專利名稱：用于定量測定樣品中磷脂酶a1或a2活性的酶測定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于定量測定樣品中磷脂酶活性的酶測定法。
背景技術(shù)：
磷脂是生物膜的主要結(jié)構(gòu)組分。磷脂除了作為這種結(jié)構(gòu)作用之外，磷脂作為細(xì)胞信號過程中介導(dǎo)物的重要性變得日益明顯。結(jié)果，對代謝過程例如磷脂酶作用和脂質(zhì)分選和運(yùn)輸?shù)难芯靠焖僬归_。磷脂酶屬于一旦在界面系統(tǒng)中出現(xiàn)就表達(dá)其催化活性的最熟悉的界面酶家族。磷脂酶還屬于水解酶類，然而它們有利且特異性地打開水系統(tǒng)中存在的磷脂的酯鍵，取決于磷脂酶類型會得到游離脂肪酸、溶血磷脂、甘油磷脂、磷脂酸和游離醇。這些界面酶不是典型的從水相直接接近它們的底物的可溶性酶，因?yàn)樗鼈兊拿竸恿W(xué)途徑由兩個不同的步驟組成1)結(jié)合至組織化的底物2、催化步驟。根據(jù)它們在磷脂分子中的作用部位將磷脂酶分類(圖1) (11)。因此，磷脂酶Al (PLAl)水解磷脂的1_酰基，即其水解脂肪酸和磷脂1_位上甘油殘基之間的鍵。磷脂酶A2(PLA2)水解2-?；?，或者中心的酰基，并且磷脂酶C(PLC)和 D (PLD)，還稱作磷酸二酯酶，水解磷酸二酯鍵的不同側(cè)面。磷脂被PLAl或PLA2水解導(dǎo)致產(chǎn)生所謂的“溶血磷脂”。用PLAl選擇性地水解磷脂底物產(chǎn)生2-?；苎字⑶矣肞LA2選擇性地水解磷脂導(dǎo)致產(chǎn)生1-?；苎字?。磷脂酶代謝物參與種種細(xì)胞過程，包括信號傳導(dǎo)、宿主防御(包括抗菌效應(yīng))、血小板活化輔因子的形成、膜重建和一般的脂類代謝。分泌的磷脂酶A2 (sPLA2)是富含二硫鍵的，14-kDa, Ca2+-依賴性，胞外酶。它們與還稱作PAF-乙?；饷傅闹鞍紫嚓P(guān)磷脂酶A2 (Lp-PU^)不同。已經(jīng)描述了人中的 9個不同的sPLA2基因并分類成IB、IIA、IID、IIE、IIF、III、V、X和XII組。IB和IIA組酶表征的最多，但是最近發(fā)現(xiàn)的家族成員的生物學(xué)作用仍難以琢磨。最近，在臨床和非臨床人群中均開展的9個獨(dú)立的國際大型臨床研究證明，在 sPLA2和動脈粥樣硬化心血管病之間存在強(qiáng)的正相關(guān)(1-9)。更加明確地，sPLA2活性作為用于下列的新的有力工具突顯出來急性冠脈綜合征管理的風(fēng)險(xiǎn)分層、急性冠脈綜合征診斷、無癥狀患者中的心血管風(fēng)險(xiǎn)評估和心血管疾病的治療診斷和治療監(jiān)測。PLA2組還包括胞質(zhì)PLA2，其對PC的活性釋放花生四烯酸，它是前列腺素和白三烯以及可能的細(xì)胞內(nèi)第二信使生物合成的前體。磷脂酶A1 (PLA1)是水解磷脂并產(chǎn)生2-?；?溶血磷脂和脂肪酸的酶，并且在很多生物體中是保守的。哺乳動物具有數(shù)個在體外具有PLA1活性酶。細(xì)胞外PLA1包括磷脂酰絲氨酸(PS)-特異性PLA1 (PS-PLA1)、膜相關(guān)磷脂酸(PA)-選擇性PLA1 OiiPA-PLA1 α和 HiPA-PLA1 β)、肝臟脂肪酶(HL)、內(nèi)皮脂肪酶(EL)和胰臟脂肪酶相關(guān)蛋白2(PLRP》，所有這些酶屬于胰臟脂肪酶基因家族。前三種PLA1與其它酶在底物特異性、結(jié)構(gòu)特征和基因組織上不同，并且形成了胰臟脂肪酶基因家族中的亞家族。PS-PLA^ πιΡΑ-ΡΙΛα和HiPA-PLA1 β僅具有PLA1活性，而HL、EL和PLRP2除了具有PLA1活性外還表現(xiàn)出水解三?；视偷幕钚?。血清PLA2的測定法(1 利用了在熒光反應(yīng)產(chǎn)物分析中的液體-液體相分配。這些測定法是費(fèi)力的，需要費(fèi)時的反應(yīng)后分析。US2003/219849公開了用于測量磷脂酶活性的一般方法，其基于使用包含非熒光磷脂酰膽堿、選自磷脂酰甘油、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇或磷脂酸的非熒光負(fù)電荷磷脂以及選自熒光標(biāo)記磷脂酰膽堿和熒光標(biāo)記/負(fù)電荷磷脂的熒光標(biāo)記分子的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的磷脂成分被磷脂酶水解引起熒光強(qiáng)度變化。用于測定sPLA2活性的一個實(shí)例基于使用包含二油酰磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油和熒光標(biāo)記1，2-雙-(4，4- 二氟-5，7- 二甲基-4-硼-3a， 4a- 二氮雜-對稱引達(dá)省(s-indecene) _3_ i^一酰-sn-甘油基_3_磷脂酰膽堿(雙-氟硼熒FL C11-PC)的脂質(zhì)體。US2005/026235公開了用于測定磷脂酶活性的另一個普通方法，所述方法基于使
用包含熒光標(biāo)記磷脂酶底物的微團(tuán)或脂質(zhì)體形式的脂質(zhì)復(fù)合體，所述底物具有下式
O
,
R1-C —‘ O—C H2
O
,I
R2-C—O—CH O
I Il
M-C—O一 I'—O—L— 1)
！
Cr其中Rl是具有6至30個碳原子的飽和或不飽和烷基，R2是具有6至30個碳原子的飽和或不飽和烷基，L是化學(xué)鍵或連接體，并且D是發(fā)熒光的熒光團(tuán)。然而，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，包含脂質(zhì)體或微團(tuán)形式的磷脂酶底物存在數(shù)個缺點(diǎn)。的確，由于天然存在的甘油脂或甘油磷脂實(shí)際上不溶于水并且因?yàn)榻缑婷缚梢砸运蝗軤顟B(tài)存在，所以酶必須吸附至底物膜界面發(fā)生甘油脂或甘油磷脂水解。雖然表面上簡單，但是甘油脂或甘油磷脂雙層的水解是高度復(fù)雜的非平衡過程。通過磷脂酶快速產(chǎn)生脂肪酸或者脂肪酸和溶血磷脂產(chǎn)生了復(fù)雜的膜動力學(xué)，反過來這將擾亂自身并進(jìn)行持續(xù)的酶作用。的確，磷脂酶活性對膜特性敏感并且由許許多多的膜因素，包括磷脂首基大小、首基電荷、磷脂相狀態(tài)、磷脂動力學(xué)和膜曲率修飾。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了用于測定SPLA2活性的另一方法(試劑盒，目錄號765001sPLA2測定試劑盒產(chǎn)品冊，開曼(Cayman Chemical), Ann Arbor，MI，12/18/97 和試劑盒 #907-002， sPLA2 測定試劑盒，分析設(shè)計(jì)公司(Assay Design Inc.) 5777Hines Drive, Ann Arbor, Michigan 48108USA)。這些測定形式具有較多的局限性。例如，僅測量酶活性的測定法受其它酶對該底物的競爭性活性或者測試樣品中多種物質(zhì)存在的困擾。例如，磷脂酶A2家族的許多成員對氧化的磷脂酰膽堿具有酶活性。另外，開曼(Cayman)和分析設(shè)計(jì)公司(Assay design)活性測定法受背景信號困擾，這是因?yàn)檠逯械奈镔|(zhì)不依賴于SPLA2活性而轉(zhuǎn)變成底物。具體而言，這些試劑盒依賴于檢測游離巰基作為方法學(xué)的部分。雖然開曼測定法在實(shí)驗(yàn)室條件下工作良好，但是檢測游離巰基使得開曼試劑盒不適用于測量人樣品中的SPLA2，這是因?yàn)樵谌私M織、血漿或血清樣品中游離巰基豐富。此外，現(xiàn)存的測定法由于缺乏特異性會不正確地檢測到高活性。臨床環(huán)境中的假的活性測量值會導(dǎo)致疾病的錯誤診斷或者患者對期望降低酶活性的治療的。因此，由于脂質(zhì)體/微團(tuán)在溶液中結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定并且以多種形式從小的至大的，從多層的(在其它脂質(zhì)體內(nèi)的脂質(zhì)體)至單層的小泡存在，所以使用脂質(zhì)體/微團(tuán)形式的底物存在缺點(diǎn)。此外，通過將有機(jī)溶劑中的脂質(zhì)溶液滴入水溶液中生產(chǎn)脂質(zhì)體是非可重現(xiàn)性的過程，導(dǎo)致所生產(chǎn)的脂質(zhì)體性質(zhì)和組織更大的變化。因此，如果底物以這種方式存在的話，酶可獲得的底物數(shù)量，即脂質(zhì)體的外片，將是可變的。難以控制脂質(zhì)體大小還使得脂質(zhì)體制備的標(biāo)準(zhǔn)化成為難題。此外，人血清樣品中存在的數(shù)個因素會極大地影響用作脂質(zhì)酶酶測定法底物的脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)，并且因此影響磷脂酶活性的測量。所述因素為例如離子強(qiáng)度、充當(dāng)去污劑的脂類或分子的存在、或樣品中二價(jià)離子的濃度。因此，當(dāng)處理極其復(fù)雜的樣品，例如生物學(xué)樣品時，重要的是1)使磷脂酶活性不依賴性因素對底物的影響最小化，和2)能夠盡可能準(zhǔn)確地測量磷脂酶活性不依賴性因素，并從界面酶活性本身扣除它們。Cho等(12)公開了用于測定SPLA2活性的測定法，其基于使用放射性標(biāo)記磷脂包被珠。所述珠以1. 310_2個分子/A2，即1. 3個分子/nm2的平衡包裝密度以[3H]-P0PG(1_棕櫚酰-2-油?；?sn-甘油基-3-磷酸甘油)包被。該測定法存在下列缺點(diǎn)(i)放射性標(biāo)記不適用于診斷應(yīng)用，(ii)如在本發(fā)明實(shí)施例中所示，1.3個分子/nm2的包裝密度不適于在熒光測定法中使用，并且(iii)所述方法的檢測限是lng。在本領(lǐng)域中公開了少數(shù)幾個以磷脂包被的固相的實(shí)例然而，如在下文所示與本發(fā)明相比，熒光磷脂的分子蓋度通常更低，并且所述的包被的固相沒有被公開用于在測定磷脂酶Al或A2活性中使用。Bayerl等(US686834;3)涉及對物質(zhì)與由兩性材料制成的表面相互作用的分析，并且因此用于此目的公開了以兩性分子包被的載體材料(硅酸鹽結(jié)構(gòu))。 在實(shí)例中描述的所述包衣是10摩爾％陰離子帶電1，2_ 二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DMPG)、89. 97摩爾％兼性離子卵磷脂1，2-二油酸酰基-sn-3-甘油基-3-磷脂酰膽堿(DEPC)和0. 03摩爾％熒光標(biāo)志物1-棕櫚?；?-(1-芘癸?；?-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿的混合物。在該載體材料上的熒光分子的包裝密度因此小于1個熒光磷脂酶底物分子/nm2，這不適于在本發(fā)明中使用。Brian等(14)涉及細(xì)胞毒性T細(xì)胞的同種異型刺激并且用于此目的公開了以磷脂酰膽堿和膽固醇7 2比例與N-4-硝基苯并-2-氧雜-1，3- 二唑-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺的1摩爾％的泡懸浮液包被的二維表面(蓋玻片)。因此在該蓋玻片上的熒光分子包裝密度小于1個熒光磷脂酶底物分子/nm2，這不適于在本發(fā)明中使用。Das等(15)涉及肺表面活性劑被肺泡巨噬細(xì)胞的去除并且用于此目的公開了以 1 10至1 1000比例的熒光和非熒光二油酰磷脂酰膽堿混合物包被的石英或高嶺土微粒。因此在這些微粒上的熒光分子的包裝密度小于5個熒光磷脂酶底物分子/nm2，這不適于在本發(fā)明中使用。因此，更加精確的磷脂酶Al或A2活性測定法是極其感興趣的，特別是用于診斷領(lǐng)域的復(fù)雜樣品測試。因此，需要更敏感的、可重現(xiàn)性的和特異性的新的磷脂酶Al或A2活性測定法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目標(biāo)是以熒光染料標(biāo)記的磷脂酶Al或A2底物包被的固相，其中分子蓋度范圍從8至30個熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子/nm2。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述底物包含疏水部分、磷酸鹽部分和直接或通過任選連接體連接至疏水部分的熒光部分。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，底物是甘油磷脂。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述底物在sn-Ι脂肪酰鏈末端和/或sn-2脂肪酰鏈末端被標(biāo)記。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述底物以苯并(d，e，f)菲或4，4_ 二氟-5，7_ 二甲基-4-硼-3a，4a- 二氮雜-對稱引達(dá)省標(biāo)記。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述標(biāo)記的底物是在sn-Ι脂肪酸鏈上以供體熒光團(tuán)標(biāo)記和在sn-2脂肪酸鏈上以受體熒光團(tuán)標(biāo)記，或者相反。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述標(biāo)記的底物是在sn-Ι脂肪酸鏈上以熒光團(tuán)標(biāo)記和在sn-2脂肪酸鏈上以猝滅劑標(biāo)記，或者相反。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述固相是微粒，優(yōu)選珠。本發(fā)明的另一目標(biāo)是用于測定樣品中磷脂酶Al或A2活性的方法，所述方法包括-將樣品與如上所述以熒光染料標(biāo)記的磷脂酶Al或A2底物包被的固相在有效地允許磷脂酶斷裂熒光標(biāo)記磷脂酶底物的條件下接觸。-檢測作為時間函數(shù)的熒光。本發(fā)明的另一目標(biāo)是試劑盒，包含-含有如上所述以熒光染料標(biāo)記的磷脂酶Al或A2底物包被的標(biāo)記底物的第一容器，-含有緩沖溶液的第二容器。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含對照和/或校準(zhǔn)器。本發(fā)明的另一目標(biāo)是鑒定具有PLAl或PL2活性相關(guān)疾病或者處于具有或發(fā)展成 PLAl或PL2活性相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法，包括根據(jù)上述方法測定來自受試者樣品中的PLAl或PLA2酶活性。 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述PLA2活性相關(guān)疾病是心血管病和/或心血管事件。


圖1 磷脂酶水解甘油磷脂中的作用部位；圖2 :405nm處背景熒光發(fā)射對磷脂包被珠的分子蓋度；
圖3 :sPLA2活性(起點(diǎn)時的斜率)對磷脂包被珠的分子蓋度；圖4 在向磷脂包被珠中加入增加量的bv_sPLA2后得到的進(jìn)展曲線；圖5 在向磷脂包被珠中加入66fmol的bv_sPLA2后得到的進(jìn)展曲線；圖6 在不同量BSA存在下磷脂包被乳膠珠在405nm處的熒光(平均值+/_SD)；圖7 根據(jù)本發(fā)明的方法在SPLA2活性測量中的甘油三酯干擾；圖8 根據(jù)本發(fā)明的方法在SPLA2活性測量中的血紅蛋白干擾；圖9 根據(jù)本發(fā)明的方法在SPLA2活性測量中的膽紅素干擾；圖10 在向1-棕櫚?；?-(1-芘癸?；?-sn-甘油基-3-磷酸甲醇脂質(zhì)體加入 30 μ L人血清樣品后的進(jìn)展曲線；圖11 使用公布的方法的bv_sPLA2標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖12 使用本發(fā)明的方法的bv_sPLA2標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖13 在40-59歲的男性和女性中sPLA2活性的累積百分?jǐn)?shù)分布；圖14 (A)使用本發(fā)明方法的bv_sPLA2標(biāo)準(zhǔn)曲線，⑶使用本發(fā)明方法以米_曼氏模型擬合的bv-sPLA2標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖15:使用㈧分析設(shè)計(jì)公司試劑盒⑶開曼試劑盒和(C)本發(fā)明方法的 bv-sPLA2標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖16 使用分析設(shè)計(jì)公司方法和本發(fā)明方法對人樣品中SPLA2活性的比較。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的磷脂酶活性測定法是連續(xù)的、熒光的、動力學(xué)活性測定法。它基于隨著時間測量熒光染料標(biāo)記底物分子被樣品中所存在磷脂酶水解，所述熒光染料標(biāo)記底物包被在固相上，例如微球體或珠。本發(fā)明的一個目標(biāo)是以熒光染料標(biāo)記的磷脂酶Al或A2底物包被的固相，其中分子蓋度范圍從8至30個熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米，優(yōu)選地從15 至30個熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米，更優(yōu)選從20至30個熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米并且甚至優(yōu)選從20至25個熒光染料標(biāo)記磷脂酶 Al或A2底物分子/平方納米。如本文所使用，術(shù)語“分子蓋度”指每平方納米的熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子平均數(shù)或者由一個熒光染料標(biāo)記底物分子所占有的平方納米數(shù)。分子蓋度可根據(jù)下列方法計(jì)算(1)計(jì)算熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子的數(shù)量(例如通過分光光度法測定)，(2)計(jì)算固相的表面(平方納米)，然后( 確定熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子數(shù)量/固相表面的比值。發(fā)明人開展第一次計(jì)算，假定在包被相過程中固相沒有損失(在微粒的情況下)。 確定分子蓋度的該第一個方法使發(fā)明人確定8至11個熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米的分子蓋度對于開展本發(fā)明的方法是必須的。然而，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)(1)當(dāng)使用微粒作為固相時，在包被過程中微粒有損失；和⑵ 當(dāng)確定熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子數(shù)量時使用NaCl作為緩沖液導(dǎo)致低估底物分子的確切數(shù)量，這可能是因?yàn)榈孜镌诰彌_液中沉淀。為了克服此類缺點(diǎn)，發(fā)明人基于前面的方法開發(fā)了另一方法，以計(jì)算本發(fā)明固相的分子蓋度，其中-當(dāng)固相是微粒時，使用BUrker血球計(jì)數(shù)器的計(jì)數(shù)室計(jì)數(shù)微粒的起始數(shù)量和包被過程后的微粒最終數(shù)量，以便監(jiān)測包被過程中的損失并因此更精確地計(jì)算固相的表面。-當(dāng)使用分光光度計(jì)測定法測量熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子數(shù)量時，將去污劑例如非陰離子去污劑如Tween 20加入至NaCl緩沖液中，以阻止沉淀并因此更精確地計(jì)算熒光底物分子的數(shù)量。測定分子蓋度的這種更精確的方法使發(fā)明人確定，使用先前方法計(jì)算的8至11個熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米的分子蓋度相當(dāng)于所計(jì)算的8至30個熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米的分子蓋度。因此，本發(fā)明的一個目標(biāo)是以熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物包被的固相，其中分子蓋度范圍從8至30個熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米，分子蓋度通過如下確定(1)使用防止底物沉淀的NaCl緩沖液中的去污劑的分光光度測定法計(jì)算熒光染料標(biāo)記的磷脂酶Al或A2底物分子的數(shù)量，(2)計(jì)算固相表面(平方納米)，其中，當(dāng)固相是微粒時，使用Btoker血球計(jì)數(shù)器的計(jì)數(shù)室確定包被過程后的微粒數(shù)量，并且然后(3)確定熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子數(shù)量/固相表面的比率。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，固相僅以熒光染料標(biāo)記的磷脂酶Al或A2底物包被。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，固相以磷脂酶Al或A2底物的混合物包被，其中至少 99%,98%,97%,96%,95%,90%的磷脂酶Al或A2底物以熒光染料標(biāo)記。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，固相以磷脂酶Al或A2底物混合物包被，其中至少 80%的磷脂酶Al或A2底物以熒光染料標(biāo)記，只要是分子蓋度范圍從8至30個熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米即可。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，固相以磷脂酶Al或A2底物混合物包被，其中至少 70%的磷脂酶Al或A2底物以熒光染料標(biāo)記，只要是分子蓋度范圍從8至30個熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米即可。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，固相以磷脂酶Al或A2底物混合物包被，其中至少 60%的磷脂酶Al或A2底物以熒光染料標(biāo)記，只要是分子蓋度范圍從8至30個熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米即可。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，固相以磷脂酶Al或A2底物混合物包被，其中至少 50%的磷脂酶Al或A2底物以熒光染料標(biāo)記，只要是分子蓋度范圍從8至30個熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米即可。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，固相以磷脂酶Al或A2底物混合物包被，其中至少 40%的磷脂酶Al或A2底物以熒光染料標(biāo)記，只要是分子蓋度范圍從8至30個熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米即可。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，固相以磷脂酶Al或A2底物混合物包被，其中至少 30%的磷脂酶Al或A2底物以熒光染料標(biāo)記，只要是分子蓋度范圍從8至30個熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米即可。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，固相以磷脂酶Al或A2底物混合物包被，其中至少 20%的磷脂酶Al或A2底物以熒光染料標(biāo)記，只要是分子蓋度范圍從8至30個熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米即可。
如本文所使用，術(shù)語“以......包被的固相”指底物可以直接結(jié)合(例如包被、附
加、固定化、陷入或捕獲)或者可以被功能化以接受底物(間接結(jié)合)的任何支持物。底物被如此包被以致于它可以被溶液中的磷脂酶接近。固相可以由天然或合成的材料、有機(jī)或無機(jī)材料例如聚合物、樹脂、金屬或玻璃及其組合組成。根據(jù)本發(fā)明，所述標(biāo)記的底物被穩(wěn)定在固相上。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)記的底物與固相非共價(jià)連接。固相的實(shí)例包括，但不限于，微粒例如乳膠(聚苯乙烯)珠、玻璃珠、磁珠、鐵珠、金珠；或者片、基質(zhì)或者樣品容器。樣品容器的實(shí)例包括樣品孔、管、板或瓶。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)記的底物被穩(wěn)定在珠上，優(yōu)選乳膠珠。所述珠具有常規(guī)大小例如0. 5至7 μ m，優(yōu)選1-6 μ m,優(yōu)選2-5. 5 μ m,并且更優(yōu)選 3-5 μ m, 4-4. 5 μ m。根據(jù)本發(fā)明，熒光標(biāo)記的磷脂酶底物可被選自磷脂酶Al和磷脂酶A2的磷脂酶斷 m農(nóng)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述底物包含疏水部分、磷酸鹽部分和直接或通過任選連接體與疏水部分連接的熒光部分。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述底物是陰離子的、陽離子的或者中性的甘油磷脂。優(yōu)選地，所述甘油磷脂是陰離子的。所述甘油磷脂具有下式
權(quán)利要求
1.以熒光染料標(biāo)記的磷脂酶Al或A2底物包被的固相，其中分子蓋度在從8至30個熒光染料標(biāo)記磷脂酶Al或A2底物分子/nm2的范圍內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的固相，其中所述底物包括疏水部分、磷酸鹽部分和直接或者通過任選連接體連接至疏水部分的熒光部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的固相，其中所述底物是甘油磷脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的固相，其中所述底物在sn-Ι脂肪酰鏈末端和/或sn-2脂肪酰鏈末端被標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的固相，其中所述底物以苯并(d，e,f)菲或4，4_ 二氟-5，7- 二甲基-4-硼-3a，4a- 二氮雜-對稱引達(dá)省標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的固相，其中所述標(biāo)記的底物是在sn-Ι脂肪酸鏈上以供體熒光團(tuán)標(biāo)記并且在sn-2脂肪酸鏈上以受體熒光團(tuán)標(biāo)記，或者所述標(biāo)記的底物是在 sn-Ι脂肪酸鏈上以受體熒光團(tuán)標(biāo)記并且在sn-2脂肪酸鏈上以供體熒光團(tuán)標(biāo)記。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的固相，其中所述標(biāo)記的底物是在sn-Ι脂肪酸鏈上以熒光團(tuán)標(biāo)記并且在sn-2脂肪酸鏈上以猝滅劑標(biāo)記，或者所述標(biāo)記的底物是在sn-Ι脂肪酸鏈上以猝滅劑標(biāo)記并且在sn-2脂肪酸鏈上以熒光團(tuán)標(biāo)記。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的固相，其中所述固相是微粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的固相，其中所述固相是珠。
10.用于測定樣品中磷脂酶Al或A2活性的方法，所述方法包括-將樣品與根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的以熒光染料標(biāo)記的磷脂酶Al或A2底物包被的固相接觸，-檢測作為時間函數(shù)的熒光。
11.試劑盒，包含-第一容器，含有根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的以熒光染料標(biāo)記的磷脂酶Al或A2底物包被的標(biāo)記底物，-含有緩沖溶液的第二容器。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的試劑盒，還包含對照和/或校準(zhǔn)器。
13.鑒定具有PLAl或PLA2活性相關(guān)疾病或者處于具有或者發(fā)展成PLAl或PLA2活性相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)中的受試者的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求9的方法測量來自受試者的樣品中的 PLAl或PLA2酶活性。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述PLA2活性相關(guān)疾病是心血管病和/或心血管事件。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用以熒光染料標(biāo)記的磷脂酶A1或A2底物包被的固相測定樣品中磷脂酶A1或A2活性的方法，其中分子蓋度在從8至30個熒光染料標(biāo)記磷脂酶A1或A2底物分子/nm2范圍內(nèi)，以及開展所述方法的試劑盒。
文檔編號G01N33/58GK102388311SQ201080016123
公開日2012年3月21日 申請日期2010年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月10日
發(fā)明者C·西比拉, E·瓦倫廷 申請人:阿特羅瓦西公司