專利名稱：用于檢測降鈣素原的免疫測定法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于臨床診斷學領域。具體來說，本發(fā)明涉及在源自于對象體液的樣品中測定降鈣素原(PCT)水平。
背景技術：
降鈣素原(PCT)已知作為反映出局部和系統(tǒng)性細菌感染、即膿毒癥的存在和嚴重性的生物標志物(Assicot 等，Lancet 1993 ；341 :515-8 ；Muller 等，Crit Care Med 2000 ；28 :977-83 ；Harbarth 等，Am J Respir Crit Care Med 2001 ；164 :396-402 ；Becker 等，Crit Care Med 2008 ;36 :941-52 ;Becker 等，J Clin Endocrinol Metab 2004 ；89 1512-25 ;Nobre 等，Am J Respir Crit Care Med 2008 ； 177 :498-505 ;Christ_Crain 等， Lancet2004 ；363 :600-7 ；Stolz 等，Chest 2007 ；131 :9_19 ；Christ-Crain 等，Am J Respir Crit Care Med 2006 ；174 :84-93 ；Briel 等，Arch Intern Med2008 ； 168 :2000-7 ；討論 7-8)?？乖禺愋钥贵w是開發(fā)免疫測定法的關鍵工具。已經(jīng)描述了幾種針對PCT來源的肽的抗體，它們已用于在免疫測定法中檢測PCT，但是僅對很少幾種測試了它們在夾心免疫測定法中檢測天然PCT的用途(表1)。已經(jīng)開發(fā)了利用針對PCT的降鈣素和鈣抑肽部分的抗體的夾心免疫測定法，用于常規(guī)測量人類樣品中的PCT。對于與PCT濃度升高相關的病癥(不包括甲狀腺髓樣癌)、特別是細菌感染和膿毒癥來說，據(jù)信不僅全長的PCT (約13kDa)、而且PCT來源的片段也存在于患者的血液循環(huán)中。具體來說，已經(jīng)討論過就在PCT的降鈣素部分的緊上游發(fā)生的蛋白水解切割(Muller 等，Crit Care Med 2000 ；28 :977-83 ；Whang 等，J Clin Endocrinol Metab 1998 ；83 3296-301)，其將產(chǎn)生兩個片段(均為約6-7kDa)。然而，關于此的實驗證據(jù)很少已經(jīng)使用針對PCT的降鈣素部分的抗體通過親和層析從膿毒癥患者分離到循環(huán)中的PCT，并且已經(jīng)得出結論，即PCT3-116是主要的循環(huán)PCT物質(Weglohner等，Peptides2001 ；22 2099-103.)。然而，在該分析中進行了幾個選擇步驟，即只純化了具有含降鈣素表位的肽， 并且不是所有來自隨后的反相HPLC的相關級分都進行了分析。用于PCT的免疫測定法還不適合于解決PCT片段化問題，因為或是使用了包含單一抗體的競爭性測定法(Whang，等， J Clin Endocrinol Metab 1998 ;83 :3296-301)，或是使用了包含了兩種抗體的夾心免疫測定法，但所述兩種抗體的表位彼此接近位于PCT的C-端部分上而沒有覆蓋PCT的大范圍部分(Morgenthaler 等，Clin Chem2002 ；48 :788-90)。在夾心測定法中，已經(jīng)將抗PCT的最N-末端的抗體與抗PCT的鈣抑肽部分的抗體聯(lián)合使用，在膿毒癥患者樣品中檢測具有完整N-末端的PCT物質類型(DE 10 2007 009 751)。發(fā)現(xiàn)N-末端完整的PCT物質與利用抗PCT的降鈣素和鈣抑肽部分的抗體的夾心免疫測定法所檢測到的PCT免疫反應性相比，具有不同的體內動力學。此外，發(fā)現(xiàn)這些N-末端完整的PCT物質，占利用抗PCT的降鈣素和鈣抑肽部分的抗體的夾心免疫測定法所檢測到的 PCT免疫反應性的約10-20%。然而，還不清楚在PCT的最N-末端與降鈣素部分之間的哪些位點進行蛋白水解切割，能夠產(chǎn)生觀察到的不同被分析物濃度。盡管可以推測PCT1-116由 DPPIV 的作用在 N-末端切開產(chǎn)生PCT3-116(Weglohner 等，P印tides2001 ；22 :2099-103 ； Wrenger等，F(xiàn)EBS Lett 2000 ；466 155-9)，但不清楚PCT1-116是否可以另外或可選地在分子中間的另一個位點處被切開。因此，還不清楚具有大致位于PCT的降鈣素部分上游(精確來說在53位的上游)、 不包含PCT的最N-末端(即PCT1-116的第1位)的表位的抗體，與具有另一個表位、例如第53位下游的表位(例如PCT的降鈣素或鈣抑肽部分中的表位)的抗體聯(lián)合，是否可用于夾心免疫測定法中，以與使用具有PCT的降鈣素部分中的表位的抗體和具有其下游的表位的抗體、例如具有PCX的鈣抑肽部分中的表位的抗體的夾心免疫測定法相當?shù)姆绞剑瑱z測患者樣品中的天然PCT。最近已經(jīng)描述了使用重組PCT作為被分析物的這種夾心免疫測定法，但是從患者樣品回收天然PCT還沒有被評估，并且我們推測的PCT片段化的可能問題從未被討論(Kramer 等，Anal Bioanal Chem 2008 ；392 :727-36)。本發(fā)明部分是基于本發(fā)明人的令人吃驚的發(fā)現(xiàn)，即針對包含在降鈣素原的2-52 氨基酸位置中的表位的抗體，適合用于通過夾心免疫測定法測量PCT，因為PCT不在分子中間切開。發(fā)明描述基于針對PCT的抗體的新的組合，本發(fā)明提供了改進的測定方法，用于測定體液樣品中的PCT水平。因此，本發(fā)明涉及用于在源自于從對象獲得的體液的生物樣品中檢測降鈣素原或其長度為至少20個氨基酸殘基的片段的體外方法，所述方法包含下列步驟a.將所述樣品與針對降鈣素原不同表位的至少兩種抗體或其功能片段相接觸，b.定性或定量檢測所述至少兩種抗體與降鈣素原或其所述片段的結合，其中結合指示了所述樣品中降鈣素原或所述片段的存在或濃度，其中至少一種抗體或其功能片段針對包含在跨越降鈣素原的第2至52位氨基酸殘基的序列中的表位。在本發(fā)明的文本中，針對包含在跨越降鈣素原的第2至52位氨基酸殘基的序列中的表位的抗體或其功能片段，是多克隆或單克隆抗體。優(yōu)選情況下，在本發(fā)明的文本中，針對包含在跨越降鈣素原的第2至52位氨基酸殘基的序列中的表位的抗體或其功能片段是單克隆抗體。優(yōu)選情況下，另一個抗體或其功能片段針對包含在跨越降鈣素原的第53至116位氨基酸殘基的序列中的表位。在本發(fā)明的方法中使用的至少兩種抗體，優(yōu)選對相應的另一個或另一些抗體的表位不表現(xiàn)出顯著(即> 10% )的交叉反應性。針對跨越降鈣素原的第2至52位氨基酸殘基的序列中的表位的抗體，對于該表位是特異性的，并因此對跨越降鈣素原的第53至116 位氨基酸殘基的序列中的表位不表現(xiàn)出顯著的交叉反應性，反之亦然。因此，本發(fā)明的抗體對它們在PCT中的表位是特異性的，并且對該肽中的其他表位、特別是不交疊表位不表現(xiàn)出顯著的交叉反應性。在本文中，優(yōu)選情況下，包含在跨越降鈣素原的第2至52位氨基酸殘基的序列中的表位，是包含在跨越降鈣素原的第16至40位氨基酸殘基的序列中的表位。更優(yōu)選情況下，包含在跨越降鈣素原的第16至40位氨基酸殘基的序列中的表位選自包含在跨越降鈣素原的第21至40位氨基酸殘基的序列中的表位、包含在跨越降鈣素原的第16至35位氨基酸殘基的序列中的表位和包含在跨越降鈣素原的第25至37位氨基酸殘基的序列中的表位。包含在跨越降鈣素原的第53至116位氨基酸殘基的序列中的表位，優(yōu)選是包含在跨越降鈣素原的第96至116位氨基酸殘基的序列中的表位或包含在跨越降鈣素原的第60 至91位氨基酸殘基的序列中的表位。在本發(fā)明的方法的具體實施方案中，對樣品中降鈣素原或其片段的濃度進行定量。優(yōu)選情況下，本發(fā)明的對象是人類或非人類動物，優(yōu)選為哺乳動物，最優(yōu)選情況下對象是人類。在本發(fā)明的上下文中，針對包含在跨越降鈣素原的第53至116位氨基酸殘基的序列中的表位的抗體或其功能片段，是多克隆或單克隆抗體。優(yōu)選情況下，針對包含在跨越降鈣素原的第53至116位氨基酸殘基的序列中的表位的抗體或其功能片段是單克隆抗體。針對包含在跨越降鈣素原的第2至52位氨基酸殘基的序列中的表位的抗體或其功能片段，優(yōu)選為IgG或源自于IgG。同樣地，針對包含在跨越降鈣素原的第53至116位氨基酸殘基的序列中的表位的抗體或其功能片段，優(yōu)選為IgG或源自于IgG。在本發(fā)明的方法的上下文中，體液優(yōu)選自血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、唾液、痰液和胸膜腔積液。在本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施方案中，至少兩種抗體或其功能片段中的至少一種被固定化在固相表面上。更優(yōu)選情況下，至少兩種抗體或其功能片段中的一種被固定化在固相表面上。優(yōu)選情況下，另一種或另一些抗體中的至少一種被標記，優(yōu)選通過共價連接化學發(fā)光或熒光染料進行標記。在方法的具體實施方案中，針對包含在跨越降鈣素原的第2至52位氨基酸殘基的序列中的表位的抗體或其功能片段被固定化在固相表面上。在另一個具體實施方案中，針對包含在跨越降鈣素原的第53至116位氨基酸殘基的序列中的表位的抗體或其功能片段被固定化在固相表面上。本發(fā)明還涉及針對包含在跨越降鈣素原的第16至40位氨基酸殘基的序列中的表位的抗體或其功能片段。優(yōu)選情況下，抗體或其功能片段所針對的表位選自包含在跨越降鈣素原的第21 至40位氨基酸殘基的序列中的表位、包含在跨越降鈣素原的第16至35位氨基酸殘基的序列中的表位和包含在跨越降鈣素原的第25至37位氨基酸殘基的序列中的表位。優(yōu)選情況下，抗體是單克隆抗體。優(yōu)選情況下，本發(fā)明的抗體可以通過遺傳免疫接種來生產(chǎn)。簡單來說，可以例如基本上按照Costagliola等，J Immunol 1998 ； 160 1458-65中提出的步驟，通過遺傳免疫接種來生產(chǎn)針對PCT的單克隆抗體?？梢酝ㄟ^標準程序將PCT編碼序列克隆到載體中。然后可以用所述載體注射動物例如小鼠?？梢栽诶?和6周后重復注射。在例如18周后處死動物。然后將被處死動物的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合以產(chǎn)生雜交瘤細胞系，然后篩選所述雜交瘤細胞分泌與固定化重組人類PCT結合的抗體的能力。 本發(fā)明的針對包含在跨越降鈣素原的第16至40位氨基酸殘基的序列中的表位的單克隆抗體，優(yōu)選情況下可以由保藏在DSMZ的登記號為DSM ACC2993.DSM AC(^996或DSM ACC2997的雜交瘤細胞系來生產(chǎn)。這些細胞系產(chǎn)生本發(fā)明的針對包含在跨越降鈣素原的第 16至40位氨基酸殘基的序列中的表位的特定單克隆抗體。生產(chǎn)單克隆抗體FX7A7的雜交瘤細胞系已經(jīng)于2009年6月4日保藏在德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)，登記號為DSM ACC2997。生產(chǎn)單克隆抗體FW5H6的雜交瘤細胞系已經(jīng)于2009年6月4日保藏在德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)，登記號為DSM ACC2996。生產(chǎn)單克隆抗體FX1G5的雜交瘤細胞系已經(jīng)于2009年4月四日保藏在德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)， 登記號為DSMAC(^993。所有雜交瘤細胞系按照上文所述的原理產(chǎn)生，并在實施例1中更詳細地描述。另一方面，本發(fā)明涉及試劑盒，所述試劑盒至少包含a.第一種抗體或其功能片段，其針對包含在跨越降鈣素原的第2至52位氨基酸殘基的序列中的表位，以及b.第二種抗體或其功能片段，其針對包含在跨越降鈣素原的第53至116位氨基酸殘基的序列中的表位。優(yōu)選情況下，試劑盒的第一種抗體針對包含在跨越降鈣素原的第16至40位氨基酸殘基的序列中的表位，優(yōu)選針對選自包含在跨越降鈣素原的第21至40位氨基酸殘基的序列中的表位、包含在跨越降鈣素原的第16至35位氨基酸殘基的序列中的表位和包含在跨越降鈣素原的第25至37位氨基酸殘基的序列中的表位。優(yōu)選情況下，第一種抗體是單克隆抗體。優(yōu)選情況下，第二種抗體也是單克隆抗體。在試劑盒的優(yōu)選實施方案中，第二種抗體針對包含在跨越降鈣素原的第60至91 位氨基酸殘基的序列中的表位或針對包含在跨越降鈣素原的第96至116位氨基酸殘基的序列中的表位.本發(fā)明還涉及以夾心免疫測定法格式使用本發(fā)明的試劑盒，用于檢測或定量來自體液的生物樣品中的降鈣素原或其片段。這樣的片段至少包含跨越兩種抗體所針對的兩個表位的序列。此外，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的方法、本發(fā)明的抗體或本發(fā)明的試劑盒，用于在來自體液的生物樣品中確定降鈣素原或其片段的存在或不存在，或用于降鈣素原或其片段的定量。優(yōu)選情況下，方法、抗體和試劑盒用于與降鈣素原水平升高相關的疾病或病癥的診斷、預后、風險分層、療法監(jiān)測、療法指導或治療措施的應用分層。疾病或病癥優(yōu)選選自局部細菌感染(特別是氣管和肺中)、膿毒癥、重癥膿毒癥、 膿毒性休克。疾病或病癥還可以選自非感染性疾病包括但不限于心血管疾病(急性冠狀動脈綜合征、心力衰竭、冠狀動脈疾病、動脈粥樣硬化、中風)、癌癥、糖尿病、慢性胃腸疾病、慢性腎病、高血壓、骨科疾病包括骨質疏松癥和神經(jīng)變性疾病包括阿茲海默氏病。上面提到的所有疾病或病癥可以伴有或不伴有一種或多種并發(fā)疾病。本發(fā)明的抗體對它們的相應表位的親和性，優(yōu)選在IO8至IO11M4的范圍內，優(yōu)選大于 κΛτ1。術語“抗體”一般包含單克隆和多克隆抗體及其結合片段特別是Fc片段和所謂的“單鏈抗體”(Bird R.E.等，(1988) Science 242 :423-6)、嵌合抗體、人源化抗體特別是CDR 移植抗體，以及雙鏈或四鏈抗體(Holliger P.等，(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90 6444-8)。還包括通過包括例如噬菌體展示等技術篩選的與樣品中包含的目標分子特異性結合的免疫球蛋白樣蛋白。在本發(fā)明的上下文中，“特異性結合”是指針對目標分子或其片段產(chǎn)生的抗體。如果抗體對目標分子或其上面提到的片段的親和性，與針對含有目標分子的樣品中包含的其他分子的親和性相比，優(yōu)選高至少50倍、更優(yōu)選高100倍、最優(yōu)選高至少 1000倍，則該抗體被認為是特異性的。如何制造抗體和選擇具有給定特異性的抗體，在本技術領域中是公知的。正如上文中所述，單克隆抗體是優(yōu)選的。本發(fā)明的優(yōu)選測定法和檢測方法包括各種格式的免疫測定法，例如放射免疫測定法(RIA)、化學發(fā)光和熒光免疫測定法、酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)、基于Luminex的珠子陣列、蛋白質微陣列測定法，以及快速檢測格式例如免疫層析條樣試驗。測定法可以是均相或非均相測定法、競爭和非競爭性夾心測定法。在本發(fā)明的使用兩種抗體的特別優(yōu)選的實施方案中，測定法采用夾心測定法形式，其是非競爭性免疫測定法，其中待檢測和/或定量的PCT或其片段與第一抗體并與第二抗體結合。第一抗體可以結合到固相例如珠子、孔或其他容器的表面、芯片或條上，并且第二抗體是例如用染料、放射性同位素或反應性或催化活性部分標記的抗體。然后通過適合的方法測量與被分析物結合的標記抗體的量?！皧A心測定法”所涉及的通用組合物和步驟是已確立的，并為專業(yè)技術人員所公知。(《免疫測定手冊》(The Immunoassay Handbook)，David Wild主編，Elsevier LTD, Oxford ；第三版 Q005 年 5 月)，ISBN-13 :978-0080445267 ；Hultschig C等，Curr Opin Chem Biol. 2006 Feb ； 10(1) :4-10. PMID :16376134)，在此引為參考。在特別優(yōu)選實施方案中，測定方法包含兩種本發(fā)明的抗體，其都作為分散相存在于液體反應混合物中，其中第一種標記組分附著在第一種抗體上，其中所述第一種標記組分是基于熒光或化學發(fā)光-淬滅或擴增的標記系統(tǒng)的一部分，并且所述標記系統(tǒng)的第二種標記組分附著于第二種抗體上，使得當兩種抗體與被分析物結合后產(chǎn)生可測量信號，允許檢測在包含樣品的溶液中形成的夾心復合物。在更優(yōu)選情況下，所述標記系統(tǒng)包含稀土穴狀化合物或稀土螯合物與熒光染料或化學發(fā)光染料、特別是花青類型的染料的組合。在本發(fā)明的情形中，基于熒光的測定方法包含使用染料，所述染料可以例如選自 FAM(5-或6-羧基熒光素)、VIC、NED、熒光素、熒光素異硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、 花青染料例如CY3、CY5、CY3. 5、CY5. 5、Cy7、占噸、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯熒光素 (HEX)、TET、6-羧基-4，，5，- 二氯-2，，7，- 二甲氧基熒光素(J0E)、N，N，N' , N'-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)、5_羧基羅丹明_6G(R6G5)、6_羧基羅丹明-6G(RG6)、羅丹明、羅丹明綠、羅丹明紅、羅丹明110、BODIPY染料例如BODIPY TMR、俄勒岡綠、香豆素類例如傘形酮、苯并亞胺類例如Hoechst 33258 ；菲啶類例如德克薩斯紅、 雅吉瓦黃、Alexa Fluor、PET、溴化乙錠、吖啶類染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、嚇啉染料、聚甲炔染料等。在本發(fā)明的情形中，基于化學發(fā)光的測定方法包含使用基于化學發(fā)光材料的物理原理的染料，所述原理描述在Kirk-Othmer的《化學技術百科全書》(Encyclopedia of chemical technology) H四片反，J. I. KroschwitzΜ. Howe-GrantJohn Wiley
8& Sons，1993，vol. 15，p. 518-562中，在此引為參考，包括在551-562頁中的引用文獻。優(yōu)選的化學發(fā)光染料是吖啶酯。最后，本發(fā)明還涉及保藏在DSMZ，登記號為DSM ACC2993、DSM AC(^996和DSM ACC2997的雜交瘤細胞系。這些雜交瘤細胞系產(chǎn)生本發(fā)明的優(yōu)選抗體，其針對PCT的N-末端表位、特別是21至40和第25至37位的表位，并且如實施例1中所述來產(chǎn)生。SMSEQ ID NO :1 (PCT 的氨基酸序列)1 APFRSALESS PADPATLSED EARLLLAALV QDYVQMKASE LEQEQEREGS51 SLDSPRSKRC GNLSTCMLGT YTQDFNKFHT FPQTAIGVGA PGKKRDMSSD101 LERDHRPHVS MPQNAN附圖描述

圖1 用于與現(xiàn)有測定法(A禾口 B 分另Ij為B · R · A · H · M · S PCT LIA和 B · R · A · H · M · S PCT靈敏LIA)進行比較的測定法(C、D和E)的示意圖。圖示了 PCT及其降鈣素和鈣抑肽部分，并顯示了抗體及其表位。A和B —種抗體針對PCT的降鈣素部分， 其他抗體針對鈣抑肽部分；C 其中一種抗體針對跨越PCT的21-40位氨基酸殘基的序列中的表位，其他抗體針對PCT的鈣抑肽部分的測定法。D、E 其中一種抗體針對跨越PCT的第 21-40位氨基酸殘基的序列中的表位，其他抗體針對PCT的降鈣素部分的測定法。圖2 按大小分級的含PCT血清的PCT免疫反應性分布圖。級分在測定法A(命名如圖1)中進行測量，并將測量值與每次分級操作中每次測定的最大測量值相關聯(lián)。顯示了平均值+標準誤差(SEM)。圖3 按大小分級的含PCT血清的PCT免疫反應性分布圖。級分在測定法C和D (分別為圖A和B;命名如圖1)中進行測量，并將測量值與每次分級操作中每次測定的最大測量值相關聯(lián)。顯示了平均值+標準誤差(SEM)。圖4 三種PCT夾心免疫測定法的劑量響應曲線。測定體系溫育30分鐘(圖A) 或 2 小時(圖 B)。PCT LIA 禾口 PCT LIA sens 分另U對應于 B · R · A · H · M · S PCT LIA 禾口 B.R.A.H.M.S PCT靈敏LIA (在圖1中命名為A和B)。FXlG5/anti_Calc.表示測定法
E0圖5 降鈣素原(PCT)的氨基酸序列(SEQ ID NO 1) 實施例實施例1 材料和方法A.單克隆抗體的產(chǎn)生針對PCT的單克隆抗體原則上按照已描述的程序通過遺傳免疫接種來生產(chǎn) (Costagliola等，J Immunol 1998 ； 160 :1458-65)。簡單來說，通過標準程序，將PCT編碼序列克隆到載體 pcDNAIII(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中。將在 25%蔗糖中的 IOOmg pcDNAIII-PCT在第0日注射到BALB/c小鼠的前脛骨肌中。在3和6周后重復注射。在最初免疫接種后8和11周以及在處死時從眼后毛細血管獲得血樣，所述處死是在18周后，并在同時取出脾臟和甲狀腺。將脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細胞系。篩選細胞系分泌與固定化的重組人類PCTanVivo GmbH, Hennigsdorf，Germany)結合的抗體的能力。使用這種方法，產(chǎn)生了分泌單克隆抗體FX7A7(由2009年6月4日保藏在DSMZ的登記號為DSM ACC2997的雜交瘤細胞系產(chǎn)生)、FW5H6 (由2009年6月4日保藏在DSMZ的登記號為DSM ACC2996的雜交瘤細胞系產(chǎn)生)和FX1G5 (由2009年4月四日保藏在DSMZ的登記號為DSM ACC2993的雜交瘤細胞系產(chǎn)生)的細胞系。B.表位作圖三個單克隆抗體FX7A7、FW5H6和FX1G5的PCT中表位的作圖，通過標準程序在肽微陣列上進行(JPT GmbH，Berl in，Germany)。肽微陣列由玻璃表面上的74個肽構成，它們顯示為交疊的肽掃描(格式13/11 :53個肽；格式20/15 :21個肽)并因此覆蓋了整個PCT序列。將微陣列用阻斷緩沖液(Pierce，Superblock ；室溫下2小時)預處理，然后用pH 8的 TBS緩沖液和水清洗(各三次)。將每個與處理過的微陣列用Axon Genepix 4000B掃描儀進行掃描用作背景對照(不能檢測到信號)。將各個微陣列與抗體在測定緩沖液中溫育(終濃度為60 μ g/mL，在Pierce Superblock緩沖液中；總測定體積為350 μ 1，溫育時間3h)。將微陣列用PH 8的TBS緩沖液清洗，然后與熒光標記的第二抗體溫育(抗小鼠-Dylight-647 抗體；Pierce 31015，1 μ g/mL，溫育時間45min)。與所述試驗平行地進行與熒光標記的第二抗體(抗小鼠-Dylight-647抗體；Pierce 31015，1 μ g/mL，溫育時間45min)的對照溫育。使用Axon Genepix 4000B掃描儀，使用適合的波長設置對微陣列進行掃描。使用SPOT 識別軟件包ArrayPro進行數(shù)據(jù)處理。使用每個微陣列圖像上3個相同子陣列的信號強度 (對局部背景進行了校正)的平均值進行數(shù)據(jù)評估。C.免疫測定法采取化學發(fā)光/包被管格式的夾心免疫測定法如下設置測定方法A 使用了用于PCT的可商購夾心測定體系(BRAHMS PCT LIA sensitive)，其使用一種針對PCT的鈣抑肽部分的抗體作為固相，以及一種針對PCT的降鈣素部分的抗體作為標記抗體(BRAHMS AG, Hermigsdorf，德國)。使用各種濃度的重組PCT作為標準品。為了與測定方法E(參見下文)進行比較，采取了對測定方法E所描述的溫育條件；即使用50 μ 1 樣品和200 μ 1標記抗體溶液，并在試管中在一步反應中溫育30分鐘或2小時。測定方法B:使用了用于PCT的可商購夾心測定體系(BRAHMS PCT LIA)，其使用一種針對PCT 的鈣抑肽部分的抗體作為固相，以及一種針對PCT的降鈣素部分的單克隆抗體作為標記抗體(BRAHMS AG, Hermigsdorf，德國)。使用各種濃度的重組PCT作為標準品。為了與測定方法E(參見下文)進行比較，采取了對測定方法E所描述的溫育條件；即使用50 μ 1樣品和200 μ 1標記抗體溶液，并在試管中在一步反應中溫育30分鐘或2小時。對于其他測定方法來說，測定組分如下產(chǎn)生抗體的標記抗體FX1G5的標記通過標準程序(EP 1488209，EP 1738178)來進行將純化抗體的濃度調整至lg/L，并通過與化學發(fā)光標記物MACN-吖啶-NHS-酯(lg/L ；InVent GmbH, Hermigsdorf，德國)以1 5的摩爾比在室溫下溫育20分鐘來標記。通過加入1/10體積的50mmol/L甘氨酸，在室溫下放置10分鐘來終止反應。在NAP-5柱(GE Healthcare,Freiburg，德國)和Bio-Sil SEC-400-5 HPLC柱(BIO-RAD)上通過孔徑排阻層析將標記過的抗體與游離標記物分離開?？贵w的包被針對PCT的降鈣素部分的單克隆抗體(BRAHMS AG，Hennigsdorf，德國)的包被，通過標準程序(EP 1488209，EP 1738178)來進行將聚苯乙烯startube (Greiner)用純化的抗體(每個管，2 μ g 抗體在 300 μ 1 10mmol/L Tris, 1 OOmmo 1/L NaCl，pH 7· 8 中)在 22°C 下包被過夜。然后將管用含有30g/L Karion FP(Merck)、5g/L無蛋白酶的牛血清白蛋白 (Sigma)的lOmmol/L磷酸鈉(pH 6.5)阻斷，并冷凍干燥。對于這些組分，建立了下列測定方法測定方法C 用抗鈣抑肽抗體包被的管和標準品(重組PCT)從B. R. Α. H. M. SPCT LIA sensitive測定體系(B. R. Α. H. M. S AG, Hennigsdorf，德國)獲得。將MACN標記的抗體 FX1G5用作標記抗體。測定緩沖液是300mmol/L磷酸鉀，pH 7. 0，IOOmmol/L NaCl, IOmmol/L EDTA，0. 9g/L疊氮化鈉，5g/L無蛋白酶的牛血清白蛋白(Sigma)，lg/L非特異性牛IgG，lg/L 非特異性綿羊IgG，lg/L非特異性小鼠IgG，并且每200 μ 1含有MlO6個相對光單位(RLU) 的MACN標記抗體。將100 μ 1標準品或樣品和200 μ 1含有MACN標記抗體的測定緩沖液吸取到包被的管中。將管在22°C下，在攪拌下溫育2小時。然后，將管用ImLB. R. Α. H. M. S清洗緩沖液(B. R. Α. H. M. S AG, Hennigsdorf，德國)洗滌 5 次，并使用 LB952T 照度計(Berthold) 對每個管的結合的化學發(fā)光測量1秒。使用軟件MultiCalc (Spline Fit)計算樣品濃度。測定方法D 使用抗降鈣素抗體包被的管。標準品(重組PCT)從B. R. Α. H. M. S PCT LIA sensitive測定體系(B. R. Α. H. M. S AG, Hennigsdorf，德國)獲得。將MACN標記的抗體 FX1G5用作標記抗體。測定緩沖液是300mmol/L磷酸鉀，pH 7. 0，IOOmmol/L NaCl, IOmmol/L EDTA，0. 9g/L疊氮化鈉，5g/L無蛋白酶的牛血清白蛋白(Sigma)，lg/L非特異性牛IgG，lg/L 非特異性綿羊IgG，lg/L非特異性小鼠IgG，并且每200 μ 1含有MlO6個相對光單位(RLU) 的MACN標記抗體。將100 μ 1標準品或樣品和200 μ 1含有MACN標記抗體的測定緩沖液吸取到包被的管中。將管在22°C下，在攪拌下溫育2小時。然后，將管用ImLB. R. Α. H. M. S清洗緩沖液(B. R. Α. H. M. S AG，Hennigsdorf，德國)洗滌 5 次，并使用 LB952T 照度計(Berthold) 對每個管的結合的化學發(fā)光測量1秒。使用軟件MultiCalc (Spline Fit)計算樣品濃度。測定方法E 使用FX1G5抗體包被的管。標準品(重組PCT)和標記的多克隆抗降鈣素抗體從 B. R. Α. H. M. S PCT LIA sensitive 測定體系(B. R. Α. H. M. S AG, Hennigsdorf，德國)獲得。 將50 μ 1標準品或樣品和200 μ 1含有MACN標記抗體的測定緩沖液吸取到包被的管中。將管在22°C下，在攪拌下溫育30分鐘或2小時。然后，將管用ImLB. R. Α. H. M. S清洗緩沖液 (B. R. Α. H. M. S AG, Hennigsdorf，德國)洗滌 5 次，并使用 LB952T 照度計(Berthold)對每個管的結合的化學發(fā)光測量1秒。D.孔徑排阻層析使用Bio-Sil SEC-125-5 HPLC柱(BIO-RAD)對來自9個具有高PCT濃度的患者 (包括患有膿毒癥的患者)的血漿樣品進行分級。樣品體積是100 μ 1。運行緩沖液是PH 7.4的PBS。流速為0.8mL/min。收集0. 4mL級分在測定方法A、C、D中測量。使用下列肽作為校準物重組 PCT (MW =約 13kDa ；InVivo GmbH，Hennigsdorf，德國)，pr印roADM 45-92 (序列為 ELRMSS SYPTGLADVK AGP AQTLIRPQDMKGASRSP EDSSPDAARI RV ；MW = 5. IkDaJPT GmbH, Berlin，德國)，維生素 B12 (MW 1. 3kDa)。將重組 PCT 和 pr印roADM 45-92 溶解在從 BRAHMS PCT LIA sensitive 和 BRAHMS MR-proADM LIA 測定體系(BRAHMS AG，Hennigsdorf，德國) 獲得的標準基質中，并使用這些測定體系測定它們的孔徑分級HPLC洗脫情況。維生素B12 在運行緩沖液中洗脫并進行層析；記錄^Onm處的吸收。E.樣品測量在測定方法A、C、D中測量了患有局部細菌感染、膿毒癥、膿毒性休克的患者的30 個血清樣品。結果單克隆抗體使用整個PCT編碼序列通過遺傳免疫接種產(chǎn)生了三種小鼠單克隆抗體。對于所有三種抗體來說，表位作圖顯示出相似、盡管不一致的結果(表幻?？贵wFW5H6和FX7A7顯示出與肽EARLLLAALVQDYVQMKASE (PCT中的21-40位)的最強結合，而對于抗體FX1G5來說，觀察到的最強結合是在源自于前一個肽上，即LLAALVQDYVQMW25-37位)。在這些區(qū)域之外， 對于三種抗體來說沒有鑒定到PCT序列中的其他明顯結合位點。這里使用的免疫接種方法僅僅是一個實例。可以可選地用于產(chǎn)生針對所述區(qū)域中的表位、更通常為53位上游的表位的抗體的其他方法是公知的，例如可以使用與載體蛋白偶聯(lián)的化學合成的肽作為抗原?？讖脚抛鑼游鐾ㄟ^使用孔徑排阻HPLC對來自具有高天然PCT濃度的患者(包括膿毒癥患者) 的血清樣品進行分級，來評估天然PCT的表觀分子量和使用各種夾心免疫測定法的可檢測性。無論級分的測量是使用測定方法A、c還是D，基本上觀察到相同的免疫反應性分布情況 (圖1)天然PCT與重組PCT(13kDa)的洗脫時間不能區(qū)分(圖2和3)。事實上，使用三種測定方法中的任一種，沒有檢測到對應于分子量小于13kDa的PCT免疫反應性。尤其是，通過測定方法A沒有檢測到對應于分子量約為6kDa的PCT免疫反應性；而如果當前技術的假設是正確的，即PCT能夠在PCT的降鈣素部分的緊上游切開，這種現(xiàn)象預計將會出現(xiàn)。這些結果證實，與當前技術的推測相反，在具有高PCT濃度(不包含甲狀腺髓樣瘤)的患者中， 沒有檢測到在分子中央切開的PCT，并且A、C或D型夾心免疫測定法檢測相同的抗原。樣品測量在測定方法A、C、D中測量了患有局部細菌感染、膿毒癥、膿毒性休克的患者的30 個血清樣品。得出如下的Spearman相關系數(shù)測定法A比C :r = 0. 9893 ；測定法A比D :r =0. 9844。這些源自于患有各種嚴重性程度感染的患者的大量樣品的測量值的理想的相關系數(shù)，清楚地證實了通過孔徑排阻層析所獲得的結果，使得人們不得不得出下述通用結論， 即當高于正常時(不包含甲狀腺髓樣瘤)，PCT不在分子的中央被切開。測定方法的性質在使用抗降鈣素抗體作為第二抗體的夾心測定法(測定方法E)中，對本發(fā)明描述的抗體之一、即具有對應于PCT的第25-37位的表位的FX1G5的使用進行了分析，并與使用相同檢測技術(包被管/化學發(fā)光標記)的現(xiàn)有技術的PCT測定方法、即BRAHMS PCT LIAsensitive (測定方法A)和BRAHMS PCT LIA(測定方法B)進行了比較。令人吃驚的是，測定方法E與兩種現(xiàn)有測定方法相比，表現(xiàn)出明顯更加動態(tài)的劑量響應曲線，而不依賴于溫育時間(圖4)。表1 所描述的抗PCT抗體及其在免疫測定法中的應用
權利要求
1.一種用于在源自于從對象獲得的體液的生物樣品中檢測降鈣素原或其長度為至少 20個氨基酸殘基的片段的體外方法，所述方法包含下列步驟a.將所述樣品與針對降鈣素原不同表位的至少兩種抗體或其功能片段相接觸，以及b.定性或定量檢測所述至少兩種抗體與降鈣素原或其所述片段的結合，其中結合指示所述樣品中降鈣素原或所述片段的存在或濃度，其中至少一種抗體或其功能片段針對包含在跨越降鈣素原的第2至52位氨基酸殘基的序列中的表位。
2.權利要求1的方法，其中針對包含在跨越降鈣素原的第2至52位氨基酸殘基的序列中的表位的抗體或其功能片段是單克隆抗體。
3.權利要求1或2的方法，其中一種其它抗體或其功能片段針對包含在跨越降鈣素原的第53至116位氨基酸殘基的序列中的表位。
4.權利要求1至3任一項的方法，其中包含在跨越降鈣素原的第2至52位氨基酸殘基的序列中的表位，是包含在跨越降鈣素原的第16至40位氨基酸殘基的序列中的表位。
5.權利要求4的方法，其中包含在跨越降鈣素原的第16至40位氨基酸殘基的序列中的表位選自包含在跨越降鈣素原的第21至40位氨基酸殘基的序列中的表位、包含在跨越降鈣素原的第16至35位氨基酸殘基的序列中的表位和包含在跨越降鈣素原的第25至37 位氨基酸殘基的序列中的表位。
6.權利要求3至5任一項的方法，其中包含在跨越降鈣素原的第53至116位氨基酸殘基的序列中的表位是包含在跨越降鈣素原的第96至116位氨基酸殘基的序列中的表位或包含在跨越降鈣素原的第60至91位氨基酸殘基的序列中的表位。
7.權利要求1至6的方法，其中針對包含在跨越降鈣素原的第53至116位氨基酸殘基的序列中的表位的抗體或其功能片段，是單克隆抗體。
8.一種抗體或其功能片段，其針對包含在跨越降鈣素原的第16至40位氨基酸殘基的序列中的表位。
9.權利要求8的抗體或其功能片段，其中抗體或其功能片段所針對的表位選自包含在跨越降鈣素原的第21至40位氨基酸殘基的序列中的表位、包含在跨越降鈣素原的第16至 35位氨基酸殘基的序列中的表位和包含在跨越降鈣素原的第25至37位氨基酸殘基的序列中的表位。
10.權利要求8和9的抗體，其中抗體是單克隆抗體。
11.權利要求10的抗體，其中抗體由保藏在DSMZ的登記號為DSMAC(^993、DSMACC2996 或DSM ACC2997的雜交瘤細胞系產(chǎn)生。
12.—種試劑盒，其至少包含a.針對包含在跨越降鈣素原的第2至52位氨基酸殘基的序列中的表位的第一種抗體或其功能片段，以及b.針對包含在跨越降鈣素原的第53至116位氨基酸殘基的序列中的表位的第二種抗體或其功能片段。
13.權利要求12的試劑盒，其中第一種抗體針對包含在跨越降鈣素原的第16至40位氨基酸殘基的序列中的表位，優(yōu)選其針對的表位選自包含在跨越降鈣素原的第21至40位氨基酸殘基的序列中的表位、包含在跨越降鈣素原的第16至35位氨基酸殘基的序列中的表位和包含在跨越降鈣素原的第25至37位氨基酸殘基的序列中的表位。
14.權利要求12至13任一項的試劑盒，其中第二種抗體針對包含在跨越降鈣素原的第60至91位氨基酸殘基的序列中的表位或針對包含在跨越降鈣素原的第96至116位氨基酸殘基的序列中的表位。
15.權利要求12至14任一項的試劑盒在夾心免疫測定法中的應用，所述夾心免疫測定法用于在來自體液的生物樣品中檢測和或定量降鈣素原。
16.權利要求1至7任一項的方法、權利要求8或11的抗體或權利要求12至14任一項的試劑盒在來自體液的生物樣品中確定降鈣素原或其片段的存在或不存在或用于降鈣素原或其片段的定量中的應用。
17.權利要求16的應用，用于與降鈣素原水平升高相關的疾病或病癥的診斷、預后、風險分層、療法監(jiān)測、療法指導或治療措施的應用分層。
18.權利要求17的應用，其中疾病或病癥選自局部細菌感染、膿毒癥、重癥膿毒癥、膿毒性休克、包括心血管疾病(急性冠狀動脈綜合征、心力衰竭、冠狀動脈疾病、動脈粥樣硬化、中風)的非感染性疾病、癌癥、糖尿病、慢性胃腸疾病、慢性腎病、高血壓、包括骨質疏松癥的骨科疾病和包括阿茲海默氏病的神經(jīng)變性疾病。
19.雜交瘤細胞系，其保藏在DSMZ，登記號為DSMACC2993, DSM AC(^996或DSM ACC29970
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在源自于從對象獲得的體液的生物樣品中檢測降鈣素原或其長度為至少20個氨基酸殘基的片段的體外方法，所述方法包含下列步驟(i)將所述樣品與針對降鈣素原不同表位的至少兩種抗體或其功能片段相接觸，以及(ii)定性或定量檢測所述至少兩種抗體與降鈣素原或其所述片段的結合，其中結合指示了所述樣品中降鈣素原或所述片段的存在或濃度，其中至少一種抗體或其功能片段針對包含在跨越降鈣素原的第2至52位氨基酸殘基的序列中的表位。本發(fā)明還涉及針對降鈣素原的N-末端表位的抗體以及包含針對PCT的抗體的試劑盒。
文檔編號G01N33/74GK102395887SQ201080016842
公開日2012年3月28日 申請日期2010年4月27日 優(yōu)先權日2009年4月28日
發(fā)明者約阿希姆·斯特魯克 申請人:B.R.A.H.M.S 有限公司