專利名稱：大腸腫瘤的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大腸腫瘤有無的判定方法，更詳細(xì)地說，涉及大腸癌或大腸腺瘤的判定方法，其特征在于，測定被檢細(xì)胞中的基因組序列上的人類twist同源物1 (Homo sapiens twist homolog 1)(果蠅屬(Drosophila))基因(以下記為 TWIST1)的-477 -747 中的 CpG序列的甲基化程度，還涉及大腸腫瘤判定用試劑盒。
背景技術(shù)：
在盲腸、結(jié)腸、直腸發(fā)生的大腸腫瘤的概念包括作為良性腫瘤的大腸腺瘤以及有時(shí)惡性度高、具有轉(zhuǎn)移性的大腸癌，其中，大腸癌是日本目前患病者數(shù)第二多的癌癥，已知大多數(shù)大腸癌是由于消化道內(nèi)面的粘膜上皮細(xì)胞的突變而產(chǎn)生的。認(rèn)為粘膜上皮細(xì)胞癌變的主要原因是控制細(xì)胞增殖的基因組DNA上的變異，并且其它環(huán)境因子(風(fēng)險(xiǎn)因子)、遺傳、 病毒感染等作為影響癌變的因子是已知的。與多數(shù)癌同樣，大腸癌也是早期發(fā)現(xiàn)對(duì)其治療最為重要，到目前為止已經(jīng)開發(fā)了多種檢查方法。主要的檢查方法有便潛血檢查、血液檢查、直腸指診、使用大腸內(nèi)窺鏡的診斷等，但是，便潛血檢查在早期癌的檢測靈敏度方面存在問題，血液檢查(檢查血中所含的腫瘤標(biāo)記)也存在只有對(duì)晚期癌才顯示陽性這樣的問題，直腸指診存在只能在手指能夠到達(dá)的范圍內(nèi)診斷這樣的問題，利用大腸內(nèi)窺鏡的診斷也存在對(duì)于難以視覺辨認(rèn)的早期癌的檢測靈敏度差這樣的問題，等等，各種檢查方法特別是在對(duì)早期癌的靈敏度方面都存在問題。在癌的初期階段，將要癌變的細(xì)胞的基因組DNA中發(fā)生突變，著眼于此，已經(jīng)開發(fā)出了以DNA和/或作為其表達(dá)產(chǎn)物的RNA的變異、尤其是DNA甲基化為癌變指標(biāo)的癌檢測方法。專利文獻(xiàn)1中公開了與癌變有關(guān)的人DNA序列，另外還公開了以波形蛋白基因序列上的甲基化為指標(biāo)的大腸癌的檢測方法(專利文獻(xiàn)2)、以SPARC基因的甲基化為指標(biāo)的癌檢測方法(專利文獻(xiàn)幻、利用神經(jīng)酰胺羥化酶的mRNA表達(dá)信息的癌檢測方法(專利文獻(xiàn) 4)、以APC、K-ras和p53基因的變異為指標(biāo)的大腸癌檢測方法(專利文獻(xiàn)5)、以APC和/或 DCC基因的甲基化為指標(biāo)的消化器官癌檢測方法(專利文獻(xiàn)6)等，但現(xiàn)狀是任一方法均在檢測靈敏度和/或特異性、成本等方面存在問題，不能在臨床上實(shí)用化。根據(jù)這些現(xiàn)狀，希望開發(fā)出通過以較少的基因信息為指標(biāo)，更具體來說是以1個(gè)基因序列上的甲基化為指標(biāo)，對(duì)早期的靈敏度好、與發(fā)展的程度相適應(yīng)、并且以高特異性檢測消化器官腫瘤、特別是大腸腫瘤、具體地是大腸癌或大腺腺瘤的方法。另一方面，TffISTl基因是作為與果蠅屬的黑腹果蠅(Drosophila melanogaster) 的形態(tài)形成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子TWIST的人類同源物而分離出的基因，也稱為H-TWIST或果蠅屬的TWIST同源物(TWIST homolog of Drosophila)。其本質(zhì)是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(Basic helix-loop-helix, bHLH)型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，一般認(rèn)為與發(fā)生時(shí)細(xì)胞的系譜、 分化相關(guān)。已知在TWISTl基因本體(編碼區(qū))發(fā)生的變異會(huì)引起尖頭并指畸形綜合征 (Seathre-Chotzen syndrome)，近年的研究暗示其與鼻咽癌細(xì)胞獲得紫杉醇耐性相關(guān)。然而，TffISTl基因的甲基化、特別是存在于調(diào)節(jié)區(qū)域和/或其附近序列的甲基化與大腸細(xì)胞的癌變密切相關(guān)的事實(shí)以前并不為人們所知。另外，在對(duì)乳癌患者的研究中，通過甲基化特異性PCR(MSP)研究了從來源于患者的含有能用內(nèi)窺鏡可視化的癌的乳管的液體中檢測的CyclinD2、RAR-i3和Twist的甲基化陣列(J f >化7 > > )(非專利文獻(xiàn)1)；在小葉原位癌(上皮內(nèi)小葉癌，LCIS)和浸潤性小葉癌(ILC)中研究了作為癌相關(guān)基因已知的RASSF1A、HIN-U RAR-, CyclinD2和Twist， 通過甲基化特異性PCR(MSP)法確認(rèn)了 100%的ILC和69%的LCIS具有一個(gè)以上的高甲基化基因(非專利文獻(xiàn)2)。已經(jīng)報(bào)告了根據(jù)Q-PCR法，在癌患者中Slug、Twist的表達(dá)增加、Snail的表達(dá)減少，并且在Twist啟動(dòng)子中顯示甲基化(非專利文獻(xiàn)幻；在人的乳癌中 twist、細(xì)胞周期蛋白D2、視黃酸、RARi3 ,HIN-I的任一個(gè)以上顯示出異常的高甲基化(非專利文獻(xiàn)4)。另外，報(bào)告了將選自DNA甲基化抑制劑、脫甲基化劑、和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的拮抗物中的甲基化調(diào)節(jié)劑給藥至具有包含定型或惡性細(xì)胞的異常乳管上皮細(xì)胞的患者的乳管的方法(專利文獻(xiàn)7)。但是，例如在使用了含有至少一個(gè)CG 二核苷酸的引物、并且需要其中一個(gè)CG 二核苷酸位于3’末端的引物的甲基化敏感性PCR(MSP)法中，能夠優(yōu)異地檢測甲基化的序列，但不能進(jìn)行定量的檢測。在先技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1專利文獻(xiàn)2專利文獻(xiàn)3專利文獻(xiàn)4專利文獻(xiàn)5專利文獻(xiàn)6專利文獻(xiàn)7非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn) 1 :Evron Ε. et al. 2001. Detection of breast cancer cells in ductal lavage fluid by methyIation-specific PCR. The Lancet 357 :1335-1336.非專利文獻(xiàn)2 =Fackler Μ. J. et al. 2003. DNA methylation of RASSF1A, HIN-I, RAR-b,CYCLIN D2 and TWIST in in situ and invasive lobular breast carcinoma. Int. J. Cancer 107 :970-975.非專利文獻(xiàn) 3 Tracey A. et al. 2005. Expression of the transcription factors snail, slug, and twist and their clinical significance in human breast cancer.非專禾丨J 文獻(xiàn) 4 :Bae Y. K. et al. 2005. Gene promoter hypermethylation in tumors and plasma of breast cancer patients. Cancer Res Treat. 37 (4) :233-240.

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題鑒于上述現(xiàn)狀，本發(fā)明的課題在于提供具有高靈敏度和高特異性的大腸腫瘤的檢日本特表2004-527245號(hào)公報(bào) 日本特表2007-502121號(hào)公報(bào) 日本特表2007-5M393號(hào)公報(bào) 日本特開2007-252272號(hào)公報(bào) 日本特開2007-2749 號(hào)公報(bào) 日本特開2006-166732號(hào)公報(bào) 日本特開2009-96808號(hào)公報(bào)測方法和用于實(shí)施該方法的試劑盒。解決問題的方法本發(fā)明的發(fā)明人基于在乳癌細(xì)胞中各種基因的CpG島的甲基化與乳癌相關(guān)的認(rèn)識(shí)，探索了能夠特異性地檢測大腸腫瘤的各種基因的甲基化區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大腸腫瘤細(xì)胞中大量的基因具有高度甲基化的部位，但是確認(rèn)例如SFRP基因雖然在大腸癌中的甲基化頻率高，但是在正常大腸粘膜中甲基化頻率也高達(dá)68. 0%，同樣地確認(rèn)了多個(gè)其它基因也具有在大腸癌細(xì)胞中甲基化頻率高、在正常大腸粘膜中的甲基化頻率也高這樣的傾向， 在檢測的特異性這方面存在問題。另外，對(duì)于其它臟器中的癌與各種基因的甲基化區(qū)域也進(jìn)行了研究，確認(rèn)了在例如TWISTl的CpG中的甲基化與胃癌之間沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。但是， 進(jìn)一步進(jìn)行詳細(xì)研究，著眼于肝臟癌細(xì)胞中的人TWISTl的5’上游側(cè)調(diào)節(jié)區(qū)域的高度甲基化的部位，使用正常大腸粘膜、大腸癌和大腸腺瘤的臨床樣本，研究了正常者與大腸腫瘤患者、大腸癌患者的甲基化比例，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，人TWISTl啟動(dòng)子區(qū)域的-688 -691的 CGCG部位的甲基化與大腸腫瘤有無、以及腫瘤的發(fā)展程度密切相關(guān)，并基于該認(rèn)識(shí)進(jìn)行了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)可以使用人TWISTl啟動(dòng)子區(qū)域的-477 -747區(qū)域中的CpG部位作為用于大腸腫瘤的檢測、鑒別的標(biāo)記，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及下述(1) (5)。(1) 一種大腸腫瘤有無的判定方法，其特征在于，該方法包括測定被檢細(xì)胞中的基因組序列上TWISTl基因的-477 -747區(qū)域內(nèi)的1個(gè)或2個(gè)以上CpG序列的甲基化程度。(2)根據(jù)上述(1)所述的判定方法，其特征在于，在判定為具有大腸腫瘤的情況下，進(jìn)一步判定大腸腫瘤是大腸癌或大腸腺瘤。(3)根據(jù)上述⑴或(2)所述的判定方法，其特征在于，TWISTl基因的-477 -747 區(qū)域內(nèi)的1個(gè)或2個(gè)以上CpG序列是位于序列號(hào)1所示核苷酸序列的第57 60位的CGCG 序列。(4)根據(jù)上述(3)所述的判定方法，其特征在于，測定甲基化程度的方法是 COBRA(結(jié)合亞硫酸氫鹽的限制性酶分析(Combined Bisulfite Restriction Analysis)) 法，在擴(kuò)增位于序列號(hào)1所示核苷酸序列的第57 60位的CGCG序列的工序中使用的引物集是 5，-TGTGTAGAAGTTGTTGTTATT-3，(序列號(hào) 4)、5，-CRAAAAAAACTATCCTAAC-3，(序列號(hào) 5)的組合。(5)根據(jù)上述(1) 的任一項(xiàng)所述的判定方法，其特征在于，被檢細(xì)胞是大便中所含的細(xì)胞、大腸清洗液所含的細(xì)胞、血液中所含的細(xì)胞或血清所含的細(xì)胞。另外，本發(fā)明還涉及下述(6)和(7)。(6) 一種大腸腫瘤判定用試劑盒，該試劑盒是測定被檢細(xì)胞中的基因組序列上 TffISTl基因的-477 -747區(qū)域內(nèi)的1個(gè)或2個(gè)以上CpG序列的甲基化程度的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括用于提取基因組DNA的試劑、用于將非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換成尿嘧啶的試劑、用于擴(kuò)增上述基因組DNA中的TWISTl基因的-477 -747區(qū)域內(nèi)的1個(gè)或2個(gè)以上CpG序列的引物集、以及用于分析甲基化圖譜的試劑。(7)根據(jù)上述(6)所述的大腸腫瘤判定用試劑盒，其特征在于，引物集是由序列號(hào) 4和序列號(hào)5所示寡核苷酸組成的引物對(duì)。
發(fā)明的效果通過利用本發(fā)明的大腸腫瘤檢測方法，可以高靈敏度且高特異性地鑒別大腸癌等腫瘤與非腫瘤組織，而且由于隨著腫瘤的發(fā)展而甲基化的水平上升，因而還可以用于鑒別腫瘤的發(fā)展程度。另外，通過使用用于實(shí)施該方法的試劑盒等，可以簡便地檢測大腸腫瘤。


圖1顯示本發(fā)明的COBRA分析的結(jié)果。(A)表示來源于正常大腸粘膜的電泳圖、 (B)表示來源于大腸癌細(xì)胞的電泳圖。圖2顯示臨床樣本(大腸癌)的各樣品中的甲基化定量值。圖3顯示臨床樣本(正常大腸粘膜)的各樣品中的甲基化定量值。圖4比較顯示大腸癌細(xì)胞與正常大腸粘膜細(xì)胞中的TWISTl基因的甲基化水平。圖5顯示由圖2和圖3的結(jié)果導(dǎo)出的ROC曲線和截?cái)?cut-off)值。圖6顯示在截?cái)嘀禐?. 45-21. 20%下大腸癌與正常大腸粘膜之間的ROC分析的結(jié)果。圖7顯示在截?cái)嘀禐?1. 95-40. 70%下大腸癌與正常大腸粘膜之間的ROC分析的結(jié)果。圖8顯示在截?cái)嘀禐?1. 05-58. 55%下大腸癌與正常大腸粘膜之間的ROC分析的結(jié)果。圖9顯示在截?cái)嘀禐?8. 70-83. 60%下大腸癌與正常大腸粘膜之間的ROC分析的結(jié)果。圖10顯示在截?cái)嘀禐?3. 85-99. 60%下大腸癌與正常大腸粘膜之間的ROC分析的結(jié)果。圖11顯示將由ROC分析導(dǎo)出的截?cái)嘀荡雸D4的坐標(biāo)圖的結(jié)果。圖12比較顯示大腸癌中的TWISTl的甲基化頻率與以往有報(bào)告的其它基因的甲基
化頻率。圖13顯示以來源于大腸正常粘膜、大腸癌、大腸腺瘤的DNA為模板的COBRA分析的結(jié)果。圖14顯示大腸腺瘤樣本的各樣品中的甲基化定量值。圖15比較顯示大腸腺瘤中的TWISTl基因的甲基化水平與正常大腸粘膜和大腸癌中的TWISTl基因的甲基化水平。圖16顯示大腸腺瘤與正常大腸粘膜中的TWISTl基因甲基化的ROC曲線和截?cái)嘀怠D17顯示截?cái)嘀禐?. 05-8. 650下大腸腺瘤與正常組織之間的ROC分析的結(jié)果。圖18顯示截?cái)嘀禐?. 750-37. 40下大腸腺瘤與正常組織之間的ROC分析的結(jié)果。圖19顯示截?cái)嘀禐?8. 30-99. 05下大腸腺瘤與正常組織之間的ROC分析的結(jié)果。圖20顯示將由ROC分析導(dǎo)出的截?cái)嘀荡雸D15的大腸正常粘膜與大腸腺瘤的坐標(biāo)圖的結(jié)果。圖21顯示截?cái)嘀禐?. 800-14. 95下大腸癌與大腸腺瘤之間的ROC分析的結(jié)果。圖22顯示截?cái)嘀禐?5. 25-29. 85下大腸癌與大腸腺瘤之間的ROC分析的結(jié)果。
圖23顯示截?cái)嘀禐?0. 05-45. 95下大腸癌與大腸腺瘤之間的ROC分析的結(jié)果。圖M顯示大腸癌細(xì)胞株DLD-I、HT-29、HCT-116、RKO和甲基化陰性對(duì)照(NL、來源于外周血淋巴細(xì)胞)、甲基化陽性對(duì)照(IVD、進(jìn)行了甲基化轉(zhuǎn)移酶處理的DNA)中TWISTl基因-477 -747中的CpG甲基化分布的分析結(jié)果。圖25比較顯示胃癌細(xì)胞與正常胃粘膜中TWISTl基因的甲基化水平。
具體實(shí)施例方式作為本發(fā)明的大腸腫瘤有無的判定方法，只要是測定被檢細(xì)胞中的基因組序列上 TffISTl基因的-477 -747區(qū)域內(nèi)的1個(gè)或2個(gè)以上CpG序列的甲基化程度(頻率、比例等)的方法即可，不特別限制，大腸腫瘤是包含由組織的正常細(xì)胞顯形轉(zhuǎn)變而產(chǎn)生的大腸癌或大腸腺瘤的概念，這里，大腸腺瘤是指癌前狀態(tài)的形成異常大腸細(xì)胞和/或無轉(zhuǎn)移性的良性腫瘤，大腸癌是指具有轉(zhuǎn)移性的惡性腫瘤，大腸腫瘤的發(fā)展是指大腸腺瘤在大腸正常組織中增殖、處于癌前狀態(tài)的大腸腺瘤新發(fā)生癌變、和/或由癌部位轉(zhuǎn)移出的癌細(xì)胞在非癌部大腸組織中增殖并新形成大腸癌組織。另外，所謂測定CpG序列的甲基化程度(頻率、比例等)，具體來說是指測定在 TffISTl啟動(dòng)子區(qū)域的-477 -747內(nèi)作為CpG序列存在的胞嘧啶的甲基化、特別優(yōu)選為存在于-688 -691 (序列號(hào)1所示堿基序列中的第57 60位)的CGCG序列中的胞嘧啶的甲基化的有無、頻率、比例等，作為測定甲基化程度的測定方法，可列舉COBRA(結(jié)合亞硫酸氫鹽的限制性酶分析，Combined Bisulfite Restriction Analysis)法、甲基發(fā)光(MethylLight)法、焦磷酸測序(Pyrosequencing)法、亞硫酸氫鹽測序(Bisulfite sequencing)法、分子量陣列(MassARRAY)法、qAMP(限制性消化與實(shí)時(shí)PCR，Restriction and real-time PCR)法、RT-LAMP法、ICAN法，其中優(yōu)選列舉COBRA(結(jié)合亞硫酸氫鹽的限制性酶分析，Combined Bisulfite Restriction Analysis)法。另外本發(fā)明的大腸腫瘤有無的判定方法是包括以下各工序的方法1)由被檢細(xì)胞提取出基因組DNA的工序a ；2)將工序a所得的DNA中的CpG序列中的非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換成不同的堿基(優(yōu)選為尿嘧啶)的工序用1組引物通過PCR法來擴(kuò)增經(jīng)工序b 轉(zhuǎn)換后的TWISTl基因的-477 -747區(qū)域或該區(qū)域所含的CpG部位的工序c ；4)測定工序 c所得的擴(kuò)增產(chǎn)物中的甲基化程度(分析甲基化圖譜)的工序d。在工序d中，計(jì)算甲基化的比例，適用既定的截?cái)嘀担谆谋壤邥r(shí)可判定為大腸癌，甲基化的比例稍低時(shí)可判定為大腸腺瘤。此外，可以將工序d作為收集用于分析甲基化圖譜的數(shù)據(jù)的工序。更確切地說，本發(fā)明的判定方法是工序d中的分析工序包含能夠區(qū)別目標(biāo)序列的甲基化/非甲基化的限制性酶(甲基化特異性的限制性酶)處理的方法。上述工序c中的1組引物可以基于TWISTl的序列信息適當(dāng)設(shè)計(jì)，并使用合適的寡核苷酸合成裝置來適當(dāng)制備，只要設(shè)計(jì)成能夠擴(kuò)增存在于TWISTl啟動(dòng)子區(qū)域的-477 -747區(qū)域的1個(gè)或2個(gè)以上的任意CpG序列那樣即可，對(duì)其位置、長度等不特別限制，例如，在擴(kuò)增存在于序列號(hào)1的第57 60位的CGCG的情況下，如實(shí)施例所示那樣，可以具體例示序列號(hào)2和序列號(hào)3所示的引物的組合、序列號(hào)4和序列號(hào)5所示的引物的組合，特別優(yōu)選序列號(hào)4和序列號(hào)5所示的引物的組合。另外，作為上述工序中的甲基化特異性的限制性酶，優(yōu)選列舉選自識(shí)別CGCG的BstUI,AccII,Bshl236I,BstFNI,FnuDII,MvnI,和Thai中的限制性酶。本發(fā)明涉及用于檢測大腸腫瘤的方法，因而本發(fā)明中的被檢細(xì)胞是疑似為大腸腫瘤的細(xì)胞，對(duì)其存在部位和/或來源沒有特別限定，例如，在重視檢測的靈敏度的情況下， 優(yōu)選來源于經(jīng)內(nèi)窺鏡檢查等疑似為大腸癌和/或癌前病變的組織的細(xì)胞等，另外，在重視檢測的簡便性的情況下，優(yōu)選大便中所含的細(xì)胞和/或大腸清洗液所含的細(xì)胞、血液中所含的細(xì)胞。此外也可以應(yīng)用血清、尿、咳痰、胰液、膽汁、精液、唾液、腦脊液等所含的細(xì)胞。另外，作為本發(fā)明的檢測對(duì)象的大腸腫瘤，可列舉在大腸或其附近的消化道生長的癌和/或腺瘤，優(yōu)選的例子例如盲腸癌、結(jié)腸癌、直腸癌、盲腸腺瘤、結(jié)腸腺瘤、直腸腺瘤， 還包括肛門癌、肛門腺瘤。作為本發(fā)明的大腸腫瘤判定用試劑盒，是用于測定被檢細(xì)胞中的基因組序列上 TffISTl基因的-477 -747中的CpG序列的甲基化程度的試劑盒，只要包括用于提取基因組DNA的試劑、用于將非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換成尿嘧啶的試劑、用于擴(kuò)增包含位于序列號(hào)1所示核苷酸序列的第57 60位的CGCG序列的上述基因組DNA中的TWISTl基因的啟動(dòng)子區(qū)域或其一部分的基因片段的引物集、以及用于分析甲基化圖譜的試劑即可，不特別限制， 作為具體的試劑盒構(gòu)成，可列舉包括例如下述(1) (4)的試劑盒=(I)DNA提取工序所涉及的試劑和/或設(shè)備，是從細(xì)胞直接提取DNA的試劑和/或設(shè)備、用于從石蠟標(biāo)本等中提取DNA的脫蠟用試劑和/或設(shè)備、和/或用于從糞便提取DNA的試劑和/或設(shè)備等；(2)甲基化DNA的鑒別工序所涉及的試劑和/或設(shè)備，是用于將非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換成尿嘧啶的試劑和/或設(shè)備，優(yōu)選為亞硫酸氫鹽(亞硫酸氫鈉，Sodium Bisulfite)、更優(yōu)選為亞硫酸氫鈉和用于該反應(yīng)的緩沖液等；(3)用于進(jìn)行甲基化特異性PCR的工序的試劑和/或設(shè)備， 即能夠擴(kuò)增目標(biāo)甲基化CGCG區(qū)域的引物集、耐熱性DNA聚合酶和聚合酶用緩沖液等；(4) 甲基化特異性的限制性酶和用于該反應(yīng)的緩沖液等。關(guān)于各工序所需的試劑類等，除了可以使用作為常規(guī)方法在論文等中公開的方法以外，還可以使用市售的試劑盒來進(jìn)行DNA提取,例如可使用All Prep DNA/RNA Mini Kit ^jiagen，Hilden，GERM)，從石蠟標(biāo)本等中提取 DNA 可使用 QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen 社制)，從糞便中提取 DNA 可使用 QIAamp Stool DNA Isolation Kit ^jiagen 社制)，關(guān)于甲基化 PCR，可使用例如 AmpliTaq Gold (Applied Biosystems 社制)。以下顯示本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明不僅限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1(從外科的切除凍結(jié)標(biāo)本中提取DNA)從作為正常大腸粘膜樣本的252個(gè)樣本、作為大腸癌樣本的320個(gè)樣本中，使用 All Prep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden，GERM)，進(jìn)行從外科的切除凍結(jié)標(biāo)本中提取 DNA。向2ml管中添加產(chǎn)品附帶的RLT plus緩沖液600 μ 1，再添加β巰基乙醇6 μ 1，然后加入外科的切除凍結(jié)標(biāo)本，加入1個(gè)不銹鋼珠(Stainless Steel Beads) 5mm(Qiagen社制)，使用Qiagen Mixer Mill MM300 (Qiagen社制)以30Hz、10分鐘對(duì)標(biāo)本進(jìn)行超聲波破碎。將均質(zhì)化后的溶胞產(chǎn)物加入All Prep DNA旋轉(zhuǎn)柱(Qiagen社制)，以10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒。在室溫或4°C下，將新的All Prep DNA旋轉(zhuǎn)柱安放在2ml收集管上進(jìn)行孵育。在孵育后的DNA旋轉(zhuǎn)柱中添加500 μ 1的AWl緩沖液(產(chǎn)品附帶)，以10000轉(zhuǎn)/ 分鐘離心30秒并僅丟棄廢液，然后，將柱安放在2ml的收集管上。接著添加500μ1的AW2緩沖液(產(chǎn)品附帶)，以15300轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘。將柱移至新的1. 5ml管上，直接在柱的膜片上添加100 μ 1的EB緩沖液(產(chǎn)品附帶)，在室溫下孵育1分鐘，然后以10000轉(zhuǎn)/ 分鐘離心1分鐘，從而溶出DNA。(對(duì)照樣品的制備)作為甲基化陣列的陽性對(duì)照，使用來源于經(jīng)ksl甲基化轉(zhuǎn)移酶(New England Biolabs, Beverly,ΜΑ)處理后的胎盤的 DNA(Sigma，St. Louis，M0)。對(duì)含 10 μ g 來源于胎盤的DNA的溶液添加產(chǎn)品附帶的1 XNEB緩沖液2、160 μ M的S-腺苷-L-甲硫氨酸、0. 2U (活性單位)的SssI，用滅菌水補(bǔ)充至200μ1。在37°C孵育2小時(shí)之后，添加32mM的S-腺苷-L-甲硫氨酸3 μ IjssI 3μ 1，在37°C孵育1小時(shí)。然后，等量添加苯酚/氯仿/異戊醇 (25 24 1，卩(1沖!18.0，3丨8111￡1社制)，懸浮30秒并靜置5分鐘。在室溫以14000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，然后僅回收上清液并移至新的管中，加入PCI并將上述操作再重復(fù)一次。在 PCI處理后的樣品中添加1 μ 1的20mg/ml糖原(Roche社制)、20 μ 1的3M醋酸鈉、500 μ 1 的100%乙醇，在-80°C進(jìn)行乙醇沉淀2小時(shí)。孵育之后，以4°C、14000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，然后除去上清液并用70%乙醇沖洗。通過真空干燥使顆粒干燥，用100μ 1的蒸餾水溶解DNA，從而作為甲基化陣列的陽性對(duì)照。另一方面，作為非甲基化陣列的陽性對(duì)照，使用從外周血淋巴細(xì)胞提取出的DNA。 使用加入了抗凝劑EDTA-2Na的采血管，在所采集的外周血中加入0. 2% NaCl并倒轉(zhuǎn)混和， 然后以2500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。用抽吸器除去上清液，注意避免吸出沉淀在管底的白細(xì)胞，重復(fù)該操作直至顆粒(白細(xì)胞)變白。將變白的顆粒移至1.5ml管，使用核酸提取劑 SepaGene (三光純藥)進(jìn)行核酸提取。提取法按照使用方法進(jìn)行。將提取得到的核酸的顆粒風(fēng)干，加入蒸餾水100μ 1進(jìn)行溶解，將溶解液作為非甲基化陣列的陽性對(duì)照。(DNA的亞硫酸氫鈉處理)為了修飾甲基化DNA并供給亞硫酸氫鹽PCR法進(jìn)行分析，進(jìn)行了亞硫酸氫鈉處理。 將上述純化所得的DNA 2μ g中加入蒸餾水使總量為50μ 1，再加入5. 5μ 1的2Μ NaOH，然后在37°C孵育10分鐘。加入30 μ 1的IOmM氫醌(Sigma)和520 μ 1的3Μ亞硫酸氫鈉(ρΗ5· 0， Fisher Scientific)，在避光下以 50°C孵育 16 小時(shí)。使用 DNA Cleanup Kit(Promega)純化經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后的DNA樣品。純化方法按照使用方法進(jìn)行。在純化后的DNA中添加 5. 5μ 1的3M NaOH，然后孵育5分鐘，添加20mg/ml糖原1μ 1、10Μ醋酸銨33μ 1、100%乙醇 260 μ 1進(jìn)行乙醇沉淀，在乙醇沉淀之后通過真空干燥將DNA制成顆粒，在其中加入100 μ 1 蒸餾水，進(jìn)行30分鐘渦旋使其溶解，然后置于4°C過夜使其溶解，從而制成亞硫酸氫鹽處理 DNA樣品。非甲基化CpG通過亞硫酸氫鈉處理使得胞嘧啶轉(zhuǎn)換成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶并不發(fā)生這種轉(zhuǎn)換。因此，通過后述的限制性酶處理，可以檢測出以甲基化DNA為模板的 PCR產(chǎn)物被切割、以非甲基化DNA為模板的PCR產(chǎn)物不被切割這樣的差異。(甲基化定量分析)為了進(jìn)行甲基化的定量分析，進(jìn)行COBRA分析(結(jié)合亞硫酸氫鹽的限制性酶分析，Combined Bisulfite Restriction Analysis)。聚合酶使用 AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems)，調(diào)制成包含 2 μ 1 的 GeneAmp 10Χ 緩沖液 ΙΙ(產(chǎn)品附帶)、2mM氯化鎂、800nM dNTPs,500nM引物(表1所述，序列號(hào)2、；3)、2 μ 1亞硫酸氫鹽處理 DNA、0. 5U的聚合酶的20 μ 1的反應(yīng)溶液。引物的詳細(xì)情況在下述表1和序列號(hào)2、3中顯示。另外PCR的溫度條件在下述表2中顯示。PCR產(chǎn)物通過3%瓊脂糖凝膠電泳來確認(rèn)。[表 1]TffISTl基因的甲基化定量中使用的引物
權(quán)利要求
1.一種大腸腫瘤有無的判定方法，其特征在于，該方法包括測定被檢細(xì)胞中的基因組序列上TWISTl基因的-477 -747區(qū)域內(nèi)的1個(gè)或2個(gè)以上CpG序列的甲基化程度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的判定方法，其特征在于，在判定為具有大腸腫瘤的情況下，進(jìn)一步判定大腸腫瘤是大腸癌或大腸腺瘤。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的判定方法，其特征在于，TffISTl基因的-477 -747區(qū)域內(nèi)的1個(gè)或2個(gè)以上CpG序列是位于序列號(hào)1所示核苷酸序列的第57 60位的CGCG 序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的判定方法，其特征在于，測定甲基化程度的方法是結(jié)合亞硫酸氫鹽的限制性酶分析法，即COBRA法，在擴(kuò)增位于序列號(hào)1所示核苷酸序列的第57 60 位的CGCG序列的工序中使用的引物集是序列號(hào)4 :5’-TGTGTAGAAGTTGTTGTTATT-3’、序列號(hào) 5 :5，-CRAAAAAAACTATCCTAAC-3‘的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4的任一項(xiàng)所述的判定方法，其特征在于，被檢細(xì)胞是來源于疑似為大腸癌或癌前病變的組織的細(xì)胞、大便中所含的細(xì)胞、大腸清洗液所含的細(xì)胞、血液中所含的細(xì)胞或血清所含的細(xì)胞。
6.一種大腸腫瘤判定用試劑盒，該試劑盒是測定被檢細(xì)胞中的基因組序列上TWISTl 基因的-477 -747區(qū)域內(nèi)的1個(gè)或2個(gè)以上CpG序列的甲基化程度的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括用于提取基因組DNA的試劑、用于將非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換成尿嘧啶的試劑、用于擴(kuò)增上述基因組DNA中的TWISTl基因的-477 -747區(qū)域內(nèi)的1個(gè)或2個(gè)以上 CpG序列的引物集、以及用于分析甲基化圖譜的試劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的大腸腫瘤判定用試劑盒，其特征在于，引物集是由序列號(hào)4和序列號(hào)5所示寡核苷酸組成的引物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供大腸腫瘤有無的判定方法，具體來說是大腸癌或大腸腺瘤有無的判定方法，該判定方法以DNA甲基化為指標(biāo)，具有高靈敏度和高特異性；還提供用于實(shí)施該判定方法的試劑盒。本發(fā)明測定被檢細(xì)胞的基因組序列上TWIST1基因(人類twist同源物1(Homo sapiens twist homolog 1)；果蠅屬(Drosophila))基因的-477～-747區(qū)域內(nèi)的1個(gè)或2個(gè)以上CpG序列、更優(yōu)選為-688～-691的CGCG序列的甲基化程度。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102292458SQ20108000363
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2010年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日
發(fā)明者上野耕司, 岡田季之, 日野田裕治, 末廣寬 申請(qǐng)人:A&T株式會(huì)社