專利名稱：一種檢測(cè)東方馬腦炎抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)東方馬腦炎抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
東方馬腦炎(eastern equine encephalitis, EEE)于1933年首先發(fā)現(xiàn)在美國(guó)東部的馬場(chǎng)內(nèi)，從病馬腦組織中分離出病毒，1938年從病人腦組織中也分離出同樣病毒。東方馬腦炎病毒(EEEV)是披膜病毒科α病毒屬家族中的一員，而且與委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒極為相似，因其實(shí)驗(yàn)室感染的機(jī)會(huì)多，感染后發(fā)病的可能性大，癥狀重并能危及生命，缺乏有效的預(yù)防方法，傳染性強(qiáng)，對(duì)人群危害性大，其臨床表現(xiàn)與乙型腦炎很相似，病死率約在 35%以上。該病毒也是目前國(guó)際社會(huì)列為防生物恐怖的主要種類之一，國(guó)內(nèi)屬一類管理的病毒種類，備受關(guān)注。免疫學(xué)方法酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)(ELISA)中利用抗原與抗體特異性反應(yīng)來(lái)檢測(cè)抗原或抗體主要有由雙抗原夾心測(cè)抗體、雙抗體夾心測(cè)抗原、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法等。間接法測(cè)抗體的原理是特異性抗原結(jié)合到固相載體上，然后和待檢血清中的相應(yīng)抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加酶標(biāo)記抗體與免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合形成酶標(biāo)記抗體-抗體-固相抗原復(fù)合物，加底物顯色，判斷抗體含量。懸浮芯片(suspension array)也稱液相芯片，是20世紀(jì)70年代美國(guó)Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術(shù)，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細(xì)胞儀作為檢測(cè)平臺(tái)，對(duì)核酸、蛋白質(zhì)等生物分子進(jìn)行大規(guī)模測(cè)定。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析、抗體篩選及受體與配體的識(shí)別分析等領(lǐng)域。目前發(fā)展的懸浮芯片主要是基于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的建立和方法評(píng)價(jià)及優(yōu)化，以縮短檢測(cè)時(shí)間，降低方法的檢測(cè)成本。但是懸浮芯片是否能夠檢測(cè)人血清中的東方馬腦炎抗體，其定量檢測(cè)能力如何，尚缺乏模型和評(píng)價(jià)。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型的目的在于提供一種檢測(cè)東方馬腦炎病毒抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)， 該芯片系統(tǒng)包括芯片基體、加液系統(tǒng)、懸浮芯片檢測(cè)儀和計(jì)算機(jī)，其中，芯片基體內(nèi)裝有相關(guān)緩沖溶液和待測(cè)抗體，相關(guān)緩沖液中設(shè)置有包被捕獲抗原的011號(hào)編碼微球，加液系統(tǒng)與芯片基體連通，以向芯片基體中加入生物素標(biāo)記的二抗、熒光信號(hào)檢測(cè)物，懸浮芯片檢測(cè)儀包括微細(xì)管檢測(cè)通道和檢測(cè)激光，微細(xì)管檢測(cè)通道與芯片基體連通，該微細(xì)管檢測(cè)通道吸入反應(yīng)后的溶液、以使得每個(gè)編碼微球依次通過(guò)微細(xì)管檢測(cè)通道，檢測(cè)激光激發(fā)并識(shí)別編碼微球的顏色及其上待測(cè)物的熒光信號(hào)，計(jì)算機(jī)與懸浮芯片檢測(cè)儀相連，并記錄、分析懸浮芯片檢測(cè)儀的測(cè)量結(jié)果。進(jìn)一步，所述相關(guān)緩沖溶液包括用于所述待測(cè)抗體稀釋的樣品稀釋液、稀釋所述編碼微球所用的微球稀釋液、稀釋所述生物素標(biāo)記的二抗所用的抗體稀釋液、每個(gè)反應(yīng)之后洗滌編碼微球所用的微球清洗液、SA-PE稀釋液、檢測(cè)緩沖液。[0008]進(jìn)一步，所述捕獲抗原優(yōu)選為東方馬腦炎ElC蛋白。進(jìn)一步，所述待測(cè)抗體為血清樣品。進(jìn)一步，所述生物素標(biāo)記的二抗優(yōu)選為Biotin-羊抗兔IgG和/或Biotin-羊抗 AlgGo 進(jìn)一步，所述熒光信號(hào)檢測(cè)物為鏈親和素-藻紅蛋白。進(jìn)一步，所述芯片基體為96孔濾板或者微量離心管。進(jìn)一步，所述檢測(cè)激光包括用激發(fā)所述編碼微球基質(zhì)中的顏色、識(shí)別編碼微球分類編碼以確定檢測(cè)項(xiàng)目的紅色激光，用于激發(fā)并識(shí)別待測(cè)分子的顏色信號(hào)、記錄信號(hào)強(qiáng)弱以檢測(cè)所述待測(cè)抗體的含量的綠色激光。經(jīng)過(guò)大量和深入的研究，對(duì)東方馬腦炎抗體的蛋白懸浮芯片制備及其檢測(cè)條件作了實(shí)質(zhì)性的改進(jìn)和創(chuàng)新，其具有下列優(yōu)點(diǎn)1、抗原包被量的改進(jìn)東方馬腦炎ElC蛋白的包被量是成功檢測(cè)的關(guān)鍵，本實(shí)用新型對(duì)包被微球的抗原包被量進(jìn)行實(shí)質(zhì)性優(yōu)化使血清樣本的檢測(cè)效果非常良好，并且包被懸浮芯片所需的抗原包被量很低，本實(shí)用新型的東方馬腦炎ElC蛋白抗原包被量為0. 1 100yg/1.25X 106個(gè)編碼微球或0. 02 400ng/2500 5000個(gè)微球/測(cè)試，而一般的ELISA試驗(yàn)所需抗原的包被量為Iyg/測(cè)試。2、生物素標(biāo)記的改進(jìn)通常，標(biāo)記抗體需要使用過(guò)量的生物素。理論上講，在檢測(cè)過(guò)程中，過(guò)量的生物素因未標(biāo)記上抗體而不被微球上結(jié)合捕獲抗體的抗原連接，清洗時(shí)被抽濾掉，不會(huì)與隨后加入的SA-PE反應(yīng)，不影響檢測(cè)。但在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，偶爾遇到過(guò)檢測(cè)信號(hào)可能過(guò)高的現(xiàn)象，因此建議生物素標(biāo)記抗體后，盡量去除多余的生物素。以標(biāo)記ang/mL的IgG(分子量 150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約27 μ L。3、檢測(cè)的靈敏度及動(dòng)態(tài)范圍本實(shí)用新型的檢測(cè)東方馬腦炎抗體的蛋白懸浮芯片定量檢測(cè)方法和懸浮芯片的靈敏度為2. 3n g/mL ；并且懸浮芯片方法動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍為176. 5 150000ng/mL。4、方法的特異性本實(shí)用新型通過(guò)選用東方馬腦炎ElC蛋白為包被抗原，以兔抗東方馬腦炎IgG為待測(cè)抗體，以生物素化-SPA為檢測(cè)物。本研究試驗(yàn)證明，在存在兔抗圣路易斯腦炎NSl血清、鼠抗西尼羅E血清、兔抗Q熱立克次體血清、兔抗馬秋波抗體、兔抗土拉抗體、兔抗登革熱血清普氏立克次體血清、兔抗兔血清、大鼠血清、小鼠血清、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等干擾抗體存在條件下本方法具有良好的特異性。5、樣品的檢測(cè)能力本實(shí)用新型評(píng)價(jià)了懸浮芯片方法對(duì)人血清的檢測(cè)能力。通過(guò)人血清的檢測(cè)，初步證實(shí)了該方法在檢測(cè)人血清中東方馬腦炎抗體的實(shí)用性。

圖1為本實(shí)用新型結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為包被有東方馬腦炎ElC蛋白的011號(hào)微球檢測(cè)東方馬腦炎抗體示意圖1 ；[0027]圖3為包被有東方馬腦炎ElC蛋白的011號(hào)微球檢測(cè)東方馬腦炎抗體示意圖2 ；圖4為蛋白懸浮芯片方法檢測(cè)兔抗東方馬腦炎IgG劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
如圖1至圖4所示，本實(shí)用新型一種檢測(cè)東方馬腦炎病毒抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，包括芯片基體1、加液系統(tǒng)2、懸浮芯片檢測(cè)儀3和計(jì)算機(jī)4，其中，芯片基體1為96孔濾板或者微量離心管，其內(nèi)裝有相關(guān)緩沖溶液和待測(cè)抗體，相關(guān)緩沖液中設(shè)置有011編碼微球，編碼微球上包被有東方馬腦炎ElC蛋白，用于捕獲待檢測(cè)血清樣品中的待測(cè)抗體，如果樣品中有東方馬腦炎抗體，東方馬腦炎抗體與編碼微球上的東方馬腦炎ElC蛋白結(jié)合，再加入帶有生物素標(biāo)記的二抗，形成編碼微球-東方馬腦炎ElC蛋白-東方馬腦炎抗體-二抗-生物素復(fù)合物，最后加入鏈親和素-藻紅蛋白，鏈親和素與生物素結(jié)合，形成編碼微球-東方馬腦炎ElC蛋白-東方馬腦炎抗體-二抗-生物素-鏈親和素-藻紅蛋白復(fù)合物， 通過(guò)懸浮芯片檢測(cè)儀對(duì)藻紅蛋白熒光信號(hào)的檢測(cè)來(lái)達(dá)到對(duì)血清樣品中東方馬腦炎抗體的檢測(cè)，如果血清樣品中沒(méi)有東方馬腦炎抗體，包被有東方馬腦炎ElC蛋白的編碼微球不會(huì)與后面加入的生物素標(biāo)記的二抗、鏈親和素-藻紅蛋白結(jié)合，最后通過(guò)懸浮芯片檢測(cè)儀器進(jìn)行檢測(cè)時(shí)無(wú)熒光信號(hào)或應(yīng)該信號(hào)非常弱。上述芯片系統(tǒng)中，編碼微球在微球稀釋液，待測(cè)抗體在樣品稀釋液中，生物素標(biāo)記的二抗在抗體稀釋液中，熒光信號(hào)檢測(cè)物在SA-PE稀釋液中，懸浮芯片檢測(cè)儀檢測(cè)時(shí)編碼微球復(fù)合物在檢測(cè)緩沖液中，每步結(jié)合之后均用微球清洗液洗滌微球，使得沒(méi)有結(jié)合的物質(zhì)清除體系。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑，而產(chǎn)生100種不同比例顏色，作為100種獨(dú)特的色彩編號(hào)，每顆微球大小約5. 6 μ m，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識(shí)別分析等，并根據(jù)不同研究目的而標(biāo)定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。標(biāo)記探針的微球與待測(cè)物在96孔板中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后，利用機(jī)器自動(dòng)將反應(yīng)液吸起并通過(guò)一微細(xì)管檢測(cè)通道，每次僅允許一個(gè)微球通過(guò)檢測(cè)通道。檢測(cè)通道中設(shè)有兩道激光，一道為紅色，激發(fā)微球基質(zhì)中的顏色，識(shí)別微球分類編碼以確定檢測(cè)項(xiàng)目；一道為綠色，激發(fā)報(bào)告分子的顏色，記錄信號(hào)強(qiáng)弱以檢測(cè)待測(cè)物的含量。當(dāng)待測(cè)樣本與特定微球的探針吸附在一起時(shí)，兩道激光所激發(fā)的光都可被檢測(cè)到。而若樣本中不含該標(biāo)的物，則僅有微球中的激發(fā)光可被檢測(cè)到。 再通過(guò)機(jī)器與計(jì)算機(jī)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析兩道激光所激發(fā)的微球種類與數(shù)量，從而判定待測(cè)樣本中有幾種測(cè)試目標(biāo)物在其中，得知測(cè)試樣本中有無(wú)待測(cè)病原存在，或同時(shí)存在有幾種至數(shù)十種病原。懸浮芯片技術(shù)由于利用微球在溶液中反應(yīng)，克服了片膜芯片在大分子檢測(cè)時(shí)受表面張力、空間效應(yīng)等對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，同時(shí)利用激光檢測(cè)技術(shù)，大大提高了樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等特點(diǎn)。本實(shí)用新型一種檢測(cè)東方馬腦炎抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，通過(guò)下面的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步說(shuō)明，但本實(shí)用新型不以任何方式受該實(shí)施例的限定。一、材料1.蛋白懸浮芯片的相關(guān)緩沖液(I)PBS 緩沖液(pH7. 4) =NaCl 137mmol/L ；KCl 2. 7mmol/L ；Na2HPO4IOmmo 1/L ；KH2PO4 2mmol/L0 用 800mL 蒸餾水溶解 8gNaCl，0. 2gKCl，1. 44gN￡i2HP04 和 0. 24g KH2PO40 用 HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 4，加水至1L。分裝后在121°C高壓滅菌20分鐘，或過(guò)濾除菌，保
存于室溫。(2)微球清洗液:PBS(ρΗ7· 4) ,0. 05% TWEEN-20。(3)微球活化緩沖液 IOOmM NaH2PO4 :3g NaH2PO4, 5N NaOH 1. 5mL，定容于 250mL， ρΗ6· 2。(4)微球包被緩沖液 0· 05Μ MES, pH5. 0 2. 44g MES，5N NaOH 0. 15mL，定容于 250mLo(5)微球保存液 PBS-TBN :PBS，0. 1 % BSA，0. 02 % Tween-20,0. 05 % 疊氮化物， ρΗ7· 4。(6)微球封閉液 PBS-BN =PBS, 1% BSA,0. 05%疊氮化物，ρΗ7· 4。(7)檢測(cè)緩沖液:PBS,1% BSA, ρΗ7· 4。(8)抗體稀釋液 PBS，ρΗ7· 4。。(9)微球稀釋液:PBS, 1 % BSA, ρΗ7· 4。(10)樣品稀釋液 PVX :PBS,0. 5% PVA,0. 8% PVP ；(11) SA-PE 稀釋液:PBS (ρΗ7· 4), 1% BSA02.抗原與抗體本實(shí)用新型所使用抗原東方馬腦炎ElC蛋白，其可購(gòu)自中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院衛(wèi)檢所。本實(shí)用新型所使用待測(cè)抗體為兔抗東方馬腦炎IgG，其可購(gòu)自中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院衛(wèi)檢所，檢測(cè)抗體為生物素化羊抗兔IgG和生物素化SPA，其可購(gòu)自鼎國(guó)生物有限公
司ο二、待測(cè)樣品的制備1、目標(biāo)分析物樣品的制備目標(biāo)分析物為兔抗東方馬腦炎IgG，干擾樣品或作為方法特異性測(cè)試的樣品是目標(biāo)檢測(cè)物外的其它抗體或其它蛋白質(zhì)，包括兔抗圣路易斯腦炎NSl血清、鼠抗西尼羅E血清、兔抗Q熱立克次體血清、兔抗馬秋波抗體、兔抗土拉抗體、兔抗登革熱血清普氏立克次體血清、兔抗兔血清、大鼠血清、小鼠血清、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等。將上述待分析樣品均溶于樣品稀釋液液中，4°C保存。兔抗東方馬腦炎IgG的儲(chǔ)備液濃度為0. 15mg/mL。將待分析的兔抗東方馬腦炎IgG用樣品稀釋液以4倍倍比系列稀釋為不同濃度樣品，以繪制樣品檢測(cè)劑量-反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中幾個(gè)樣品濃度低于檢測(cè)的敏感度，高濃度樣品應(yīng)使編碼微球的結(jié)合位點(diǎn)處于飽和狀態(tài)。2、人血清樣本的處理將人血清樣本用樣品稀釋1 10稀釋，例如人血清樣本5 μ L加樣品稀釋液50 μ L 混勻后，作為待檢樣品進(jìn)行懸浮芯片方法的檢測(cè)。實(shí)施例1、檢測(cè)東方馬腦炎抗體的蛋白懸浮芯片的制備1、捕獲抗原包被編碼微球本實(shí)用新型采用的011號(hào)編碼微球購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，編碼微球用于標(biāo)記可以捕獲東方馬腦炎抗體的東方馬腦炎ElC蛋白抗原，即利用東方馬腦炎ElC蛋白包被微球。[0058]A、編碼微球的活化取100 μ L (1. 25 X IO6個(gè))編碼微球到1. 5mL離心管中，14000 X g離心，小心吸出并棄去上清液。加入100 μ L的微球清洗緩沖液懸浮，震蕩并超聲后14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入100 μ L的微球活化緩沖液，接著先加入10 μ L新鮮配置的EDC(50mg/ mL)，再加入10 μ L新鮮配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震蕩30秒后用鋁箔包裹，在室溫震搖20分鐘。加入150 μ L的PBS (ρΗ7. 4)，震蕩后，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入100 μ L的PBS (ρΗ7. 4)懸浮編碼微球。B、用抗原包被編碼微球取捕獲抗原東方馬腦炎ElC蛋白抗原1 50yg加入到活化后的編碼微球中，用 PBS緩沖液定容至500 μ L，室溫震搖2小時(shí)。14000Xg離心，小心吸出并棄去上清液。用 500 μ L的PBS緩沖液洗一次，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入250 μ L的封閉緩沖液懸浮編碼微球，在室溫震搖30分鐘，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入500 μ L的微球保存液洗滌編碼微球，16000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。最后用 150 μ L的微球保存液懸浮編碼微球，于4°C避光保存?zhèn)溆?。C、包被微球的計(jì)數(shù)吸取適量微球，稀釋后，用血球計(jì)數(shù)板(0. 10mm;l/400mm2)在普通顯微鏡下計(jì)數(shù)。 根據(jù)公式(每個(gè)大格數(shù)Xio4X稀釋倍數(shù)X體積(mL))計(jì)算微球數(shù)量。2、檢測(cè)抗體標(biāo)記生物素A、生物素的標(biāo)記分別配制好濃度為IOmM生物素溶液和^iig/mL的待標(biāo)記抗體溶液，將計(jì)算好體積的生物素加入到待標(biāo)記抗體溶液中，在室溫震搖30分鐘(或冰上2小時(shí))，過(guò)柱脫鹽后分裝，-20°C凍存?zhèn)溆谩、抗體的用量以標(biāo)記2mg/mL的IgG (分子量150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約 27 μ 1。實(shí)施例2、懸浮芯片制備法條件的優(yōu)化1、微球包被抗原包被量的選擇分別以1 μ g、5y g、10y g、15y g、20y g、25y g、30y g、35y g、40y g、45y g、50y g 的量包被100 μ L編碼為011號(hào)的微球。經(jīng)檢測(cè)效果比較，以1 50 μ g/1. 25X IO6個(gè)編碼微球即0. 2 200ng/250() 5000個(gè)微球/包被效果最好，顯微鏡下計(jì)數(shù)后避光冷藏保存待用。如圖1所示，包被東方馬腦炎ElC蛋白抗原的011號(hào)微球均落在其正確檢測(cè)區(qū)域內(nèi)， 并且獲得高信噪比結(jié)果(MFI值遠(yuǎn)大于2000)，說(shuō)明優(yōu)化的懸浮芯片檢測(cè)系統(tǒng)可成功用于東方馬腦炎抗體的檢測(cè)。2、生物素化抗體的優(yōu)化本實(shí)用新型分別用氨基活性的生物素，例如LC-酰胼(hydrazide)-生物素和羧基活性的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體，經(jīng)質(zhì)控過(guò)程檢測(cè)效果比較，本實(shí)驗(yàn)中Sulfo-NHS-生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體檢測(cè)效果較好，檢測(cè)效果的方法采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法或安裝制造商的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)所述的方法。本實(shí)用新型中經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)ang/mL生物素化的羊抗兔抗體以1 500稀釋作為檢測(cè)抗體進(jìn)行檢測(cè)兔血清中東方馬腦炎抗體，檢測(cè)結(jié)果顯示生物素化檢測(cè)抗體 Bio-羊抗兔抗體可獲得高檢測(cè)值和低背景值的檢測(cè)效果；2mg/mL生物素化SPAWl 2500 稀釋作為檢測(cè)人血清中東方馬腦炎抗體，檢測(cè)結(jié)果顯示生物素化檢測(cè)抗體Bio-SPA可獲得高檢測(cè)值和低背景值的檢測(cè)效果。實(shí)施例3、樣品的制備、檢測(cè)及結(jié)果判定1、待測(cè)樣品制備用樣品稀釋液將待測(cè)樣本配置為不同濃度樣本進(jìn)行蛋白懸浮芯片檢測(cè)。2、樣品的檢測(cè)及結(jié)果判定檢測(cè)過(guò)程全部反應(yīng)均在96孔濾板上進(jìn)行，檢測(cè)過(guò)程如下1)每孔加入50 μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50 μ L檢測(cè)樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾；3)加入50 μ L適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125 μ L的檢測(cè)緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。3、檢測(cè)結(jié)果判定根據(jù)試驗(yàn)研究結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道，本實(shí)用新型定義蛋白懸浮芯片方法檢測(cè)東方馬腦炎抗體的最低檢出限(L0D值)為檢測(cè)熒光強(qiáng)度臨界值(Cutoff)對(duì)應(yīng)的檢測(cè)物濃度。 其中，Cutoff的定義是采用空白對(duì)照樣品(Blank)熒光檢測(cè)信號(hào)MFI均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差 (SD)，即Cutoff值為=MFI (空白對(duì)照)+3倍標(biāo)準(zhǔn)差。若檢測(cè)結(jié)果高于Cutoff對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度值則判定為東方馬腦炎抗體檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；若檢測(cè)結(jié)果低于Cutoff對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度值則判定為東方馬腦炎抗體檢測(cè)結(jié)果陰性。實(shí)施例4、懸浮芯片對(duì)東方馬腦炎ElC蛋白抗原的特異性試驗(yàn)應(yīng)用懸浮芯片檢測(cè)方法分別對(duì)兔抗東方馬腦炎ElC IgG、兔抗圣路易斯腦炎NSl 血清、鼠抗西尼羅E血清、兔抗Q熱立克次體血清、兔抗馬秋波抗體、兔抗土拉抗體、兔抗登革熱血清普氏立克次體血清、兔抗兔血清、大鼠血清、小鼠血清、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)實(shí)施例3中檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，僅兔抗東方馬腦炎IgG為陽(yáng)性，其余干擾抗體或蛋白均為陰性。說(shuō)明本實(shí)用新型所建立的東方馬腦炎抗體的懸浮芯片檢測(cè)方法與其它測(cè)試抗體均不發(fā)生交叉反應(yīng)或非特異反應(yīng)。實(shí)施例5、對(duì)血清樣品中東方馬腦炎抗體的懸浮芯片定量檢測(cè)1、兔抗東方馬腦炎IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品制備用樣品稀釋液將兔抗東方馬腦炎IgG標(biāo)準(zhǔn)品由0. 15mg/mL以4倍倍比梯度稀釋至 0. 57ng/mL成系列濃度樣品。2、劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按照實(shí)施例3中的檢測(cè)方法檢測(cè)上述系列濃度樣品，并根據(jù)懸浮芯片系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果繪制劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2所示)。其中，X軸代表抗體的濃度(ng/mL)，Y軸代表懸浮芯片儀檢測(cè)的熒光值(MFI)。每個(gè)數(shù)據(jù)代表3次的檢測(cè)結(jié)果平均值，坐標(biāo)軸以對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)關(guān)系設(shè)定，圖2中兔抗東方馬腦炎的濃度(ng/mL)分別為做4倍比稀釋范圍為S1 :0. 57，S2 2. 29，S3 9. 16，S4 :36. 62，S5 :146. 48，S6 :585. 94，S7 :2343. 75，S8 :9375, S9 :37500, SlO :150000ο懸浮芯片系統(tǒng)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果擬合兔抗東方馬腦炎IgG劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為FI = -0. 888377+(9373. 49+0. 888377) / [1+(Cone/2662. 72)_0· 781091J 1-666383、本實(shí)用新型懸浮芯片法檢測(cè)血清中兔抗東方馬腦炎IgG的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍根據(jù)最低檢出限定義和劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，本實(shí)用新型即蛋白懸浮芯片方法檢測(cè)兔抗東方馬腦炎IgG的靈敏度為2. 3ng/mL。本實(shí)用新型定義最高檢出限為使編碼微球的結(jié)合位點(diǎn)處于飽和狀態(tài)的檢測(cè)物濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線隨著兔抗東方馬腦炎ElC抗體濃度的升高，其對(duì)應(yīng)的MFI值也隨之遞增，當(dāng)兔抗東方馬腦炎ElC抗體濃度超過(guò)150000ng/mL時(shí)，抗原抗體的免疫反應(yīng)未達(dá)到飽和狀態(tài)，MFI值還沒(méi)進(jìn)入平臺(tái)期，說(shuō)明樣品中的待檢物濃度還沒(méi)達(dá)到使MFI值飽和的濃度， 需要高濃度的樣品再檢測(cè)，但受樣品濃度只能達(dá)到150000ng/mL的限制未能確定最高檢測(cè)限，但可初步判定本實(shí)用新型即懸浮芯片定量檢測(cè)兔抗東方馬腦炎IgG的動(dòng)態(tài)范圍為 146.48 150000ng/mL。實(shí)施例6、人血清樣品的檢測(cè)1、人血清樣品的準(zhǔn)備將人血清樣品用樣品稀釋液1 10稀釋(人血清樣本5 μ L加樣品稀釋液50 μ L 混勻)后用于蛋白懸浮芯片檢測(cè)。2、人血清樣品的檢測(cè)1)每孔加入50 μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50 μ L待檢測(cè)人血清樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾；3)加入50 μ L適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化羊抗人抗體，混勻后室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125 μ L的檢測(cè)緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待檢測(cè)人血清中東方馬腦炎抗體的濃度。經(jīng)過(guò)多次重復(fù)試驗(yàn)，生物素化SPA稀釋比例選用1 2500稀釋，SA-PE稀釋比例選用1 300稀釋，經(jīng)過(guò)對(duì)94份人血清的檢測(cè)，所得的MFI值的均值與其標(biāo)準(zhǔn)差的3倍之和為作為判斷陰陽(yáng)性的界值，即Cutoff值1548，檢測(cè)得到的MFI值如果大于巧48，即血清中的東方馬腦炎抗體濃度過(guò)高，可視為東方馬腦炎抗體陽(yáng)性可能被東方馬腦炎病毒感染， 如果MFI值小于1548，即血清中的東方馬腦炎抗體濃度低正常值可判斷為東方馬腦炎抗體陰性，未感染東方馬腦炎病毒或東方馬腦炎病毒隱性攜帶者。
權(quán)利要求1.一種檢測(cè)東方馬腦炎病毒抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，該芯片系統(tǒng)包括 芯片基體、加液系統(tǒng)、懸浮芯片檢測(cè)儀和計(jì)算機(jī)，其中，芯片基體內(nèi)裝有011號(hào)編碼微球，加液系統(tǒng)與芯片基體連通，以向芯片基體中加入生物素標(biāo)記的二抗、熒光信號(hào)檢測(cè)物，懸浮芯片檢測(cè)儀包括微細(xì)管檢測(cè)通道和檢測(cè)激光，微細(xì)管檢測(cè)通道與芯片基體連通，該微細(xì)管檢測(cè)通道吸入反應(yīng)后的溶液、以使得每個(gè)編碼微球依次通過(guò)微細(xì)管檢測(cè)通道，檢測(cè)激光激發(fā)并識(shí)別編碼微球的顏色及其上待測(cè)物的熒光信號(hào)，計(jì)算機(jī)與懸浮芯片檢測(cè)儀相連，并記錄、 分析懸浮芯片檢測(cè)儀的測(cè)量結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述捕獲抗原優(yōu)選為東方馬腦炎ElC蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述熒光信號(hào)檢測(cè)物為鏈親和素-藻紅蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述芯片基體為96孔濾板或者微量離心管。
5.如權(quán)利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測(cè)激光包括用激發(fā)所述編碼微球基質(zhì)中的顏色、識(shí)別編碼微球分類編碼以確定檢測(cè)項(xiàng)目的紅色激光，用于激發(fā)并識(shí)別待測(cè)分子的顏色信號(hào)、記錄信號(hào)強(qiáng)弱以檢測(cè)所述待測(cè)抗體的含量的綠色激光。
專利摘要本實(shí)用新型公開(kāi)了一種檢測(cè)東方馬腦炎病毒抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，包括芯片基體、加液系統(tǒng)、懸浮芯片檢測(cè)儀和計(jì)算機(jī)，芯片基體內(nèi)裝有相關(guān)緩沖溶液和待測(cè)抗體，相關(guān)緩沖液中設(shè)置有011號(hào)編碼微球，編碼微球上包被捕獲抗原，加液系統(tǒng)依次向芯片基體中加入生物素標(biāo)記的二抗、熒光信號(hào)檢測(cè)物，懸浮芯片檢測(cè)儀包括微細(xì)管檢測(cè)通道和檢測(cè)激光，編碼微球依次通過(guò)微細(xì)管檢測(cè)通道，檢測(cè)激光激發(fā)并識(shí)別編碼微球的顏色及其上待測(cè)物的顏色，計(jì)算機(jī)與懸浮芯片檢測(cè)儀相連，并記錄、分析懸浮芯片檢測(cè)儀的測(cè)量結(jié)果。懸浮芯片技術(shù)利用微球在溶液中反應(yīng)，利用激光檢測(cè)技術(shù)，提高了樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK202024999SQ20102068424
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2010年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月28日
發(fā)明者楊宇, 楊永莉, 王靜 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院