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安定elisa檢測(cè)試劑盒的制作方法

文檔序號(hào):5901012閱讀:217來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:安定elisa檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本實(shí)用新型涉及檢測(cè)安定殘留量的試劑盒,特別是檢測(cè)組織、 飼料、尿液中安定藥物殘留量的酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)試劑盒,ELISA(Enzyme Linked Immunosorbnent Assay)是酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定的簡(jiǎn)稱,它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種酶免技術(shù)。( 二)背景技術(shù)安定(Diaz印am)是一種鎮(zhèn)靜藥,在畜禽中應(yīng)用日益廣泛,可以增加動(dòng)物體重并可保證畜禽在長(zhǎng)途運(yùn)輸中不會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。但動(dòng)物大量攝取安定會(huì)導(dǎo)致藥物殘留于食品而被人體吸收,大劑量可產(chǎn)生中樞神經(jīng)抑制。長(zhǎng)期服用可產(chǎn)生依賴性或成癮, 突然停藥可產(chǎn)生停藥反應(yīng),表現(xiàn)為抑郁、精神激動(dòng)、失眠等。我國(guó)和歐盟等國(guó)都禁止在畜牧業(yè)中應(yīng)用。因此,檢測(cè)安定藥物在動(dòng)物性食品中的殘留量非常重要。目前,常用于安定殘留檢測(cè)的方法主要有高效液相色譜分析法(HPLC),該方法的前處理過(guò)程繁瑣、檢測(cè)費(fèi)用較高,不宜用于大量樣本篩查,推廣使用受到限制。(三)實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型所要解決的問(wèn)題是提供一種小巧輕便的安定藥物殘留量檢測(cè)試劑盒,其操作簡(jiǎn)便,檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、靈敏度高,成本低,穩(wěn)定性好,需要的技術(shù)含量不高,可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品中安定藥物殘留量的測(cè)定,減少了檢測(cè)樣本所需要的時(shí)間。本實(shí)用新型的技術(shù)方案是一種安定檢測(cè)試劑盒,包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個(gè)自封袋、一份說(shuō)明書和一份質(zhì)檢報(bào)告,其特征在于酶標(biāo)板是采用96孔試劑板作為固相載體,在試劑盒微孔條上預(yù)包被安定偶聯(lián)抗原制成的檢測(cè)板,14瓶試劑分別為7瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗、安定抗體工作液、 底物顯色液A液、底物顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液,下凹瓶位共15個(gè)。盒體是硬紙盒;96孔的聚苯乙烯酶標(biāo)板,放于真空鋁箔袋內(nèi);蓋板膜是塑料硬膜; 標(biāo)準(zhǔn)品溶液用白色帽的棕色玻璃瓶,酶標(biāo)二抗用紅色帽的白色PE塑料瓶,抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料瓶,底物顯色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶,底物顯色液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶,終止液用黃色帽的白色PE塑料瓶,濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE 塑料瓶,濃縮復(fù)溶液用藍(lán)色帽的半透明PE塑料瓶,下凹瓶位由塑料泡沫制成。酶標(biāo)板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成,每個(gè)可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔,每個(gè)反應(yīng)孔預(yù)包被安定藥物偶聯(lián)抗原;蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致;標(biāo)準(zhǔn)品溶液7瓶,Iml/瓶;酶標(biāo)二抗1瓶,12ml ;安定抗體工作液1 瓶,7ml ;底物顯色液A液1瓶,7ml ;底物顯色液B液1瓶,7ml ;終止液1瓶,7ml ;濃縮洗滌液1瓶,40ml ;濃縮復(fù)溶液1瓶,50ml。將14瓶試劑用不同大小、不同顏色的塑料瓶和玻璃瓶盛裝并固定在下凹瓶位中與酶標(biāo)板、蓋板膜、自封袋、說(shuō)明書、質(zhì)控報(bào)告一同封裝在硬紙盒內(nèi),便于攜帶和運(yùn)輸。每一個(gè)試劑盒中的試劑足夠進(jìn)行96次測(cè)定(包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔),既可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品的檢測(cè),也可以將板孔拆開多次檢測(cè)。將剩下的放回鋁箔袋中用自封袋密封,這樣可以保證試劑盒檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢測(cè)時(shí),樣本中的殘留物安定將和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的安定偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗安定抗體,加入酶標(biāo)二抗后,用TMB底物顯色,樣本吸光度值與樣本中所含
3安定藥物的殘留量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù),即可得出樣品中安定藥物的殘留量,其操作簡(jiǎn)便易行。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明本試劑盒具有很高的靈敏度動(dòng)物組織樣本的最低檢測(cè)限為Iyg/ kg、飼料樣本的最低檢測(cè)限為1(^8/1^;尿液樣本的最低檢測(cè)限為148/1;組織樣本的回收率為75% 士 10%;飼料樣本的回收率為75% 士 10%;尿液樣本的回收率為80% 士 10%; 相對(duì)于其他安定藥物檢測(cè)方法,本試劑盒所需儀器較少,只需要酶標(biāo)儀、氮?dú)獯蹈裳b置、渦旋儀、離心機(jī)、振蕩機(jī)和微量加樣器等,同類實(shí)驗(yàn)室一般均有配備,所需成本較低。本實(shí)用新型的有益效果是能快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確地用于安定藥物殘留量的檢測(cè)。


圖1為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的側(cè)面縱剖面圖(長(zhǎng)為8. 55cm);圖2為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的側(cè)面橫剖面圖(長(zhǎng)為12. 8cm);圖3為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的俯視圖;圖4為本實(shí)用新型蓋板膜平面圖;圖fe為本實(shí)用新型試劑瓶縱剖面平面圖;圖恥為本實(shí)用新型試劑瓶縱剖面平面圖;圖5c為本實(shí)用新型試劑瓶縱剖面平面圖;圖5d為本實(shí)用新型試劑瓶縱剖面平面圖;圖6為本實(shí)用新型固定泡沫模具的俯視圖;圖7為本實(shí)用新型盒體與固定泡沫模具的側(cè)視圖。參見附圖酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)預(yù)包被安定偶聯(lián)抗原(3)固定于酶標(biāo)板的外框支撐架(1)上,酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)可隨要求拆卸;蓋板膜(4)用于酶標(biāo)板置水浴或恒溫箱內(nèi)反應(yīng)時(shí)封蓋酶標(biāo)反應(yīng)微孔條O),蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致;透明帽的半透明塑料試劑瓶( 用于封裝40ml濃縮洗滌液;藍(lán)色帽的半透明塑料試劑瓶( 用于封裝50ml 濃縮復(fù)溶液;白色帽(6)的白色塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml顯色液A液,紅色帽(6)的黑色塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml顯色液B液,黃色帽(6)的白色塑料試劑瓶(7)用于封裝 7ml終止液,紅色帽的白色塑料試劑瓶(8)用于封裝12ml酶標(biāo)二抗,綠色帽的白色塑料試劑瓶(8)用于封裝7ml安定抗體工作液,白色帽的棕色玻璃試劑瓶(9)用于封裝Iml/瓶的標(biāo)準(zhǔn)品溶液;泡沫塑料模具(10)有15個(gè)瓶位,放置位置依次為40ml濃縮洗滌液瓶位(18), 50ml濃縮復(fù)溶液(11),7ml顯色液A液瓶位(14),7ml顯色液B液瓶位(1 ,7ml終止液瓶位(12),7ml安定抗體工作液瓶位(16),12ml酶標(biāo)二抗瓶位(15),7種Iml/瓶各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液瓶位(17),盒體為(19)是硬紙盒。
具體實(shí)施方式
一、樣本的前處理1.配液配液1 :0. IM氫氧化鈉溶液稱取2. Og氫氧化鈉,加去離子水溶解定溶至500ml。[0026]配液2:復(fù)溶工作液用去離子水將2X濃縮復(fù)溶液按1 1體積比進(jìn)行稀釋(1份2X濃縮復(fù)溶液+1 份去離子水)用于提取樣本的復(fù)溶,復(fù)溶工作液在4°C環(huán)境可保存一個(gè)月。配液3 洗滌工作液用去離子水將20X濃縮洗滌液按1 19體積比進(jìn)行稀釋(1份20X濃縮洗滌液 +19份去離子水)用于酶標(biāo)板的洗滌,洗滌工作液在4°C環(huán)境可保存一個(gè)月。2. (a)動(dòng)物組織(肌肉、肝臟等)樣本處理步驟取適量樣本用勻漿機(jī)4000r/min以上勻漿Imin ;稱取2. 0 士0. 05g勻漿物至50ml 聚苯乙烯離心管中,加入8ml0. IM氫氧化鈉溶液,用振蕩器劇烈振蕩5min ;3000g以上,15°C 離心IOmin ;移取Iml上清液加入IOml正己烷,用振蕩器振蕩5min,3000g以上,15°C離心 5min ;取5ml上層正己烷相在50°C氮?dú)饬飨峦耆稍铮挥肐ml稀釋后的復(fù)溶液溶解殘留物; 取50 μ 1用于分析。(b)尿液樣本處理步驟取Iml清亮尿樣于50ml離心管中加入細(xì)1 0. IM氫氧化鈉溶液,振蕩2 5min ;取 Iml混合液到另一離心管中加入IOml正己烷,振蕩5min,3000g以上速度,15°C離心5min ; 取5ml上層正己烷相在50°C氮?dú)饬飨峦耆稍?;取Iml稀釋后的復(fù)溶液溶解殘留物;取 50 μ 1用于分析。(c)飼料樣本處理步驟取1 士0. 05g飼料于50ml離心管中加入Iml去離子水和:3ml 0. IM氫氧化鈉溶液溶液渦動(dòng)Imin再加入IOml正己烷,振蕩lOmin,3000g以上速度,15°C離心IOmin ;取Iml上層正己烷相,用50°C氮?dú)獯蹈?;取Iml稀釋后的復(fù)溶液溶解殘留物。取50 μ 1用于分析。再按如下方法進(jìn)行稀釋配合料將樣本提取液與稀釋后的復(fù)溶液按1 9體積比進(jìn)行稀釋檢測(cè)(1份樣本提取液+9份稀釋后的復(fù)溶液)二、使用試劑盒的操作步驟1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出,置于室溫Q0-25°C )平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。[0040]2、按需要取出微孔條及板架,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2_8°C。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號(hào)將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。5、加標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣本溶液加標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣本溶液50 μ 1到對(duì)應(yīng)的微孔中,再加入抗體工作液50 μ 1/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置于25°C避光環(huán)境中反應(yīng) 30min。6、洗板小心揭開蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,用洗滌工作液250 μ 1/孔,充分洗滌 4-5次,每次間隔10s,用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭刺破)。7、加酶標(biāo)二抗加入酶標(biāo)二抗100 μ 1/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25°C 避光環(huán)境中反應(yīng)30min,取出重復(fù)洗板步驟6。8、顯色加入底物顯色液A液50 μ 1/孔,再加底物顯色液B液50 μ 1/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15min。9、測(cè)定加入終止液50 μ 1/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè),請(qǐng)?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)),測(cè)定每孔OD值。三、結(jié)果判定結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與安定藥物含量成負(fù)相關(guān)。1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值比較即可得出其濃度范圍(μ g/L)。 假設(shè)樣本ι的吸光度值為0. 211,樣本2的吸光度值為0. 785,標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是 0 μ g/L 為 2. 100 ;0. 1 μ g/L 為 1. 580 ;0. 2 μ g/L 為 1. 010 ;0. 4 μ g/L 為 0. 580 ;0. 8 μ g/L 為 0. 308 ; 1.6 μ g/L為0. 120。則樣本1的濃度范圍是0. 8 μ g/L_l. 6 μ g/L再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中安定藥物殘留的濃度范圍;樣本2的濃度范圍是0. 2μ g/L-Ο. 4μ g/ L再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中安定藥物殘留的濃度范圍。2、定量分析(1)百分吸光率的計(jì)算,標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即
B
百分吸光度值(%) = - X 100%
B0B-標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值BO-O μ g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以安定標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μ g/L)的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中安定藥物實(shí)際含量。四、測(cè)定前的注意事項(xiàng)1、室溫低于20°C或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫Q0-25°C )會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。2、在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。3、每加一種試劑前需將其搖勻。4、反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。5、不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒;也不要使用過(guò)了有效期的試劑盒中的任何試劑,摻雜使用過(guò)了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低;不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。6、儲(chǔ)存條件保存試劑盒于2_8°C,不要冷凍,將不用的酶標(biāo)板微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。7、試劑變質(zhì)的跡象顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度G50/630nm)值小于
60. 5 (A450nm < 0. 5)時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。8、在加入底物液A液和底物液B液后,一般顯色10-15min即可。若顏色較淺,可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到20min(或更長(zhǎng)),但不得超過(guò)30min。反之,則減短反應(yīng)時(shí)間。9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25°C,溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
權(quán)利要求1.一種安定ELISA檢測(cè)試劑盒,包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋板膜、 14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個(gè)自封袋、一份說(shuō)明書和一份質(zhì)檢報(bào)告,其特征在于酶標(biāo)板是采用96孔試劑板作為固相載體,在試劑盒微孔條上預(yù)包被安定偶聯(lián)抗原制成的檢測(cè)板,14瓶試劑分別為7瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗、安定抗體工作液、底物顯色液A液、底物顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液,下凹瓶位共15個(gè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于盒體是硬紙盒;96孔的聚苯乙烯酶標(biāo)板,放于真空鋁箔袋內(nèi);蓋板膜是塑料硬膜;標(biāo)準(zhǔn)品溶液用白色帽的棕色玻璃瓶,酶標(biāo)二抗用紅色帽的白色PE塑料瓶,抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料瓶,底物顯色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶,底物顯色液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶,終止液用黃色帽的白色PE 塑料瓶,濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶,濃縮復(fù)溶液用藍(lán)色帽的半透明PE塑料瓶,下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于酶標(biāo)板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成,每個(gè)可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔,每個(gè)反應(yīng)孔預(yù)包被安定藥物偶聯(lián)抗原;蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致;標(biāo)準(zhǔn)品溶液7瓶,Iml/ 瓶;酶標(biāo)二抗1瓶,12ml ;安定抗體工作液1瓶,7ml ;底物顯色液A液1瓶,7ml ;底物顯色液 B液1瓶,7ml ;終止液1瓶,7ml ;濃縮洗滌液1瓶,40ml ;濃縮復(fù)溶液1瓶,50ml。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)組織、飼料、尿液中安定殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、安定抗體工作液、7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液、蓋板膜、自封袋、說(shuō)明書和質(zhì)檢報(bào)告。采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法,在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中含有的安定藥物將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗安定藥物的抗體,加入酶標(biāo)二抗后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含安定藥物的殘留量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較,再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù),即可得出樣品中殘留物安定藥物的殘留量。與儀器分析技術(shù)相比具有使用方便、高靈敏度等特點(diǎn),可在組織、飼料、尿液中安定藥物的殘留量檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)G01N33/558GK201993365SQ201020586589
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2010年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月27日
發(fā)明者何麗霞, 何方洋, 馮月君, 段盈盈, 王建霞, 羅貴昆, 趙正苗 申請(qǐng)人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司
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