專(zhuān)利名稱(chēng)：作為肺鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)志物的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白b13的制作方法
作為肺鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)志物的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13本發(fā)明涉及一種輔助評(píng)估鱗狀細(xì)胞癌(=SCC)的方法。其公開(kāi)了蛋白質(zhì)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13作為SCC標(biāo)志物的應(yīng)用。此外，其涉及一種評(píng)估從患有非小細(xì)胞肺癌 (=NSCLC)的患者中獲得的組織樣品中的肺癌以及將肺腺癌或大細(xì)胞癌與SCC區(qū)分開(kāi)的方法。盡管在檢測(cè)和治療方面取得了進(jìn)展，癌癥仍然是主要的公眾衛(wèi)生挑戰(zhàn)。在各種癌癥類(lèi)型中，LC在西方世界是常發(fā)癌癥并且是癌癥相關(guān)死亡率的最常見(jiàn)原因之一。它是美國(guó)男性和女性?xún)烧咧邪┌Y相關(guān)死亡的最常見(jiàn)原因。它主要是一種老年疾病發(fā)病率隨年齡增加，> 65歲時(shí)達(dá)到482/100，000人，并且峰值為75歲，達(dá)到約502/100，000人。65歲的人形成肺癌的風(fēng)險(xiǎn)為25歲的人的50倍，并且是45-64歲的人的3_4倍。男性中大約90%以及女性中大約80%的肺癌病例都?xì)w因于吸煙。肺癌的風(fēng)險(xiǎn)與總吸煙年數(shù)有關(guān)，吸煙將吸煙者暴露于致癌物和促進(jìn)劑中。由于細(xì)胞DNA修復(fù)的年齡相關(guān)性下降，風(fēng)險(xiǎn)在老年人中也會(huì)增加。從初次接觸吸煙到臨床癥狀，肺癌可能有15-20年的自然史。大部分LC腫瘤可分為小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，NSCLC又再分為三種主要的組織學(xué)腫瘤類(lèi)型，即鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌。SCLC占所有肺癌病例的約20-25%。SCLC是攻擊性的神經(jīng)內(nèi)分泌型LC并且具有很差的預(yù)后，即使在早期檢測(cè)出。SCLC極少順應(yīng)通過(guò)切除的根治性治療。由于該疾病發(fā)展的速度，SCLC通常僅使用兩個(gè)時(shí)期(即局限和廣泛性疾病)而不用更復(fù)雜的 !分期系統(tǒng) (見(jiàn)下面)來(lái)分類(lèi)。大約75-80%的LC病例歸類(lèi)入NSCLC類(lèi)，包括鱗狀細(xì)胞癌(癌=CA)、腺CA (包括腺泡CA、乳頭狀CA、支氣管肺泡腫瘤、實(shí)體瘤和混合亞型的亞類(lèi))，和大細(xì)胞癌(包括巨細(xì)胞瘤、透明細(xì)胞CA、腺鱗CA和未分化CA的亞類(lèi))。NSCLC，如果在晚期檢測(cè)出，具有非常差的預(yù)后。癌癥的分期依據(jù)程度、進(jìn)展、細(xì)胞類(lèi)型和腫瘤等級(jí)對(duì)疾病分類(lèi)。它將癌癥患者分組，使得可以作出關(guān)于預(yù)后和治療選擇的概括。今天， Μ系統(tǒng)是基于癌癥解剖學(xué)程度的最廣泛使用的分類(lèi)系統(tǒng)。它代表國(guó)際認(rèn)可、統(tǒng)一的分期系統(tǒng)。存在三個(gè)基本變量τ (原發(fā)性腫瘤的程度)、N(局部淋巴結(jié)的狀態(tài)) 和M(有或沒(méi)有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移)。
Μ標(biāo)準(zhǔn)由UICC(國(guó)際抗癌聯(lián)盟)公布(Sobin，L. H.和Fleming， I. D. ,TNM Classification of Malignant Tumors (惡性腫瘤的 TNM分類(lèi))，第五版(1997)， 第 1803-1804 頁(yè))。原發(fā)性腫瘤的手術(shù)切除已被廣泛接受為選擇用于早期NSCLC的治療。隨著NSCLC 的發(fā)展，更具體地從 IIIa 期(T3mM0、TlN2M0、T2N2M0、T3N2M0)向 IIIb 期(T4N0M0、T4mM0、 T4N2M0)轉(zhuǎn)變，促使醫(yī)師方法的明顯轉(zhuǎn)變。但是，如果在更早期(Ia-IIIa ；優(yōu)選最早T3mM0 期)檢測(cè)出癌癥，5年生存率在35%-80%之間變化。Ia期((T1N0M0)；腫瘤尺寸小、無(wú)轉(zhuǎn)移)的檢測(cè)明顯地具有最好的預(yù)后，五年生存率高達(dá)80%。手術(shù)極少，如果有的話，用在NSCLC的Inb-IV期的處理中。IV期對(duì)應(yīng)于遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，即疾病擴(kuò)散到肺和局部淋巴結(jié)以外。較晚的III和IV期的5年生存率分別降至小于15% 和之間。尤其重要的是，NSCLC的早期診斷轉(zhuǎn)化成好得多的預(yù)后。早在Ia(TlNOMO)、 Ib (T2N0M0)、IIa(TlNlMO)、lib (T3N0M0)和 IIIa(T3NlM0)期診斷出的患者，如果處理恰當(dāng)， 診斷后5年具有高達(dá)80%的生存機(jī)會(huì)。這應(yīng)與當(dāng)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移已經(jīng)存在時(shí)確診的患者小于
的5年生存率比較。越早診斷出LC，長(zhǎng)期生存的機(jī)會(huì)越大。如上所述，病理學(xué)家將肺癌分類(lèi)為4種主要的組織學(xué)類(lèi)型，S卩，鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、 大細(xì)胞癌(總稱(chēng)=NSCLC)和小細(xì)胞癌。但是，相當(dāng)重要的是要注意通常，這些類(lèi)型中的兩種或多種同時(shí)出現(xiàn)并且組織學(xué)分類(lèi)極度依賴(lài)于所負(fù)責(zé)的病理學(xué)家的技能。急需可有助于對(duì)多種類(lèi)型肺癌進(jìn)行更具重現(xiàn)性分類(lèi)的另外的方法。特別是指示 NSCLC腫瘤組別內(nèi)的SCC的標(biāo)志物，表示輔助這種診斷的重要工具。已出乎意料地發(fā)現(xiàn)，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13標(biāo)志物代表了評(píng)估肺癌的極好的工具。通過(guò)使用絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13標(biāo)志物，例如可能將鱗狀細(xì)胞癌與肺癌的其它組織學(xué)類(lèi)型(例如腺癌)區(qū)分。發(fā)明概述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于體外評(píng)估肺鱗狀細(xì)胞癌(SCC)的方法， 包括(a)測(cè)定測(cè)試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及(b)將步驟(a)的測(cè)定結(jié)果用于評(píng)估肺鱗狀細(xì)胞癌，其中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陽(yáng)性測(cè)定結(jié)果指示肺鱗狀細(xì)胞癌。還描述了一種用于體外評(píng)估肺鱗狀細(xì)胞癌的方法，包括(a)測(cè)定測(cè)試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，(b)測(cè)定對(duì)照樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及(c)在評(píng)估肺鱗狀細(xì)胞癌中比較步驟(a)和(b)的測(cè)定結(jié)果，其中與對(duì)照樣品中的水平相比，所述測(cè)試樣品中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B水平升高指示肺鱗狀細(xì)胞癌。本發(fā)明還公開(kāi)了一種用于在體外相對(duì)于其它非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)鑒別診斷肺鱗狀細(xì)胞癌的方法，包括(a)測(cè)定包含非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的測(cè)試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，以及(b)利用步驟(a)的測(cè)定結(jié)果用于相對(duì)于其它NSCLC鑒別診斷鱗狀細(xì)胞癌，其中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陽(yáng)性測(cè)定結(jié)果指示肺鱗狀細(xì)胞癌，而絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陰性測(cè)定結(jié)果指示其它NSCLC。本發(fā)明還涉及絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13標(biāo)志物在評(píng)估肺鱗狀細(xì)胞癌以及將肺鱗狀細(xì)胞癌與其它類(lèi)型NSCLC(如肺腺癌)區(qū)分中的應(yīng)用。發(fā)明詳述在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于體外評(píng)估肺鱗狀細(xì)胞癌的方法，包括 (a)測(cè)定測(cè)試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及(b)將步驟(a)的測(cè)定結(jié)果用于評(píng)估肺鱗狀細(xì)胞癌，其中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陽(yáng)性測(cè)定結(jié)果指示肺鱗狀細(xì)胞癌。術(shù)語(yǔ)“測(cè)定”或“測(cè)量”涉及樣品中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的定性或定量測(cè)量。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，測(cè)量為定性或半定量測(cè)量，即確定絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13是存在還是不存在或者確定絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的濃度是高于還是低于截?cái)嘀?cut-off value)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，在是(存在)或否(不存在)的測(cè)定中，通常設(shè)置測(cè)定靈敏度以匹配截?cái)嘀怠＠缈蓮囊唤M健康個(gè)體的測(cè)試中確定截?cái)嘀?。?yōu)選地，設(shè)置截?cái)嘀狄詫?dǎo)致產(chǎn)生90%的特異性，還優(yōu)選設(shè)置截?cái)嘀狄詫?dǎo)致產(chǎn)生95%的特異性，或還優(yōu)選設(shè)置截?cái)嘀狄詫?dǎo)致產(chǎn)生98%的特異性。高于截?cái)嘀档闹档拇嬖诳衫缰甘痉西[狀細(xì)胞癌的存在。如果確定的值高于截?cái)嘀?，則將測(cè)定結(jié)果歸類(lèi)為陽(yáng)性。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13蛋白(蛋白酶抑制劑13、HaCaT UV-阻遏型絲氨酸蛋白酶抑制蛋白、hurpin、headpin ；絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13 ；SWISS-PR0T檢索號(hào) Q9UIV8)是44. 3kDa的蛋白質(zhì)并由391個(gè)氨基酸組成，由SEQ ID NO=I表征。由可變剪接產(chǎn)生的一種同工型(38.4kDa，339aa)在文獻(xiàn)中報(bào)道(SEQ ID NO :2)。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白13屬于廣泛分布的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白(絲氨酸蛋白酶抑制劑)的蛋白質(zhì)超家族。通常，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白是利用構(gòu)象變化來(lái)抑制靶標(biāo)酶(主要為絲氨酸蛋白酶) 的蛋白酶抑制劑。具體而言，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13被報(bào)道分別抑制組織蛋白酶K 禾口 L(Welss，Τ.等，Biochemistry 42(2003)7381—7389 ；Jayakumar, Α.等，Arch. Biochem. Biophys. 409(2003)367-374)。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白13最初作為HaCaT細(xì)胞中的UV阻遏型基因被發(fā)現(xiàn)(Abts, H. F.等，J. Mol. Biol. 293 (1999) 29-39)。獨(dú)立地，它被稱(chēng)為 “headpin” 并且相應(yīng)的基因被其他作者繪圖于染色體18q上(Spring，P.等，Biochem. Biophys. Res. Comm. 264(1999099-304)。在此研究中，RNA印跡分析和相關(guān)RT-PCR揭示，與正常鱗狀上皮相比，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的mRNA表達(dá)在口腔鱗狀細(xì)胞癌中被減量調(diào)節(jié)?；赗T-PCR分析的早期研究揭示，與未受影響的皮膚相比，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13在患銀屑病患者受影響的皮膚中過(guò)量表達(dá)(Abts，H. F.等，J. Mol. Biol. 293 (199909-39)。在更近期的研究中，這些發(fā)現(xiàn)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡和IHC在蛋白水平上證實(shí)。在正常的皮膚中，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13主要在基底層中表達(dá)(Moussali， H.等，Exp. Dermatol. 14(2005)420-428) 絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的分布和表達(dá)水平在銀屑病皮膚中是不同的；已發(fā)現(xiàn)在顆粒層中表達(dá)最高。在相同的研究中，作者報(bào)道絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13在皮膚紅斑狼瘡和惡性腫瘤中過(guò)量表達(dá)。此外，這些作者用RT-PCR證實(shí)了他們的發(fā)現(xiàn)。在另一個(gè)研究中，分析了絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的表達(dá)與其靶標(biāo)蛋白酶 Cat L 的關(guān)系(Bylaite, M.等，Exp. Dermatol. 15 (2006) 110-118)。作者再次顯示，與正常組織相比，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的表達(dá)在皮膚惡性腫瘤中增加并重新分布；但是絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的表達(dá)與Cat L沒(méi)有直接的關(guān)系。最近，ffalz,M.等人(Exp. Dermatol. 16(2007)715-723)產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因小鼠，所述轉(zhuǎn)基因小鼠除了表達(dá)內(nèi)源性鼠絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以外還表達(dá)人絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13。這些轉(zhuǎn)基因小鼠的特征在于化學(xué)致癌作用后腹部皮毛異常及皮膚癌易感性較高。這些發(fā)現(xiàn)暗示絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13在皮膚疾病發(fā)展中的重要作用。如對(duì)技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的，本發(fā)明不應(yīng)解釋為受限于SEQ ID NO 1的全長(zhǎng)蛋白絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的生理學(xué)或人工片段、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的二次修飾以及絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的等位基因變體也被本發(fā)明包括。多肽的變體由相同的基因編碼，但其等電點(diǎn)(=PI)或分子量(=MW)或兩者可不同， 例如因選擇性mRNA或前mRNA加工所致。變體的氨基酸序列與相應(yīng)的標(biāo)志物序列95%以上相同。人工片段優(yōu)選包含合成或通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生的肽，其至少包含一個(gè)診斷關(guān)注的表位，該表位由如從SEQ ID N0:1中公開(kāi)的序列獲得的至少6、7、8、9或10個(gè)連續(xù)氨基酸組成。 這種片段可有利地用于抗體的產(chǎn)生或作為免疫測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)品。本文所用每個(gè)下面的術(shù)語(yǔ)都具有與其在該部分中有關(guān)的含義。冠詞“一”和“一個(gè)”在本文中用于指一個(gè)或多于一個(gè)(即至少一個(gè))冠詞的語(yǔ)法賓語(yǔ)。舉例來(lái)說(shuō)，“標(biāo)志物”意指一個(gè)標(biāo)志物或多于一個(gè)標(biāo)志物。術(shù)語(yǔ)“至少”用以表示任選地可存在一個(gè)或多個(gè)其它對(duì)象。表述“一個(gè)或多個(gè)”表示1-50個(gè)，優(yōu)選1-20個(gè)，也優(yōu)選2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或 15個(gè)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)志物”或“生化標(biāo)志物”是指待用作用于分析患者測(cè)試樣品的靶標(biāo)的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種分子靶標(biāo)的實(shí)例為蛋白質(zhì)或多肽。在本發(fā)明中用作標(biāo)志物的蛋白質(zhì)或多肽考慮包括所述蛋白質(zhì)天然存在的變體以及所述蛋白質(zhì)或所述變體的片段，特別是，免疫學(xué)上可檢測(cè)的片段。免疫學(xué)上可檢測(cè)的片段優(yōu)選包含所述標(biāo)志物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20個(gè)連續(xù)氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，由細(xì)胞釋放的或存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)可被破壞，例如在炎癥過(guò)程中，并可被降解或切割成這類(lèi)片段。 某些標(biāo)志物以非活性形式合成，隨后可由蛋白酶解活化。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，蛋白質(zhì)或其片段也可作為復(fù)合體的部分存在。在本發(fā)明的意思內(nèi)，這種復(fù)合體也可用作標(biāo)志物。 另外或備選地，標(biāo)志物多肽或其變體可帶有翻譯后修飾。優(yōu)選的翻譯后修飾為糖基化、?；?或磷酸化。優(yōu)選通過(guò)利用特異性結(jié)合劑從樣品中特異地測(cè)定標(biāo)志物絲氨酸蛋白酶抑制蛋白 B13。特異性結(jié)合劑例如絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的受體，是結(jié)合絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的凝集素或絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的抗體。優(yōu)選使用結(jié)合絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的兩種同工型的特異性結(jié)合劑。特異性結(jié)合劑對(duì)其相應(yīng)的靶標(biāo)分子具有至少I(mǎi)O7I/ mol的親和力。該特異性結(jié)合劑對(duì)其靶標(biāo)分子優(yōu)選具有IO8Vmol的親和力或也優(yōu)選IO9I/ mol的親和力。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，術(shù)語(yǔ)特異性用來(lái)表示存在于樣品中的其它生物分子不顯著地結(jié)合對(duì)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13特異的結(jié)合劑。優(yōu)選地，結(jié)合靶標(biāo)分子以外的生物分子的水平導(dǎo)致結(jié)合親和力，該結(jié)合親和力最高分別為靶標(biāo)分子親和力的僅10% 以下、僅5%以下、僅2%以下或者僅以下。優(yōu)選的特異性結(jié)合劑將同時(shí)符合上述關(guān)于親和力和特異性的最低標(biāo)準(zhǔn)。特異性結(jié)合劑優(yōu)選為與絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13反應(yīng)的抗體。術(shù)語(yǔ)抗體是指多克隆抗體、單克隆抗體、這些抗體的抗原結(jié)合片段、單鏈抗體和包含抗體結(jié)合域的遺傳構(gòu)建體?？墒褂锰禺愋越Y(jié)合劑的保留上述標(biāo)準(zhǔn)的任意抗體片段?？贵w由現(xiàn)有技術(shù)方法產(chǎn)生，例如，如 Tijssen 所描述白勺方法(Tijssen，P.，Practice and theory of enzyme immunoassays(酶免疫測(cè)定的實(shí)踐和原理)，11，Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam，整本書(shū)，尤其是第43-78頁(yè))。另外，技術(shù)人員熟知基于可用于抗體的特異性分離的免疫吸附劑的方法。通過(guò)這些方法，多克隆抗體的質(zhì)量和從而其在免疫測(cè)定中的性能可得到提高(Ti jssen, P.，見(jiàn)上，第108-115頁(yè))。為獲得如本發(fā)明所公開(kāi)的成果，可使用在兔中產(chǎn)生的多克隆抗體。但是，同樣清楚
6的是，也可使用來(lái)自不同物種(例如，大鼠或豚鼠)的多克隆抗體，以及單克隆抗體。由于可以以所需的任意量產(chǎn)生具有恒定性質(zhì)的單克隆抗體，其代表了臨床常規(guī)測(cè)定開(kāi)發(fā)中的理想工具。針對(duì)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的單克隆抗體的產(chǎn)生和使用以及其在本發(fā)明方法中的使用，分別代表了其它優(yōu)選的實(shí)施方案。本文所用的術(shù)語(yǔ)“測(cè)試樣品”是指用于體外評(píng)估目的而從個(gè)體獲得的生物學(xué)樣品。術(shù)語(yǔ)“評(píng)估肺鱗狀細(xì)胞癌”用以表示，根據(jù)本發(fā)明的方法將(單獨(dú)或與其它標(biāo)志物或變量，例如由UICC給出的標(biāo)準(zhǔn)(見(jiàn)上面)一起)例如幫助醫(yī)師建立或確定SCC的不存在或存在。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到的，在體外作出任何這種評(píng)估。然后丟棄患者樣品。患者樣品僅用于本發(fā)明的體外診斷方法，并且患者樣品材料并不轉(zhuǎn)移回患者體內(nèi)。典型地，該樣品為包含細(xì)胞的樣品。免疫組織化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到，染料批次變化和某些環(huán)境條件例如相對(duì)濕度的差異性，可影響使用本發(fā)明方法在不同時(shí)間獲得的結(jié)果。在本發(fā)明方法的某些實(shí)施方案中，試劑和批次間的差異性通過(guò)使用相同試劑對(duì)測(cè)試樣品細(xì)胞和合適的對(duì)照樣品細(xì)胞進(jìn)行染色來(lái)控制。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種體外評(píng)估SCC的方法，包括測(cè)定單個(gè)測(cè)試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及利用測(cè)定結(jié)果評(píng)估SCC。在一些情形中，除了從患者中獲得測(cè)試樣品外，提供對(duì)照樣品也可能會(huì)有幫助。這類(lèi)對(duì)照樣品可為陰性對(duì)照樣品、陽(yáng)性對(duì)照樣品或包含這些對(duì)照類(lèi)型中的一種或多種的混合對(duì)照。陰性對(duì)照樣品優(yōu)選包含正常肺組織、多種亞型的肺癌如小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺大細(xì)胞癌或其多種組合。陽(yáng)性對(duì)照樣品優(yōu)選包含分類(lèi)為肺鱗狀細(xì)胞癌的組織。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)了一種用于體外評(píng)估肺鱗狀細(xì)胞癌的方法，包括 (a)測(cè)定測(cè)試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，(b)測(cè)定陰性對(duì)照樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及(c)在評(píng)估肺鱗狀細(xì)胞癌中，將步驟(a)和(b)的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較， 其中與陰性對(duì)照樣品中的水平相比，所述測(cè)試樣品中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13水平升高指示肺鱗狀細(xì)胞癌。如上面所指出，在某些情形中包含肺鱗狀細(xì)胞癌的樣品可用作陽(yáng)性對(duì)照并且優(yōu)選與待研究樣品平行測(cè)定。在這種情形中，陽(yáng)性對(duì)照樣品中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陽(yáng)性結(jié)果表明該測(cè)試程序在技術(shù)水平上起作用。在這些條件下測(cè)試樣品對(duì)于絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陽(yáng)性染色，測(cè)試樣品指示潛在的惡性腫瘤為SCC。本發(fā)明的發(fā)明人令人意想不到地能夠證明，標(biāo)志物蛋白絲氨酸蛋白酶抑制蛋白 B13顯示與肺鱗狀細(xì)胞癌的強(qiáng)烈相關(guān)?？紤]對(duì)不同類(lèi)型肺癌(尤其是SCC)進(jìn)行分類(lèi)的不確定性，可能恰當(dāng)?shù)氖?，針?duì)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的染色可成為評(píng)估患有NSCLC的患者以及將其分類(lèi)為SCC和其它“非SCC”肺癌的關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)之一。用于評(píng)估特定臨床(疾病)實(shí)體的理想情況會(huì)是以下情形，其中單一事件或過(guò)程將導(dǎo)致相應(yīng)的疾病，如例如在大多數(shù)傳染性疾病中。在所有其它情況中，正確的診斷可能非常困難，尤其是當(dāng)疾病的病因?qū)W未被完全明白時(shí)，如LC的情形。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，沒(méi)有生化標(biāo)志物對(duì)于既定多因素疾病例如對(duì)于LC的診斷有100%的特異性同時(shí)又具有 100%的靈敏度。但是，可將生化標(biāo)志物例如CYFRA21-l、CEA、NSE、proGRP或本文所示的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，用于以某種可能性或預(yù)測(cè)值評(píng)估例如疾病的存在、不存在或嚴(yán)重性。因此在常規(guī)臨床診斷中，在評(píng)估潛在疾病時(shí)通常一起考慮各種臨床癥狀和生物學(xué)標(biāo)志物。有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)家可容易地將肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌兩種主要種類(lèi)。但是，難以進(jìn)一步細(xì)分腫瘤亞型，尤其是對(duì)最初發(fā)現(xiàn)患有NSCLC的患者。如上所述， NSCLC被理解為包含三種主要的疾病亞群鱗狀細(xì)胞癌、腺CA和大細(xì)胞癌。本發(fā)明公開(kāi)了一種有助于將鱗狀細(xì)胞癌與所有其它類(lèi)型的NSCLC(即非SCC的NSCLC)區(qū)分的診斷方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)了一種用于在體外相對(duì)于其它類(lèi)型的NSCLC對(duì)鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)行鑒別診斷的方法，包括(a)測(cè)定包含非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的測(cè)試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及(b)利用步驟(a)的測(cè)定結(jié)果用于相對(duì)于其它NSCLC對(duì)鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)行鑒別診斷，其中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陽(yáng)性測(cè)定結(jié)果指示肺鱗狀細(xì)胞癌而絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陰性測(cè)定結(jié)果則指示其它類(lèi)型的NSCLC。在本發(fā)明方法中，測(cè)試樣品或患者樣品優(yōu)選為包含細(xì)胞的樣品，例如組織樣品。優(yōu)選地，測(cè)試樣品為如通過(guò)活組織檢查或手術(shù)獲得的組織塊。同樣優(yōu)選的是，這種測(cè)試樣品為組織切片。備選地，細(xì)胞可通過(guò)進(jìn)行支氣管肺泡灌洗從肺中獲得，它們可通過(guò)適于收集上皮襯液(包含細(xì)胞)的設(shè)備抽出，或可從唾液中獲得細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明和本文公開(kāi)的各種方法因而涉及包含細(xì)胞的測(cè)試樣品，所述細(xì)胞從支氣管肺泡灌洗或上皮襯液中獲得。包含細(xì)胞的測(cè)試樣品可經(jīng)歷多種分析途徑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13將在原位即在測(cè)試樣品的細(xì)胞或組織內(nèi)進(jìn)行測(cè)定；在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可溶解測(cè)試樣品的細(xì)胞并在細(xì)胞或組織裂解液中測(cè)定絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13。對(duì)于原位測(cè)定絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，優(yōu)選將包含待研究細(xì)胞的測(cè)試樣品裝在顯微鏡載玻片上。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種樣品可為不用甲醛固定和沒(méi)有包埋(例如沒(méi)有包埋在石蠟中)的樣品，例如技術(shù)人員已知分別為新鮮的組織樣品或新鮮的冰凍組織樣品的樣品。但是，在臨床常規(guī)中，優(yōu)選包含細(xì)胞的樣品接受標(biāo)準(zhǔn)化的固定和/或包埋程序。在優(yōu)選方式中，本發(fā)明的方法基于已用福爾馬林固定和石蠟包埋的測(cè)試樣品來(lái)實(shí)施。對(duì)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是，先前已固定和包埋的樣品必須經(jīng)過(guò)預(yù)處理以至少除去包埋材料。 如果進(jìn)一步需要，在免疫組織化學(xué)領(lǐng)域，多種方法處于可用于重新獲得例如免疫可檢測(cè)表位的情況(stake)。這類(lèi)方法被技術(shù)人員統(tǒng)稱(chēng)為抗原恢復(fù)的方法。如果必須研究可能包含或懷疑包含肺贅生性細(xì)胞的測(cè)試樣品，則無(wú)疑應(yīng)使用本發(fā)明的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明用被懷疑含有贅生性細(xì)胞的測(cè)試樣品來(lái)實(shí)施。每當(dāng)要原位(在細(xì)胞表面或內(nèi)部、在組織切片中等等)測(cè)定絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13時(shí)，這樣的測(cè)定中使用的方法將優(yōu)選為任何合適的免疫組織化學(xué)方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13通過(guò)免疫染色方法進(jìn)行測(cè)定。癌癥診斷，在治療之前、期間或之后的疾病的最初診斷和病程的后續(xù)監(jiān)測(cè)兩者，傳統(tǒng)上通過(guò)對(duì)從患者中移除的細(xì)胞或組織樣品的組織學(xué)檢查來(lái)確定。臨床病理學(xué)家需要能夠準(zhǔn)確地測(cè)定這類(lèi)樣品是良性還是惡性，以及對(duì)被視為惡性的腫瘤樣品的攻擊性進(jìn)行分類(lèi)，因?yàn)檫@些測(cè)定常形成選擇合適的患者治療過(guò)程的基礎(chǔ)。類(lèi)似地，病理學(xué)家需要能夠檢測(cè)癌癥已經(jīng)生長(zhǎng)程度，或尤其由于治療(最特別地用用化療劑或生物制劑的治療)所致進(jìn)入緩解的程度。組織學(xué)檢查傳統(tǒng)上需要組織染色程序，該程序使得樣品的形態(tài)學(xué)特征在光學(xué)顯微鏡下容易觀察。在檢查染色樣品后，病理學(xué)家通常作出腫瘤樣品是否為惡性的定性決定。但是，僅通過(guò)樣品的組織學(xué)檢查難以確定腫瘤的攻擊性，因?yàn)槟[瘤的攻擊性常為腫瘤內(nèi)細(xì)胞的生物化學(xué)結(jié)果，例如蛋白質(zhì)的表達(dá)或阻抑以及蛋白質(zhì)活化，其可能會(huì)或不會(huì)受到樣品的形態(tài)學(xué)影響。因此，能夠評(píng)估腫瘤樣品內(nèi)細(xì)胞的生物化學(xué)是重要的。另外，期望能夠?qū)δ[瘤相關(guān)基因或蛋白兩者分別進(jìn)行觀察和定量。在本發(fā)明方法的實(shí)施中，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13可用自身可檢測(cè)地標(biāo)記的特異性試劑(最優(yōu)選抗體)進(jìn)行檢測(cè)，或利用未標(biāo)記的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13特異性抗體和可檢測(cè)地標(biāo)記并識(shí)別絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13特異性抗體的第二抗體來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。 通常在顯微鏡下由有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)家評(píng)估染色的細(xì)胞或組織樣品。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用雙組分免疫組織化學(xué)染色系統(tǒng)來(lái)區(qū)別地染色絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13和組織或細(xì)胞樣品，使得染色的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13 可以更容易地與復(fù)染的組織或細(xì)胞樣品區(qū)分。免疫組織化學(xué)染色后，優(yōu)選由計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)生成的組織或細(xì)胞樣品的光學(xué)圖像，接著在光學(xué)顯微鏡下放大并分成圖像對(duì)。 分開(kāi)的圖像用一對(duì)光學(xué)過(guò)濾器增強(qiáng)，一個(gè)過(guò)濾器具有與著色劑相應(yīng)的最大吸收而另一個(gè)過(guò)濾器具有與復(fù)染劑相應(yīng)的最大吸收，從而在兩種著色劑之間提供最佳的區(qū)別。本領(lǐng)域已知的自動(dòng)(計(jì)算機(jī)輔助)圖像分析系統(tǒng)可增強(qiáng)樣品的目視檢查。在典型的系統(tǒng)中，將細(xì)胞或組織樣品暴露于對(duì)特定生物學(xué)標(biāo)志物特異的可檢測(cè)地標(biāo)記的試劑中，然后細(xì)胞的放大圖像由計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理，該計(jì)算機(jī)自電荷耦合器件(CCD)或照相機(jī)(例如電視攝象機(jī))接收?qǐng)D像。這種系統(tǒng)可用來(lái)檢測(cè)和測(cè)定樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的水平。這種方法論提供了更準(zhǔn)確的癌癥診斷和更佳地表征在組織學(xué)鑒定的癌細(xì)胞中的基因表達(dá)。組織樣品的定量免疫組織化學(xué)圖像分析的示例性程序的描述可大體上參見(jiàn)WO 01/519 和WO 01/51928，兩者均通過(guò)引用以其整體結(jié)合到本文中。舉例來(lái)說(shuō)，定量圖像分析可在從 Becton Dickinson Company, Mountain View, Calif■購(gòu)買(mǎi)的 Cell Analysis Systems Model 200 (細(xì)胞分析系統(tǒng)模型200)上進(jìn)行。如本發(fā)明所包括的，定量圖像分析可在來(lái)自其它廠商的系統(tǒng)上進(jìn)行，例如但不限于ChromaVision Medical Systems (Chroma Vision 醫(yī)學(xué)系統(tǒng))(San Juan Capistrano, Calif.)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法利用如下的圖像分析系統(tǒng)來(lái)實(shí)施。在如上所述的免疫組織化學(xué)染色后，可通過(guò)數(shù)字化染色樣品的顯微圖像，以及將數(shù)字化圖像的每個(gè)圖像元素(像素)的光強(qiáng)度值轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)染色細(xì)胞組分(例如核)百分比的光密度值，來(lái)定量測(cè)定表達(dá)細(xì)胞的百分比。更具體地，使用數(shù)字灰度圖像，計(jì)算機(jī)化的圖像分析可用以確定具有特定染色的細(xì)胞量?；叶葓D像代表了光增強(qiáng)因子(例如色原)的量，光學(xué)增強(qiáng)因子結(jié)合正在研究的特定靶標(biāo)，從而使靶標(biāo)可光學(xué)放大和顯像。在第一步中，細(xì)胞中任何表達(dá)的靶標(biāo)蛋白如下鑒定通過(guò)加入對(duì)靶標(biāo)蛋白特異的可檢測(cè)地標(biāo)記的第一抗體，或備選地未標(biāo)記的第一抗體和對(duì)第一抗體特異的可檢測(cè)地標(biāo)記的第二抗體?？贵w與樣品溫育一段時(shí)間以形成復(fù)合體，如果這些抗原存在的話。接著通過(guò)直接檢測(cè)標(biāo)記，或者如果可檢測(cè)標(biāo)記為酶，則將該部分與化合物例如色原在合適條件下進(jìn)行溫育，來(lái)使復(fù)合物可見(jiàn)。例如，第一抗體可用過(guò)氧化物酶標(biāo)記，隨后使用色原DAB。在第二步中，將組織用另一光學(xué)增強(qiáng)因子復(fù)染，例如但不限于乙綠。盡管使用過(guò)氧化物酶和乙綠的染色技術(shù)堪稱(chēng)模范，但是其它著色劑和光學(xué)增強(qiáng)因子也是合適的。例如，其它色原可與過(guò)氧化物酶使用，包括但不限于3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)，其產(chǎn)生紅色和4-氯-1萘酚。另外，可用于標(biāo)記第一抗體的其它酶由本發(fā)明包括，包括但不限于堿性磷酸酶?？膳c堿性磷酸酶使用的色原的實(shí)例，包括但不限于固紅、固綠和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽/氮藍(lán)四唑 (BCIP/NBT)。此外，熒光染料的使用由本發(fā)明方法所包括。熒光染料的非限制性實(shí)例為熒光素(異硫氰酸熒光素或FITC)和羅丹明。此外，乙綠的使用是復(fù)染劑的模范，但其它復(fù)染劑可用在本發(fā)明方法中。例如，另外的復(fù)染劑的非限制性名單包括蘇木精、固紅、甲基綠?；诳色@得的光譜分離選擇復(fù)染劑用于特定的染色，使得在兩個(gè)獨(dú)立的波長(zhǎng)處可獲得過(guò)濾。例如，乙綠提供與DAB沉淀物良好的光譜分離，如下面更詳細(xì)的描述。提供良好色譜分離的著色劑/復(fù)染劑對(duì)的其它實(shí)例包括但不限于固紅和蘇木精、AEC和蘇木精以及FITC和德克薩斯紅(Texas Red)。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可的是，此著色劑和復(fù)染劑名單僅為示范性的，因此不起限制本發(fā)明的作用。如上所述，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13也可從測(cè)試樣品中測(cè)定，其中細(xì)胞已溶解或以其它方式處理以釋放絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13。在優(yōu)選實(shí)施方案中，測(cè)試樣品經(jīng)處理以釋放絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，并通過(guò)免疫測(cè)定程序測(cè)定絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13。 絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13可在溶解的樣品中測(cè)定的優(yōu)選免疫測(cè)定方法為酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、基于化學(xué)發(fā)光的免疫測(cè)定(例如來(lái)自Roche的Elecsys )或蛋白質(zhì)印跡。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13標(biāo)志物在評(píng)估肺鱗狀細(xì)胞癌中的應(yīng)用代表了本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。也優(yōu)選的是，在來(lái)自先前被分類(lèi)為患有非小細(xì)胞肺癌的患者的組織樣品中，使用絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13標(biāo)志物將肺鱗狀細(xì)胞癌與其它類(lèi)型肺非小細(xì)胞癌區(qū)分開(kāi)患者。提供以下實(shí)施例、序列表和圖來(lái)幫助理解本發(fā)明，其真實(shí)范圍在所附權(quán)利要求中給出。應(yīng)理解，可對(duì)給出的方法作出修改而不背離本發(fā)明的精神。序列表的描述SEQ ID NO 1 顯示了絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13蛋白的氨基酸序列3kDa ； 391 個(gè)氨基酸；SWISS-PR0T 檢索號(hào)Q9UIV8)。SEQ ID NO 2顯示了由可變剪接產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13蛋白同工型的氨基酸序列(38. 4kDa, 339個(gè)氨基酸)。SEQ ID NO 3 正向引物L(fēng)C5for_EcoRI (用于EcoRI克隆位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和 N-末端肽突出端(其示于SEQ ID NO :5中)的特征)。SEQ ID NO 4 反向引物 LC5rev-HindIII。SEQ ID NO 5 N-末端肽突出端。


圖1分別顯示了 10名SCC患者和10名腺Ca患者的蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果(對(duì)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13進(jìn)行免疫染色)。明顯地，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的信號(hào)強(qiáng)度在全部10名分類(lèi)為SCC的患者的腫瘤組織裂解液中增加，而在腺Ca中，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13蛋白僅在1名患者中可檢測(cè)到或根本不存在。圖2將來(lái)自分類(lèi)為患有SCC的肺癌患者的組織切片與從分類(lèi)為患有肺腺Ca的肺癌患者中得到的組織切片進(jìn)行比較。所示分別為3名不同的SCC患者(面板A)和3名不同腺Ca患者(面板B)的組織切片結(jié)果。強(qiáng)烈的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13特異性染色在所有SCC樣品中觀察到，而在腺Ca切片中沒(méi)有可見(jiàn)的染色。正常肺組織(例如SCC中的腫瘤組織附近)是絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13陰性的。實(shí)施例1針對(duì)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的抗體的產(chǎn)生產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的多克隆抗體，用于在免疫檢測(cè)測(cè)定例如蛋白質(zhì)印跡法和IHC中，進(jìn)一步使用抗體。a)大腸桿菌中重組蛋白的表達(dá)為了產(chǎn)生針對(duì)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的抗體，在大腸桿菌中產(chǎn)生重組抗原。因此，利用正向引物L(fēng)C5for-EcoRI和反向引物L(fēng)C5rev-HindIII，從獲得自German Resource Center for Genome Research (德國(guó)基因組研究資源中心)(RZPD，Berlin, Germany)的全長(zhǎng)cDNA克隆DKFZp686E1318Q2中PCR擴(kuò)增絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13編碼區(qū)從，所述 LC5for-EcoRI 為 5，ATGCGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCA TCACCATCACATTGAAGGCCGTGATTCACTTGGCGCCGTCAGCACTC(SEQ ID NO 3) (EcoRI-位點(diǎn)和起始密碼子加下劃線)，所述 LC5rev-HindIII 為 5，GCATAAGCTTTCATTAAGGAGAAGAAAATCTGCCGAAG AAG (SEQ ID NO 4) (HindIII 位點(diǎn)加下劃線)。將編碼N-末端MRGSHHHHHHIEGR(SEQ ID NO 5)肽突出端的正向引物特征(除了 EcoRI克隆位點(diǎn)和核糖體結(jié)合位點(diǎn))寡核苷酸，符合讀框地引入絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13 多肽。將 EcoRI/Hindlll 消化的 PCR 片段連接到相應(yīng) pQE-30 (Qiagen，Hilden，Germany)載體片段內(nèi)，所述載體片段隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XLl-blue感受態(tài)細(xì)胞中。分析序列后，按照制造商的說(shuō)明書(shū)，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，用于在pQE載體系列的IPTG 誘導(dǎo)型T5啟動(dòng)子下表達(dá)。為純化MRGSHHHHHHIEGR-絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13融合蛋白，將11誘導(dǎo)過(guò)夜的細(xì)菌培養(yǎng)物通過(guò)離心沉淀，將細(xì)胞沉淀通過(guò)重懸于PH 8. 0的IOOmM磷酸鈉緩沖液、7M鹽酸胍、5mM咪唑、20mM硫代甘油中裂解。通過(guò)離心沉淀不溶物質(zhì)并將上清液加入鎳-氨基三乙酸(Ni-NTA)金屬親和層析中用數(shù)個(gè)柱床體積的裂解緩沖液洗滌柱，然后用以下溶液沖洗a) IOOmM磷酸鈉緩沖液，pH 8. 0, IOmM Tris-HCl,pH 8. 0，8M脲，20mM硫代甘油；b) IOOmM 磷酸鹽緩沖液，PH 8. 0,0. 5%十二烷基硫酸鈉(SDS)，20mM硫代甘油；和c) IOOmM磷酸鈉緩沖液，pH 8.0,0. SDS，20mM硫代甘油。最后，用IOOmM磷酸鈉緩沖液，pH 5.0,0. 1% SDS, 20mM硫代甘油在酸性條件洗脫結(jié)合的抗原，并貯存于4°C相同緩沖液中。b)多克隆抗體的產(chǎn)生免疫制備蛋白質(zhì)溶液(100μ g/ml絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13蛋白)和完全弗氏助劑按1 1的比例的新鮮乳液，用于免疫。每只兔用Iml乳液在1、7、14和30、60、90天進(jìn)行免疫。抽血，得到的抗絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13血清用于如實(shí)施例2和3所描述的進(jìn)一
11步試驗(yàn)。實(shí)施例2利用實(shí)施例1中描述的多克隆抗體在人肺癌組織中檢測(cè)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白 B13的蛋白印跡組織制備將0.8-1. 2g冰凍組織切成小塊，轉(zhuǎn)移到混合器球磨機(jī)的冷凍研磨罐中并用液氮完全冷凍。組織在球磨機(jī)中被粉碎，溶于10倍體積(w/v)的裂解緩沖液(40mM檸檬酸鈉， 5mM MgCl2,1% Genapol X-080，0. 02%疊氮化鈉，無(wú)EDTA 的 Complete [Roche Diagnostics GmbH,Mannheim, Germany,目錄號(hào)1873580])中，接著在Wheaton 玻璃勻菜機(jī)中勻菜(20 X 松散配合，20X緊密配合)。將勻漿進(jìn)行離心(5000X g，10分鐘)，上清液轉(zhuǎn)移到另一小瓶中并再次離心O0000Xg，15分鐘)。所得上清液包含可溶蛋白并用于進(jìn)一步分析。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法利用hvitrogen，Karlsruhe, Germany的試劑和儀器進(jìn)行。對(duì)每一個(gè)經(jīng)測(cè)試的組織樣品，用還原性NuPAGE anvitrogerOSDS樣品緩沖液稀釋15 μ g組織裂解液，并在95°C加熱lOmin。在4-12%的NuPAGE 疑膠(Tris-甘氨酸) 上在MES運(yùn)行緩沖系統(tǒng)中跑樣。凝膠分離的蛋白混合物用^witrogen XCell II Blot Module(Invitrogen)和NuPAGE 轉(zhuǎn)移緩沖系統(tǒng)點(diǎn)到硝酸纖維素膜上。膜在PBS/0. 05% Tween-20 中洗 3 次并用 Roti _Block 封閉緩沖液(A151. 1 ；Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany)封閉池。第一抗體多克隆兔抗絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13血清(產(chǎn)生在實(shí)施例2 中描述)，以1 30，000用Roti -BloCk封閉緩沖液稀釋并與膜溫育lh。膜在PBS/0. 05% Tween-20中洗6次。特異性結(jié)合的第一兔抗體用POD-綴合的多克隆綿羊抗兔IgG抗體標(biāo)記，用0. 5XRoti -BloCk封閉緩沖液稀釋至10mU/ml。溫育Ih后，膜在PBS/0. 05 % Tween-20中洗6次。為檢測(cè)結(jié)合的POD-綴合的抗兔抗體，將膜與Lumi-Lightpuis蛋白質(zhì)印跡底物(定購(gòu)號(hào) 2015196，Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)溫育并暴露于放射自顯影膜。10名SCC患者和10名腺Ca患者分別用WB進(jìn)行分析(圖1)。顯然，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的信號(hào)強(qiáng)度在所有10名患者的腫瘤組織裂解物中增加，而在腺Ca中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的表達(dá)僅在1名患者中可檢測(cè)到。因此，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13 在腫瘤組織中的SCC特異性過(guò)量表達(dá)由蛋白質(zhì)印跡分析明確地顯示。實(shí)施例3利用實(shí)施例1描述的多克隆抗體檢測(cè)人肺癌組織中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13 的免疫組織化學(xué)(IHC)分析將石蠟包埋的組織切成2μπι的系列切片，在二甲苯中去除石蠟(3X5min)并通過(guò)一系列梯度乙醇再水化，然后用去離子水和PBS進(jìn)行兩個(gè)沖洗步驟(lXanin)?？乖謴?fù)用 Retrivit pH4. O (Innogenex)在 97 °C-100 °C 進(jìn)行 20min。將切片冷卻 20min 并用 PBS (2 X Imin)漂洗。通過(guò)含3 % H2O2的PBS中中溫育5min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，然后將切片用PBS漂洗2次，接著用TBS+Tween 20 (LabVision 1666789)漂洗1次達(dá) 3min。室溫下用含馬血清的PBS(Horse-Blocking Serum,Vectastain ABC試劑盒，Elite Universal,Vector PK6200)阻斷免疫球蛋白的非特異性結(jié)合20min。按照制造商的說(shuō)明書(shū)， 用生物素阻斷系統(tǒng)(Dako X0590)阻斷內(nèi)源性生物素。為了對(duì)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13特異性染色，將切片與0.5 μ g/ml用抗體稀釋劑(Dako S2022)稀釋的多克隆抗體在4°C下溫育過(guò)夜。載玻片用TBS+Tween 20(LabVision 1666789)沖洗(3X ^iiin)，接著與生物素化的第二抗體(1 滴于 5ml PBS+1%馬血清中)(Vectastain ABC 試劑盒，Elite Universal, Vector PK6200)在室溫下溫育30min。用TBS+Tween 20沖洗(3Χ^ η)后，將切片與ABC 試劑(1滴試劑A加1滴試劑B于5ml PBS中)在室溫下溫育30min。載玻片用TBS+Tween 20(2X2min)沖洗，最后與二氨基聯(lián)苯胺色原溶液(DAB plus, Dako K3467)反應(yīng)5min，在用蒸餾水漂洗后，將其用蘇木精復(fù)染并固定。兔IgG片段(Dako X0903)用作陰性對(duì)照。
將來(lái)自SCC的組織切片與從腺Ca獲得的組織切片進(jìn)行比較。示例性地，圖2分別顯示了來(lái)自3名不同SCC患者(面板A)和來(lái)自3名腺Ca患者(面板B)的切片的結(jié)果。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13特異性染色在所有SCC樣品中觀察到，而在腺Ca切片中則沒(méi)有染色。因而，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13在SCC腫瘤組織中的特異性表達(dá)由IHC分析明確地證實(shí)。
權(quán)利要求
1.一種用于體外評(píng)估肺鱗狀細(xì)胞癌的方法，包括a)測(cè)定測(cè)試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及b)將步驟(a)的測(cè)定結(jié)果用于評(píng)估肺鱗狀細(xì)胞癌，其中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陽(yáng)性測(cè)定結(jié)果指示肺鱗狀細(xì)胞癌。
2.一種用于體外評(píng)估肺鱗狀細(xì)胞癌的方法，包括a)測(cè)定測(cè)試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，b)測(cè)定對(duì)照樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及c)在評(píng)估肺鱗狀細(xì)胞癌中，比較步驟(a)和(b)的測(cè)定結(jié)果，其中與所述對(duì)照樣品中的水平相比，所述測(cè)試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B的水平升高指示肺鱗狀細(xì)胞癌。
3.一種用于在體外相對(duì)于其它非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)鑒別診斷肺鱗狀細(xì)胞癌的方法，包括a)測(cè)定包含非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的測(cè)試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及b)將步驟(a)的測(cè)定結(jié)果用于相對(duì)于其它NSCLC鑒別診斷鱗狀細(xì)胞癌，其中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陽(yáng)性測(cè)定結(jié)果指示肺鱗狀細(xì)胞癌，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陰性測(cè)定結(jié)果指示其它NSCLC。
4.權(quán)利要求1-3之一的方法，其中所述測(cè)試樣品為通過(guò)活組織檢查獲得的組織塊。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述測(cè)試樣品為組織切片。
6.權(quán)利要求1-3之一的方法，其中所述測(cè)試樣品為支氣管肺泡灌洗或細(xì)胞外襯液。
7.權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)試樣品固定在顯微鏡載玻片上。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述測(cè)試樣品已用福爾馬林固定和石蠟包埋。
9.權(quán)利要求1、3-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)試樣品懷疑或已知含有贅生性細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13通過(guò)免疫染色方法測(cè)定。
11.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)試樣品經(jīng)處理以釋放出絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13并且絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13通過(guò)免疫測(cè)定方法測(cè)定。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述免疫測(cè)定方法選自ELISA或蛋白質(zhì)印跡。
13.絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13標(biāo)志物在評(píng)估肺鱗狀細(xì)胞癌中的用途。
14.絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13標(biāo)志物的用途，用于在來(lái)自患者的組織樣品中將肺鱗狀細(xì)胞癌與肺腺癌區(qū)分，所述患者先前已被分類(lèi)為患有非小細(xì)胞肺癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種輔助評(píng)價(jià)鱗狀細(xì)胞癌(＝SCC)的方法。其公開(kāi)了蛋白質(zhì)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13作為SCC標(biāo)志物的應(yīng)用。另外，其涉及一種用于評(píng)估從患有非小細(xì)胞肺癌(＝NSCLC)患者中獲得的組織樣品中的肺癌的方法以及用于將SCC與肺腺癌或大細(xì)胞癌區(qū)分的方法。
文檔編號(hào)G01N33/574GK102341709SQ201080010654
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2010年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日
發(fā)明者L·曼托瓦尼-恩德?tīng)? M·塔克, M·羅斯勒 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司