混合物[6]中包括兩種檢測(cè)結(jié)合物和一種質(zhì)控結(jié)合物，兩種檢測(cè)結(jié)合 物為UCP-Ol群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7]和UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8]，一種 質(zhì)控結(jié)合物為UCP-羊IgG結(jié)合物[9]；分析膜[3]上設(shè)置有檢測(cè)帶Tl [10]、檢測(cè)帶T2 [11] 和質(zhì)控帶C[12]；樣品墊[1]、結(jié)合墊[2]、分析膜[3]和吸水墊[4]依次粘貼于粘性底襯[5] 上，其中分析膜[3]貼于粘性底襯[5]的中間，吸水墊[4]貼于分析膜[3]的一側(cè)，兩者重合部分為吸水墊[4]長(zhǎng)度的1/10 ；結(jié)合墊[2]貼于分析膜[3]的另一側(cè)，兩者重合部分為 結(jié)合墊[2]長(zhǎng)度的1/8 ；樣品墊[1]貼于結(jié)合墊[2]的另一側(cè)，兩者重合部分為樣品墊[1] 長(zhǎng)度的1/4。本實(shí)用新型霍亂檢測(cè)分型試紙的制備方法為A.結(jié)合墊[2]的制備將兩種檢測(cè)結(jié)合物(UCP-01群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[7] 和UCP-0139群霍亂弧菌單抗A結(jié)合物[8])和一種質(zhì)控結(jié)合物(UCP-羊IgG結(jié)合物[9]) 混合，得UCP結(jié)合物混合物W]，用pH = 7. 2的0. 03MPB含5% BSA、5%海藻糖和5%蔗糖 的混合液作為結(jié)合物稀釋液將UCP結(jié)合物混合物[6]稀釋至終濃度為2mg/ml，將UCP結(jié)合 物混合物[6]加于玻璃纖維上，于40°C下烘干1.5h，得結(jié)合墊[2]，備用；B.分析膜[3]的制備將1. 5mg/ml 01群霍亂弧菌單抗BU. 5mg/ml 0139群霍亂 弧菌單抗B和1. 5mg/ml兔抗羊IgG噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上分別作為檢測(cè)帶Tl [10]、檢測(cè)帶 T2[ll]和質(zhì)控帶C[12]，于37°C下烘干40分鐘，得分析膜[3]，備用；C.將樣品墊[1]、結(jié)合墊[2]、分析膜[3]和吸水墊[4]依次粘貼于粘性底襯[5] 上，確保相互之間的重疊關(guān)系(如附圖2所示)；將試紙剪切為4mm寬單獨(dú)可用的成品，得 本實(shí)用新型霍亂檢測(cè)分型試紙；成型的試紙可直接使用或置入塑料外殼中使用。使用本實(shí)用新型霍亂檢測(cè)分型試紙檢測(cè)分型霍亂弧菌的方法A.樣品預(yù)處理水樣、食品、糞便等樣品可直接檢測(cè)或用堿性蛋白胨水增菌4. 5h 后再進(jìn)行檢測(cè)；B.樣品處理將1倍體積經(jīng)過(guò)預(yù)處理的樣品與1倍體積樣品處理液(0. 15M pH = 7. 2PB 含 0. 3M NaCl,0. 3% SDS)混合；C.添加樣品將處理后的液體樣品滴加至上述本實(shí)用新型霍亂檢測(cè)分型試紙的 樣品墊[1]上；D.層析反應(yīng)靜置數(shù)分鐘待層析反應(yīng)完成；E.結(jié)果判讀用上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器對(duì)試紙進(jìn)行掃描；定性檢測(cè)只有質(zhì)控帶C[12]有信號(hào)產(chǎn)生(如附圖3A所示)，則樣品為01群霍亂 弧菌[13]與0139群霍亂弧菌[14]陰性；檢測(cè)帶Tl [10]與質(zhì)控帶C[12]有信號(hào)產(chǎn)生(如 附圖3B所示)，則樣品為01群霍亂弧菌[13]陽(yáng)性；檢測(cè)帶T2[ll]與質(zhì)控帶C[12]有信 號(hào)產(chǎn)生(如附圖3C所示)，則樣品為0139群霍亂弧菌[14]陽(yáng)性；檢測(cè)帶Tl [10]、檢測(cè)帶 T2[ll]、質(zhì)控帶C[12]均有信號(hào)產(chǎn)生(如附圖3D所示)，則樣品為01群霍亂弧菌[13]與 0139群霍亂弧菌[14]陽(yáng)性；檢測(cè)帶Tl[10]、檢測(cè)帶T2[ll]、質(zhì)控帶C[12]均無(wú)信號(hào)產(chǎn)生， 則層析系統(tǒng)異常檢測(cè)失敗，需進(jìn)行再次檢測(cè)；定量檢測(cè)將檢測(cè)帶Tl[10]、檢測(cè)帶T2[ll]、質(zhì)控帶C[12]的信號(hào)強(qiáng)度(即峰面 積)依次賦值于Tl、T2、C，T1/C為01群霍亂弧菌[13]的檢測(cè)值，T2/C為0139群霍亂弧 菌[14]的檢測(cè)值，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)濃度菌液標(biāo)定并繪制定量曲線后，通過(guò)任意樣品的檢測(cè)值即可獲 得該樣品中01群霍亂弧菌[13]與0139群霍亂弧菌[14]的有無(wú)及具體濃度，從而實(shí)現(xiàn)定
量檢測(cè)。
權(quán)利要求1. 一種基于多重上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)的霍亂檢測(cè)分型試紙，其特征在于該檢測(cè)分 型試紙的結(jié)構(gòu)組成為樣品墊[1]、結(jié)合墊[2]、分析膜[3]、吸水墊[4]和粘性底襯[5]；其 中，結(jié)合墊[2]中固定有UCP結(jié)合物混合物[6]；分析膜[3]上設(shè)置有檢測(cè)帶Tl [10]、檢測(cè) 帶T2[ll]和質(zhì)控帶C[12]；樣品墊[1]、結(jié)合墊[2]、分析膜[3]和吸水墊[4]依次粘貼于 粘性底襯[5]上，其中分析膜[3]貼于粘性底襯[5]的中間，吸水墊[4]貼于分析膜[3]的 一側(cè)，兩者重合部分為吸水墊[4]長(zhǎng)度的1/15-1/6 ；結(jié)合墊[2]貼于分析膜[3]的另一側(cè)， 兩者重合部分為結(jié)合墊[2]長(zhǎng)度的1/10-1/5 ；樣品墊[1]貼于結(jié)合墊[2]的另一側(cè)，兩者 重合部分為樣品墊[1]長(zhǎng)度的1/5-1/2。
專利摘要本實(shí)用新型基于多重上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)(UPT-LF)的霍亂檢測(cè)分型試紙通過(guò)將UCP顆粒作為標(biāo)記物與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，并將傳統(tǒng)的單靶標(biāo)檢測(cè)免疫層析試紙拓展為多重檢測(cè)，最終所建立的基于多重UPT-LF的霍亂檢測(cè)分型試紙，該檢測(cè)分型試紙的結(jié)構(gòu)組成為樣品墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水墊和粘性底襯，具有操作簡(jiǎn)便、快速、敏感性高、特異性好的特點(diǎn)，可在野外現(xiàn)場(chǎng)實(shí)現(xiàn)樣品中O1群與O139群霍亂弧菌的定量檢測(cè)與分型。
文檔編號(hào)G01N21/76GK201892680SQ20102029799
公開日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者周蕾, 楊瑞馥, 邱海燕, 郝民, 郭兆彪, 闞飆 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所